이 작품은 BS하기 위해 미국 - 이스라엘 BSF로부터의 보조금에 의해 자금을 지원하고 EDSBS는 분자 유전학의 힐과 세실 루이스 교수의 의자 현직있다.

주 : 동물 대상으로 한 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1 샘플 준비 <ol><li> 췌장 선포 세포의 분리 <ol><li> 시작하기 전에 신선한 크렙스 - 링거 중탄산 HEPES (KRBH) 매체의 300 ML를 준비합니다. 140 밀리미터의 NaCl, 4.7 밀리미터의 KCl을 혼합 1.16 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘이, 11 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 (STI) (재 부유 매체)를 추가한다. 매체 콜라게나 제 (~ 0.75 ㎎ / ㎖) (소화 매체)와 보충 재 부유 10 ㎖ - 5를 준비합니다. </li><li> ~ 30 분 KRB 매체에 산소. 버블 링을 방지하기 위해 산소 후 BSA를 추가합니다. 37 ° C에서 재 부상 및 소화 매체를 가져와. 주 : 매체를 산소로하는 세포 사망률을 감소시키고 분비에 대한 응답 성을 향상시킨다. 산소의 효과는 최소한 6 시간 동안 명백하다. </li><l난&gt; 기관 동물 관리 지침에 따라, 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 마우스를 희생. 그 뒷면에있는 희생 동물을 놓고 해부 패드에 연결하고 에탄올로 복부 표면을 청소합니다. 참고 : 오염을 방지 절개 도구 및 사용 전에 KRBH 매체에 사용되는 물을 고압 증기 멸균하기 위하여. 0.2 μm의 필터를 통해 KRBH 매체를 필터링합니다. 이전에는 췌장 절제술로 70 % 에탄올로 해부 도구를 헹구고 깨끗한 벤치에 절개를 실시하고 있습니다. 레벨 3 생물 안전 캐비닛의 바이러스 감염을 수행하십시오. O / N 배양 배지에 항생제를 추가 (4 절 참조). </li></ol></li><li> 쥐의 췌장 절제 <ol><li> 절개 널리 복부 피부와 피하 층을 포함한다. 간, 위, 대장, 췌장, 비장 (그림 1) 확인합니다. 참고 : 다음 단계에서 조심스럽게 췌장 조직을 처리하고 과도한 기계적 그렇게해야을 적용하지 않도록전자 조직 및 세포 죽음의 자동 소화를 방지합니다. </li><li> 이 무딘 집게를 사용하여 소장을 잡아 당깁니다. 위장으로부터 출구 근처 소장 근위 단부에서 시작. 소장에서 췌장을 분리하고 체강 내에서 유지됩니다. 일단 대장에 도달, 핑크 / 화이트 결합 조직을 알 수 있습니다. 췌장와 혼동하지 마십시오. </li><li> 지방이나 결합 조직을 수집하지 않고 가능한 한 많은 췌장 조직을 취소합니다. 비장과 위장에서 그것을 분리 및 복부 혈관 그 아래 (그림 1A-C)를 절단하여 췌장을 제거합니다. NOTE : 단일 동물 췌장 선포 세포에서의 수율이 높기 때문에, 하나가 다른 조직을 수집하는 것을 방지하기 위해 모든 췌장 조직 수집을 삼가 할 수있다. </li></ol></li><li> 콜라게나 소화 <ol><li> 췌장 37 ° C로 가열 재 부상 매체에 몇 번 헹구고 비 췌장의 나머지 부분을 제거조직. 20 ml의 신틸레이션 바이알에 예열 된 소화 매체 ~ 5 ㎖ 중의 췌장 담가. 1-3밀리미터의 조각 췌장을 말하다. (최적 ~ 100 rpm으로 교반하면서) 가열 된 물을 욕조에 넣습니다. 소화를 촉진하기 위해, 소화 조직 상하마다 몇 분 피펫. NOTE : 콜라게나 제 소화 기간은 주로 콜라게나 제 농도 및 조직에 적용되는 기계적 힘의 크기에 의존한다. 30 셀 - (10)의 선포 세포의 결과로 5 분 - 약 15 분 동안 825 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 사용 및 2mm와 5 ㎖의 폴리스티렌 피펫 조직을 피펫 팅은 매 3 오리피스. 소화 후, 현탁액을 조직 보이는 조각을 포함 혼탁이 나타납니다. 콜라게나 효율 다른 상업적 유형과 많은 사이에서 변화하므로, 경험적으로 소화의시기를 결정한다. </li><li> 세척 및 필터링 <ol><li> 50 ML 튜브로 소화 조직을 전송하고 발굴을 종료재 부유 배지 45 ㎖에 첨가하여 estion. 거친 통해 서스펜션 필터 (~ 1mm) 금속은 새로운 튜브에 메쉬. 3 분 동안 흐름을 통해 100 × g에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 재 부유 매체의 50 ㎖에 소화 췌장을 재현 탁. 70 또는 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 이전과 원심 분리기. </li><li> 재 부상 매체의 5 ML -, 부동, 손상 선포 세포를 제거 상층 액을 제거하고 3 췌장 조직을 재현 탁하기 위해. 재 부상 매체의 7 ML 가득 15 ML 원뿔 튜브에 췌장 선포 세포의 1 ml의 일부를 적용합니다. 3 분 - 꽈리 2 정착하도록 허용합니다. 1 ml의 피펫 튜브 바닥에 침전 한 선포 세포를 수집하고,이 단계 2를 반복 - 3 회. </li><li> 자신의 상태를 테스트하기 위해 조명이나 해부 현미경으로 췌장 선포 세포를 볼 수 있습니다. 그림 2에서 두리 세포에 가해 분리의 순도와 손해 배상을 관찰NG 격리. 최대 20 시간 동안이 즉시 선포 세포 나 문화를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 아밀라아제 분비 분석 참고 : 아밀라아제 분비 분석은 췌장 선포 세포의 분비 능력에 대한 전역 조치로서 역할을한다. 이것은 보통 상업용 키트를 사용하여, 췌장 선포 세포가 배양 된 배지를 수집하고, 매체의 아밀라아제 활성을 결정함으로써 달성된다. <ol><li> 실험 조건의 수를 결정하기 위해 검사한다 (예를 들어 비 - 자극 된 대는 자극). 각 조건에 대해 최소한 세 복제물을 사용합니다. 또한, 매체 (영점 샘플)의 아밀라아제 활성에 대한 전체 셀룰러 아밀라아제 함량 ( &#39;전체&#39;샘플)과 집합 결정에 복제 세트를 추가한다. 멀티 웰의 분석이 수행 될 것이다 플레이트 및 복제물 각 모세관의 두 세트를 사용하는 라벨된다. 참고 : 12 또는 24 웰 플레이트S는 각각 선포 현탁액의 0.5 ml의 1을 모니터링하는데 사용될 수있다. </li><li> KRBH의 재 부상 매체의 30 ㎖에 두 번 선포 세포를 세척하고 37 ° C에서 30 분 동안 재 부상 매체에서 그들을 품어. 멀티 웰 플레이트에 적절한 최종 농도에 도달하는 분비 촉진제의 10μL 방울을 추가한다. </li><li> 췌장 선포 세포는 이중 phasic 방식으로 분비의 기울기에 반응한다. 콜레시스토키닌 (CCK)와 카르 바콜의 1μM (그림 3A)의 100 오후 5시 ​​- 최적의 분비 값이 농도는 50입니다. </li><li> 씻고 재 부상 매체에서 꽈리를 재현 탁. 꽈리가 멀티 웰 플레이트로하고 &#39;total&#39; 표지 마이크로 튜브로 현탁액의 서스펜션과 나누어 동일한 양으로 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 접시를 품어. (바람직하게는 온화한 교반하면서 수조 (에 ~ 50 RPM)). 참고 : 꽈리의 정확한 수는 experimen에 따라 다를 수 있습니다TS는 각 실험 내에서 반복 실험에서와 유사해야하지만. 따라서, 꽈리 현탁액의 정확한 aliquoting 다른 복제하고 조건 사이의 비교 중요합니다. </li><li> 배양하는 동안, &#39;총&#39;과 &#39;제로&#39;샘플을 생산하고 있습니다. 원심 분리기는 &#39;총&#39;5000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브 및 &#39;zero&#39; 표지 마이크로 튜브에 상층 액 50 μl를 제거하고 4 ° C에서 배치합니다. 를 Lyse는 모세관에 트리톤 X-100을 첨가함으로써 &#39;전체&#39;샘플 꽈리 1 %의 최종 농도에 도달한다. 적극적으로 마이크로 튜브를 흔든다. NOTE : &#39;전체&#39;이 실험의 반복 실험과 유사한 복제 Aliquote. 선포 세포를 용균, 총 아밀라아제 콘텐츠의 릴리스로 연결됩니다. 대안 적으로, 각각의 세포 복제에 콘텐츠를 결정하기 위해, 실험의 끝에, 각 조건에서 꽈리를 Lyse 수집. </li><li> 선포 서스펜션 난의 대부분을 수집미리 라벨링 모세관의 제 n을 세트. 5,000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브를 원심 분리기. 미리 라벨링 모세관의 두번째 세트로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 상용 키트와 함께 아밀라제 활동에 대한 상층 액을 분석. 분비 된 아밀라아제의 비율을 계산합니다. 주 : 선형 범위에서 아밀라아제 활성을 읽을 중요합니다. 초기 전체 내용에서 발표 아밀라아제의 비율로 분비되는 아밀라아제의 비율을 제시한다. 각 중으로부터 매체의 배경 아밀라아제 레벨 빼기와 마찬가지로 초기 정규화 된 총 함량으로 나눈다. </li></ol> 췌장 분비의 3 라이브 영상 췌장 선포 세포에서 분비 라이브 영상에 의해 직접 모니터링 할 수 있습니다. 다양한 형광 염료와 센서를 사용하여 라이브 영상은 세포 이하 해상도에서 분비의 특성을 수 있습니다. <ol><li> 갓 산소 재 부상 매체로 준비 전n은 1.1 단계로 37 ºC에 가져다. 현미경을 설정하고 온도 조절 장치를 장착하는 경우, 37 ºC로 조정. </li><li> 재 부상 매체의 30 ㎖에 선포 세포를 씻고 유리 또는 플라스틱 슬라이드에 배치합니다. 주 : 친 유성 염료, 지용성 염료로 표지 원형질막 레이블 엔도 사이토 시스에 의해 막 내부 라벨을 방지하게는 5 분 이상 선포 세포를 염색하기 위해 사용되어야하는 경우. 작업 전반에 걸쳐 조심스럽게 선포 세포를 처리하고 과도한 피펫을 피하십시오. </li><li> 현미경에서 일단 그 형태 이미지 꽈리는 명확하고, 기저 기흉 또는 세포 내 액포를 표시 선포 세포의 이미징을 피하십시오. 현명 동안 또는 직전에 영상의 시작에 하나, 관류 챔버를 사용하여 분비 드롭을 추가합니다. 참고 : 높은 숫자 조리개와 높은 배율 렌즈 (예 : × 63 / 1.4 또는 100 / 1.4 ×) 세포 내 구조를 관찰하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. O / 췌장 선포 세포의 N 문화 (대체 세포 배양 기술) 참고 : O / N 배양 자주 아데노 바이러스 감염에 사용됩니다. 검사 전 16 시간 - 감염 9 10 6 -10 7 PFU / ㎖에서 수행된다. <ol><li> 최대 20 시간 동안 문화 췌장 선포 세포. 25 ml의 배지 (DMEM에서 단일 췌장으로부터 얻어지는 현탁 선포 세포는 우태 혈청 (FCS) (5 %), 나트륨 피루 베이트 (1 %), 항생제 (1 %), L-글루타민 (0.5 %), BSA로 보충 (10 ㎎ / ㎖) 및 STI (0.2 ㎎ / ㎖), 5 10cm 플레이트에 나누었다. 레벨 3 바이오 안전 캐비넷에 바이러스를 감염 꽈리. </li><li> 5 % CO 2의 가습 된 공기를 37 ℃에서 췌장 선포 세포를 배양 하였다. 꽈리 후속 시험 3,8하기 전에 30 분 동안 산소 재 부상 매체에 복구 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. 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The authors declare they have no competing financial interests.

생체 문화 외에, 외분비 분비의 연구를위한 대안 설정은 췌관에서 유체의 intravital 현미경 및 측정을 포함한다. 의 intravital 현미경은 타액이 10 땀샘 마우스에서 잘 작동 것으로 나타났다. 이 방법은 그대로 동​​물에서 실시간으로 분비를 기록 할 수 있지만, 그것의 해상도와 외분비 조직을 조작하기위한 수단에 의해 제한된다. 췌관에서 유체를 수집하여 분비를 평가는 마취 된 쥐 ...

외분비 췌장은 포유 동물의 췌장의 질량의 대부분을 구성하고, 소화 효소 하나의 생산 및 분비에 전념하고 있습니다. 외분비 췌장, acinus의 기능 유닛은 공동 루멘을 형성하고, 주 상피 세포의 클러스터이다. 호르몬 또는 신경 자극되면, 효소로 가득 소포가 그것으로, 혀끝의 세포 표면에 퓨즈를 수송하고 루멘 1-3로 콘텐츠를 추방. 분비 된 효소는 그 때 영양소로 음식의 분해를 촉진 소장에 관의 유착 세트에 의해 배출된다. 이 동영상은 전체 췌장에서 고립되고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수있는 방법을 그대로 꽈리 보여줍니다. 이 설정을 사용하여, 췌장 분비를 자극 다음 출시 된 아밀라아제의 상대적인 양을 측정하여 정량화한다. 대안 적으로, 서로 다른 분비를 이용하여 묘화 될 수있는 라이브센서 및 염료. 본래 췌장의 여러 특성을 유지하는 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물 4-6에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 췌장 선포 세포의 생체 외 설치가 유리하다. 이 설정은 원래 1970 년대 후반에 개발 및 타액 및 유선 3-7로 여러 외분비 조직의 연구를 위해 확장 된 이후였다. 특히, 이러한 편광 상피 세포의 복잡한 세포 조직에 최소한의 간섭 분비의 연구를 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="655">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">ICR mice</td>
			<td style="width:115px;">Harlan</td>
			<td style="width:91px;"></td>
			<td style="width:203px;">Any strain will do</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HBSS</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8264</td>
			<td>Can substitude for KRB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Fraction V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C0130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nylon mesh</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352360</td>
			<td>70-100&#181;m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amylase infinity reagent&#160;</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>TR25421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCK</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FM4-64</td>
			<td>Lifetechnologies</td>
			<td>F34653</td>
			<td>Diluted to 16&#181;M</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20mL scintillation vial</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DeltaVision system&#160;</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td></td>
			<td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>ELx808</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

췌장 선포 세포 생산 및 소화 효소를 분비한다. 이 세포는 공동 루멘을 형성하고 주 클러스터로 구성됩니다. 이 작품은 이러한 세포의 분비 능력이 고립 꽈리의 문화에 의해 평가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 그대로 외분비 췌장의 여러 특성을 유지 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 설치가 유리하다. 생체 문화가 꽈리의 생체 내 특성을 대표 할 수 있도록 췌장 선포 세포의 적절한 분리가 핵심 요구 사항이다. 이 프로토콜은 마우스의 췌장에서 그대로 선포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 췌장 분비를 평가하는 두 개의 보완적인 방법이 제공됩니다. 췌장 분비 직접 이미징 서브 해상도 분비 세포의 특성화를 허용하면서 아밀라아제 분비 분석은, 글로벌 계수로서 기능한다. 종합적으로, 기술은 presen와여기 테드의 외분비 분비를 연구하기 위해 실험의 폭 넓은 스펙트럼을 할 수 있습니다.

전송 된 빛에 의해 볼 때 제대로 분리 한 췌장 선포 세포는에 박힌 형태를 표시합니다. 이들의 기저 도메인은 라운드 기흉의 결여 나타납니다. 혀끝의 도메인이 분비 소포의 수백에 의해 둘러싸여 있으며, 색상 (그림 2A, B)에서 어두운 나타납니다. 핵 기공을 갖는 영역으로 기저에 위치하고 있습니다. 세포 파편 및 췌장 유관 시스템 및 선포 세포 분리 (도 2C, D)의 초기 단계...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수​​ 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다.

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.5K 조회수.  Weizmann Institute of Science.  고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수​​ 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다. 

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Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice. We found that it was easier to concentrate the islets or cells into pellets in the final delivery tubing (PE50) used to transplant the cells under the kidney capsule. This technique provides both speed and ease while reducing any undue stress to the cells or to the mouse.

Loading: Settled, hand picked, islets or pelleted cells are carefully aspirated off the bottom of a 1.5 mL microcentrifuge tube using a p200 pipetteman and a straight, thin-wall pipette tip. A length of PE50 tubing is attached to the pipette tip using a small silicone adapter tubing. Cells are allowed to settle, in the tip, and then are transferred to the PE50 tubing by slowly dialing the pipetteman. Once the cells are near the end of the PE50 tubing, a kink is made and the silicone adaptor tubing is placed over the kink. The PE50 tubing is transferred to a 15 mL conical containing a cut 5 mL pipet, and the PE50 tubing is taped over the side of the 5 mL pipet to prevent curling during centrifuging. Cells are allowed to reach 1,000 rpm and stopped.
Transplantation: Recipient mice are anesthetized, shaved, and cleaned. A small incision is made on the left flank of the mouse and the kidney is exposed. The kidney, fat, and tissue are kept moist with normal saline swab. The distal end of the PE50 is attached to a Hamilton screw drive syringe, containing a pipette tip, using the silicone adaptor tubing. A small nick is made on the right flank side of the kidney, not too large nor too deep. The beveled end of the PE50 tubing, nearest the cells, is carefully placed under the capsule, the tubing is moved around gently to make space while swabbing normal saline; a dry capsule can tear easily. A small air bubble is delivered under the capsule by slowly dialing the syringe screw drive. Islets are then slowly delivered behind the air bubble. Once the islets have been delivered kidney homeostasis is maintained and the knick is cauterized with low heat. The kidney is placed back into the cavity and the peritoneum and skin are sutured and stapled. Mice are immediately treated with Flunixin and Buprenorphine s.q. and placed in a cage on a heating pad.

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of mice. Cells are concentrated into pellets in the final tubing used for transplanting the cells under the kidney capsule. The ease of this technique reduces stress to the cells and the mouse.

당뇨병 마우스의 신장 캡슐으로 췌장 아일 레츠의 이식

Our protocol was developed to cleanly and easily deliver islets or cells under the kidney capsule of diabetic or normal mice.  We found that it was easier ...

연구

생물학

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

인간 췌장 아일릿 격리 : 부품 I : 소화 및 췌장 조직의 수집

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods are needed that can quantify the pathologic changes. Furthermore, to provide translational relevance to the mouse models, such measurements should be tests that can easily be done in both humans and mice. Unfortunately, in the present literature few phenotypic measurements of lung function have direct application to humans. One exception is the diffusing capacity for carbon monoxide, which is a measurement that is routinely done in humans. In the present report, we describe a means to quickly and simply measure this diffusing capacity in mice. The procedure involves brief lung inflation with tracer gases in an anesthetized mouse, followed by a 1 min gas analysis time. We have tested the ability of this method to detect several lung pathologies, including emphysema, fibrosis, acute lung injury, and influenza and fungal lung infections, as well as monitoring lung maturation in young pups. Results show significant decreases in all the lung pathologies, as well as an increase in the diffusing capacity with lung maturation. This measurement of lung diffusing capacity thus provides a pulmonary function test that has broad application with its ability to detect phenotypic structural changes with most of the existing pathologic lung models.

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

We describe a means to quickly and simply measure the lung diffusing capacity in mice and show that it is sufficiently sensitive to phenotype changes in multiple common lung pathologies. This metric thus brings direct translational relevance to the mouse models, since diffusing capacity is also easily measured in humans.

표현형 마우스 폐 기능<em&gt; 생체</em&gt; 폐 확산 능력

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. Adipogenic differentiation of progenitor cells is a major mechanism driving adipose tissue expansion and dysfunction in response to obesity. Understanding changes to perivascular adipose tissue (PVAT) is thus clinically relevant in metabolic disease. However, previous studies have been predominately performed in the mouse and other animal models. This protocol uses human thoracic PVAT samples collected from patients undergoing coronary artery bypass graft surgery. Adipose tissue from the ascending aorta was collected and used for explantation of the stromal vascular fraction. We previously confirmed the presence of adipose progenitor cells in human PVAT with the capacity to differentiate into lipid-containing adipocytes. In this study, we further analyzed the differentiation potential of cells from the stromal vascular fraction, presumably containing multi-potent progenitor cells. We compared PVAT-derived cells to human bone marrow MSC for differentiation into adipogenic, osteogenic, and chondrogenic lineages. Following 14 days of differentiation, specific stains were utilized to detect lipid accumulation in adipocytes (Oil red O), calcific deposits in osteogenic cells (Alizarin Red), or glycosaminoglycans and collagen in chondrogenic cells (Masson&#8217;s Trichrome). While bone marrow MSC efficiently differentiated into all three lineages, PVAT-derived cells had adipogenic and chondrogenic potential, but lacked robust osteogenic potential.

The goal of this protocol is to test the ability of progenitor cells derived from human perivascular adipose tissue to differentiate into multiple cell lineages. Differentiation was compared to mesenchymal stem cells derived from human bone marrow, which is known to differentiate into adipocyte, osteocyte, and chondrocyte lineages.

인간의 대동맥 혈관 주위 지방 조상 세포의 분화 능력

Adipose tissue is a rich source of multi-potent mesenchymal stem cells (MSC) capable of differentiating into osteogenic, adipogenic, and chondrogenic ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells that trigger secretion of three main hormones: insulin (from &#946;-cells), glucagon (&#945;-cells) and somatostatin (&#948;-cells). &#946;-Cells, which make up the majority of islet cells and are electrically coupled to each other, respond to the glucose stimulus as one single entity. The excitability of the minor subpopulations, &#945;-cells and &#948;-cells (making up around 20% (30%) and 4% (10%) of the total rodent1 (human2) islet cell numbers, respectively) is less predictable and is therefore of special interest.
Calcium sensors are delivered into the peripheral layer of cells within the isolated islet. The islet or a group of islets is then immobilized and imaged using a fluorescence microscope. The choice of the imaging mode is between higher throughput (wide-field) and better spatial resolution (confocal). Conventionally, laser scanning confocal microscopy is used for imaging tissue, as it provides the best separation of the signal between the neighboring cells. A wide-field system can be utilized too, if the contaminating signal from the dominating population of &#946;-cells is minimized.
Once calcium dynamics in response to specific stimuli have been recorded, data are expressed in numerical form as fluorescence intensity vs. time, normalized to the initial fluorescence and baseline-corrected, to remove the effects linked to bleaching of the fluorophore. Changes in the spike frequency or partial area under the curve (pAUC) are computed vs. time, to quantify the observed effects. pAUC is more sensitive and quite robust whereas spiking frequency provides more information on the mechanism of calcium increase.
Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells.

Here, we present a protocol for imaging and quantifying calcium dynamics in heterogeneous cell populations, such as pancreatic islet cells. Fluorescent reporters are delivered into the peripheral layer of cells within the islet, which is then immobilized and imaged, and per-cell analysis of the dynamics of fluorescence intensity is performed.

마우스 췌도 세포의 하위 집단에 있는 화상 진찰 칼슘 역학

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat metabolic syndrome. Thermogenic tissues such as brown and beige fats develop highly specialized mitochondria for heat production. Mitochondria of other tissues, which primarily produce ATP, also convert up to 25% of the total mitochondrial energy production into heat and can, therefore, have a considerable impact on the physiology of the whole body. Mitochondrial thermogenesis is not only essential for maintaining the body temperature, but also prevents diet-induced obesity and reduces the production of reactive oxygen species (ROS) to protect cells from oxidative damage. Since mitochondrial thermogenesis is a key regulator of cellular metabolism, a mechanistic understanding of this fundamental process will help in the development of therapeutic strategies to combat many pathologies associated with mitochondrial dysfunction. Importantly, the precise molecular mechanisms that control acute activation of thermogenesis in mitochondria are poorly defined. This lack of information is largely due to a dearth of methods for the direct measurement of uncoupling proteins. The recent development of patch-clamp methodology applied to mitochondria enabled, for the first time, the direct study of the phenomenon at the origin of mitochondrial thermogenesis, H+ leak through the IMM, and the first biophysical characterization of mitochondrial transporters responsible for it, the uncoupling protein 1 (UCP1), specific of brown and beige fats, and the ADP/ATP transporter (AAC) for all other tissues. This unique approach will provide new insights into the mechanisms that control H+ leak and mitochondrial thermogenesis and how they can be targeted to combat metabolic syndrome. This paper describes the patch-clamp methodology applied to mitochondria to study their thermogenic capacity by directly measuring H+ currents through the IMM.

This method article details the main steps in measuring H+ leak across the inner mitochondrial membrane with the patch-clamp technique, a new approach to study the thermogenic capacity of mitochondria.

미토콘드리아의 열원성 능력을 연구하기 위한 패치 클램프 기술의 사용

Mitochondrial thermogenesis (also known as mitochondrial uncoupling) is one of the most promising targets for increasing energy expenditure to combat ...

망막 색소 상피 식세포작용 및 리포푸신 축적 정량화

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

저자 스포트라이트: Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...