이 작품은 BS하기 위해 미국 - 이스라엘 BSF로부터의 보조금에 의해 자금을 지원하고 EDSBS는 분자 유전학의 힐과 세실 루이스 교수의 의자 현직있다.

주 : 동물 대상으로 한 절차는 과학의 와이즈만 연구소의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1 샘플 준비 <ol><li> 췌장 선포 세포의 분리 <ol><li> 시작하기 전에 신선한 크렙스 - 링거 중탄산 HEPES (KRBH) 매체의 300 ML를 준비합니다. 140 밀리미터의 NaCl, 4.7 밀리미터의 KCl을 혼합 1.16 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘이, 11 mM의 포도당, 10 mM의 HEPES. 소 혈청 알부민 (BSA) 및 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 (STI) (재 부유 매체)를 추가한다. 매체 콜라게나 제 (~ 0.75 ㎎ / ㎖) (소화 매체)와 보충 재 부유 10 ㎖ - 5를 준비합니다. </li><li> ~ 30 분 KRB 매체에 산소. 버블 링을 방지하기 위해 산소 후 BSA를 추가합니다. 37 ° C에서 재 부상 및 소화 매체를 가져와. 주 : 매체를 산소로하는 세포 사망률을 감소시키고 분비에 대한 응답 성을 향상시킨다. 산소의 효과는 최소한 6 시간 동안 명백하다. </li><l난&gt; 기관 동물 관리 지침에 따라, 자궁 경부 전위 또는 CO 2 질식하여 마우스를 희생. 그 뒷면에있는 희생 동물을 놓고 해부 패드에 연결하고 에탄올로 복부 표면을 청소합니다. 참고 : 오염을 방지 절개 도구 및 사용 전에 KRBH 매체에 사용되는 물을 고압 증기 멸균하기 위하여. 0.2 μm의 필터를 통해 KRBH 매체를 필터링합니다. 이전에는 췌장 절제술로 70 % 에탄올로 해부 도구를 헹구고 깨끗한 벤치에 절개를 실시하고 있습니다. 레벨 3 생물 안전 캐비닛의 바이러스 감염을 수행하십시오. O / N 배양 배지에 항생제를 추가 (4 절 참조). </li></ol></li><li> 쥐의 췌장 절제 <ol><li> 절개 널리 복부 피부와 피하 층을 포함한다. 간, 위, 대장, 췌장, 비장 (그림 1) 확인합니다. 참고 : 다음 단계에서 조심스럽게 췌장 조직을 처리하고 과도한 기계적 그렇게해야을 적용하지 않도록전자 조직 및 세포 죽음의 자동 소화를 방지합니다. </li><li> 이 무딘 집게를 사용하여 소장을 잡아 당깁니다. 위장으로부터 출구 근처 소장 근위 단부에서 시작. 소장에서 췌장을 분리하고 체강 내에서 유지됩니다. 일단 대장에 도달, 핑크 / 화이트 결합 조직을 알 수 있습니다. 췌장와 혼동하지 마십시오. </li><li> 지방이나 결합 조직을 수집하지 않고 가능한 한 많은 췌장 조직을 취소합니다. 비장과 위장에서 그것을 분리 및 복부 혈관 그 아래 (그림 1A-C)를 절단하여 췌장을 제거합니다. NOTE : 단일 동물 췌장 선포 세포에서의 수율이 높기 때문에, 하나가 다른 조직을 수집하는 것을 방지하기 위해 모든 췌장 조직 수집을 삼가 할 수있다. </li></ol></li><li> 콜라게나 소화 <ol><li> 췌장 37 ° C로 가열 재 부상 매체에 몇 번 헹구고 비 췌장의 나머지 부분을 제거조직. 20 ml의 신틸레이션 바이알에 예열 된 소화 매체 ~ 5 ㎖ 중의 췌장 담가. 1-3밀리미터의 조각 췌장을 말하다. (최적 ~ 100 rpm으로 교반하면서) 가열 된 물을 욕조에 넣습니다. 소화를 촉진하기 위해, 소화 조직 상하마다 몇 분 피펫. NOTE : 콜라게나 제 소화 기간은 주로 콜라게나 제 농도 및 조직에 적용되는 기계적 힘의 크기에 의존한다. 30 셀 - (10)의 선포 세포의 결과로 5 분 - 약 15 분 동안 825 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제의 사용 및 2mm와 5 ㎖의 폴리스티렌 피펫 조직을 피펫 팅은 매 3 오리피스. 소화 후, 현탁액을 조직 보이는 조각을 포함 혼탁이 나타납니다. 콜라게나 효율 다른 상업적 유형과 많은 사이에서 변화하므로, 경험적으로 소화의시기를 결정한다. </li><li> 세척 및 필터링 <ol><li> 50 ML 튜브로 소화 조직을 전송하고 발굴을 종료재 부유 배지 45 ㎖에 첨가하여 estion. 거친 통해 서스펜션 필터 (~ 1mm) 금속은 새로운 튜브에 메쉬. 3 분 동안 흐름을 통해 100 × g에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 재 부유 매체의 50 ㎖에 소화 췌장을 재현 탁. 70 또는 100 μm의 나일론 메쉬를 통해 현탁액을 필터링합니다. 이전과 원심 분리기. </li><li> 재 부상 매체의 5 ML -, 부동, 손상 선포 세포를 제거 상층 액을 제거하고 3 췌장 조직을 재현 탁하기 위해. 재 부상 매체의 7 ML 가득 15 ML 원뿔 튜브에 췌장 선포 세포의 1 ml의 일부를 적용합니다. 3 분 - 꽈리 2 정착하도록 허용합니다. 1 ml의 피펫 튜브 바닥에 침전 한 선포 세포를 수집하고,이 단계 2를 반복 - 3 회. </li><li> 자신의 상태를 테스트하기 위해 조명이나 해부 현미경으로 췌장 선포 세포를 볼 수 있습니다. 그림 2에서 두리 세포에 가해 분리의 순도와 손해 배상을 관찰NG 격리. 최대 20 시간 동안이 즉시 선포 세포 나 문화를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2 아밀라아제 분비 분석 참고 : 아밀라아제 분비 분석은 췌장 선포 세포의 분비 능력에 대한 전역 조치로서 역할을한다. 이것은 보통 상업용 키트를 사용하여, 췌장 선포 세포가 배양 된 배지를 수집하고, 매체의 아밀라아제 활성을 결정함으로써 달성된다. <ol><li> 실험 조건의 수를 결정하기 위해 검사한다 (예를 들어 비 - 자극 된 대는 자극). 각 조건에 대해 최소한 세 복제물을 사용합니다. 또한, 매체 (영점 샘플)의 아밀라아제 활성에 대한 전체 셀룰러 아밀라아제 함량 ( &#39;전체&#39;샘플)과 집합 결정에 복제 세트를 추가한다. 멀티 웰의 분석이 수행 될 것이다 플레이트 및 복제물 각 모세관의 두 세트를 사용하는 라벨된다. 참고 : 12 또는 24 웰 플레이트S는 각각 선포 현탁액의 0.5 ml의 1을 모니터링하는데 사용될 수있다. </li><li> KRBH의 재 부상 매체의 30 ㎖에 두 번 선포 세포를 세척하고 37 ° C에서 30 분 동안 재 부상 매체에서 그들을 품어. 멀티 웰 플레이트에 적절한 최종 농도에 도달하는 분비 촉진제의 10μL 방울을 추가한다. </li><li> 췌장 선포 세포는 이중 phasic 방식으로 분비의 기울기에 반응한다. 콜레시스토키닌 (CCK)와 카르 바콜의 1μM (그림 3A)의 100 오후 5시 ​​- 최적의 분비 값이 농도는 50입니다. </li><li> 씻고 재 부상 매체에서 꽈리를 재현 탁. 꽈리가 멀티 웰 플레이트로하고 &#39;total&#39; 표지 마이크로 튜브로 현탁액의 서스펜션과 나누어 동일한 양으로 균일하게 분산되어 있는지 확인합니다. 37 ° C에서 30 분 동안 접시를 품어. (바람직하게는 온화한 교반하면서 수조 (에 ~ 50 RPM)). 참고 : 꽈리의 정확한 수는 experimen에 따라 다를 수 있습니다TS는 각 실험 내에서 반복 실험에서와 유사해야하지만. 따라서, 꽈리 현탁액의 정확한 aliquoting 다른 복제하고 조건 사이의 비교 중요합니다. </li><li> 배양하는 동안, &#39;총&#39;과 &#39;제로&#39;샘플을 생산하고 있습니다. 원심 분리기는 &#39;총&#39;5000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브 및 &#39;zero&#39; 표지 마이크로 튜브에 상층 액 50 μl를 제거하고 4 ° C에서 배치합니다. 를 Lyse는 모세관에 트리톤 X-100을 첨가함으로써 &#39;전체&#39;샘플 꽈리 1 %의 최종 농도에 도달한다. 적극적으로 마이크로 튜브를 흔든다. NOTE : &#39;전체&#39;이 실험의 반복 실험과 유사한 복제 Aliquote. 선포 세포를 용균, 총 아밀라아제 콘텐츠의 릴리스로 연결됩니다. 대안 적으로, 각각의 세포 복제에 콘텐츠를 결정하기 위해, 실험의 끝에, 각 조건에서 꽈리를 Lyse 수집. </li><li> 선포 서스펜션 난의 대부분을 수집미리 라벨링 모세관의 제 n을 세트. 5,000 × g에서 몇 초 동안 마이크로 튜브를 원심 분리기. 미리 라벨링 모세관의 두번째 세트로 뜨는을 전송합니다. </li><li> 상용 키트와 함께 아밀라제 활동에 대한 상층 액을 분석. 분비 된 아밀라아제의 비율을 계산합니다. 주 : 선형 범위에서 아밀라아제 활성을 읽을 중요합니다. 초기 전체 내용에서 발표 아밀라아제의 비율로 분비되는 아밀라아제의 비율을 제시한다. 각 중으로부터 매체의 배경 아밀라아제 레벨 빼기와 마찬가지로 초기 정규화 된 총 함량으로 나눈다. </li></ol> 췌장 분비의 3 라이브 영상 췌장 선포 세포에서 분비 라이브 영상에 의해 직접 모니터링 할 수 있습니다. 다양한 형광 염료와 센서를 사용하여 라이브 영상은 세포 이하 해상도에서 분비의 특성을 수 있습니다. <ol><li> 갓 산소 재 부상 매체로 준비 전n은 1.1 단계로 37 ºC에 가져다. 현미경을 설정하고 온도 조절 장치를 장착하는 경우, 37 ºC로 조정. </li><li> 재 부상 매체의 30 ㎖에 선포 세포를 씻고 유리 또는 플라스틱 슬라이드에 배치합니다. 주 : 친 유성 염료, 지용성 염료로 표지 원형질막 레이블 엔도 사이토 시스에 의해 막 내부 라벨을 방지하게는 5 분 이상 선포 세포를 염색하기 위해 사용되어야하는 경우. 작업 전반에 걸쳐 조심스럽게 선포 세포를 처리하고 과도한 피펫을 피하십시오. </li><li> 현미경에서 일단 그 형태 이미지 꽈리는 명확하고, 기저 기흉 또는 세포 내 액포를 표시 선포 세포의 이미징을 피하십시오. 현명 동안 또는 직전에 영상의 시작에 하나, 관류 챔버를 사용하여 분비 드롭을 추가합니다. 참고 : 높은 숫자 조리개와 높은 배율 렌즈 (예 : × 63 / 1.4 또는 100 / 1.4 ×) 세포 내 구조를 관찰하는 것이 좋습니다. </li></ol> 4. O / 췌장 선포 세포의 N 문화 (대체 세포 배양 기술) 참고 : O / N 배양 자주 아데노 바이러스 감염에 사용됩니다. 검사 전 16 시간 - 감염 9 10 6 -10 7 PFU / ㎖에서 수행된다. <ol><li> 최대 20 시간 동안 문화 췌장 선포 세포. 25 ml의 배지 (DMEM에서 단일 췌장으로부터 얻어지는 현탁 선포 세포는 우태 혈청 (FCS) (5 %), 나트륨 피루 베이트 (1 %), 항생제 (1 %), L-글루타민 (0.5 %), BSA로 보충 (10 ㎎ / ㎖) 및 STI (0.2 ㎎ / ㎖), 5 10cm 플레이트에 나누었다. 레벨 3 바이오 안전 캐비넷에 바이러스를 감염 꽈리. </li><li> 5 % CO 2의 가습 된 공기를 37 ℃에서 췌장 선포 세포를 배양 하였다. 꽈리 후속 시험 3,8하기 전에 30 분 동안 산소 재 부상 매체에 복구 할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+pancreatic+acinar+cell+function.">Regulation of pancreatic acinar cell function.</a> Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).</li><li>Schnekenburger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin,+dynein+and+microtubules+in+pancreatic+secretion.">The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).</li><li>Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+exocrine+secretory+vesicles+to+the+apical+membrane+by+actin+cables+generated+by+the+formin+mDia1.">Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).</li><li>Amsterdam, A., Jamieson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+characterization+of+isolated+pancreatic+exocrine+cells.">Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).</li><li>Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+of+secretagogues+on+a+new+preparation+of+functionally+intact,+isolated+pancreatic+acini.">Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini.</a> The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).</li><li>Jerdeva, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+non-muscle+myosin+II+facilitate+apical+exocytosis+of+tear+proteins+in+rabbit+lacrimal+acinar+epithelial+cells.">Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells.</a> Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).</li><li>Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersed+pancreatic+acinar+cells+and+pancreatic+acini.">Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini.</a> Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).</li><li>Bi, Y., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Rho+and+Rac+in+secretagogue-induced+amylase+release+by+pancreatic+acini.">A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).</li><li>Palade, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+aspects+of+the+process+of+protein+synthesis.">Intracellular aspects of the process of protein synthesis.</a> Science. 189, 867 (1975).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).</li><li>Petersen, H., Grossman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+exocrine+secretion+in+anesthetized+and+conscious+rats.">Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats.</a> The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5, 605-607 (2008).</li><li>Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+for+the+actin+cytoskeleton+during+regulated+exocytosis.">Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

생체 문화 외에, 외분비 분비의 연구를위한 대안 설정은 췌관에서 유체의 intravital 현미경 및 측정을 포함한다. 의 intravital 현미경은 타액이 10 땀샘 마우스에서 잘 작동 것으로 나타났다. 이 방법은 그대로 동​​물에서 실시간으로 분비를 기록 할 수 있지만, 그것의 해상도와 외분비 조직을 조작하기위한 수단에 의해 제한된다. 췌관에서 유체를 수집하여 분비를 평가는 마취 된 쥐 ...

외분비 췌장은 포유 동물의 췌장의 질량의 대부분을 구성하고, 소화 효소 하나의 생산 및 분비에 전념하고 있습니다. 외분비 췌장, acinus의 기능 유닛은 공동 루멘을 형성하고, 주 상피 세포의 클러스터이다. 호르몬 또는 신경 자극되면, 효소로 가득 소포가 그것으로, 혀끝의 세포 표면에 퓨즈를 수송하고 루멘 1-3로 콘텐츠를 추방. 분비 된 효소는 그 때 영양소로 음식의 분해를 촉진 소장에 관의 유착 세트에 의해 배출된다. 이 동영상은 전체 췌장에서 고립되고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수있는 방법을 그대로 꽈리 보여줍니다. 이 설정을 사용하여, 췌장 분비를 자극 다음 출시 된 아밀라아제의 상대적인 양을 측정하여 정량화한다. 대안 적으로, 서로 다른 분비를 이용하여 묘화 될 수있는 라이브센서 및 염료. 본래 췌장의 여러 특성을 유지하는 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물 4-6에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 췌장 선포 세포의 생체 외 설치가 유리하다. 이 설정은 원래 1970 년대 후반에 개발 및 타액 및 유선 3-7로 여러 외분비 조직의 연구를 위해 확장 된 이후였다. 특히, 이러한 편광 상피 세포의 복잡한 세포 조직에 최소한의 간섭 분비의 연구를 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ICR mice</td><td>Harlan</td><td></td><td>Any strain will do</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8264</td><td>Can substitude for KRB</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td>Fraction V</td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>70-100&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Amylase infinity reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>TR25421</td><td></td></tr><tr><td>CCK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2175</td><td></td></tr><tr><td>FM4-64</td><td>Lifetechnologies</td><td>F34653</td><td>Diluted to 16&amp;micro;M</td></tr><tr><td>20mL scintillation vial</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>DeltaVision system&amp;nbsp;</td><td>Applied Precision</td><td></td><td>Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)</td></tr><tr><td>Zeiss 510 or 710 confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>60x/1.4 or 100x/1.4 objectives&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra Microplate reader</td><td>BioTek</td><td>ELx808</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing the secretory capacity of pancreatic acinar cells

췌장 선포 세포 생산 및 소화 효소를 분비한다. 이 세포는 공동 루멘을 형성하고 주 클러스터로 구성됩니다. 이 작품은 이러한 세포의 분비 능력이 고립 꽈리의 문화에 의해 평가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 그대로 외분비 췌장의 여러 특성을 유지 절연 꽈리는, 조작 및 전체 동물에서보다 더 용이하게 모니터링 할 수 있기 때문에 설치가 유리하다. 생체 문화가 꽈리의 생체 내 특성을 대표 할 수 있도록 췌장 선포 세포의 적절한 분리가 핵심 요구 사항이다. 이 프로토콜은 마우스의 췌장에서 그대로 선포 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 그 후, 췌장 분비를 평가하는 두 개의 보완적인 방법이 제공됩니다. 췌장 분비 직접 이미징 서브 해상도 분비 세포의 특성화를 허용하면서 아밀라아제 분비 분석은, 글로벌 계수로서 기능한다. 종합적으로, 기술은 presen와여기 테드의 외분비 분비를 연구하기 위해 실험의 폭 넓은 스펙트럼을 할 수 있습니다.

전송 된 빛에 의해 볼 때 제대로 분리 한 췌장 선포 세포는에 박힌 형태를 표시합니다. 이들의 기저 도메인은 라운드 기흉의 결여 나타납니다. 혀끝의 도메인이 분비 소포의 수백에 의해 둘러싸여 있으며, 색상 (그림 2A, B)에서 어두운 나타납니다. 핵 기공을 갖는 영역으로 기저에 위치하고 있습니다. 세포 파편 및 췌장 유관 시스템 및 선포 세포 분리 (도 2C, D)의 초기 단계...

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Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells

고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수​​ 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다.

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

Pancreatic acinar cells produce and secrete digestive enzymes. These cells are organized as a cluster which forms and shares a joint lumen. This work ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.6K 조회수.  Weizmann Institute of Science.  고립 된 췌장 선포 세포는 생체 형태와 활동을 유지하고 모니터링 및 분비를 조작하기위한 강력한 방법을 제공합니다. 이 작업은 샘 꽈리가 마우스의 췌장으로부터 단리 할 수​​ 있고, 자신의 분비 능력이 어떻게 평가 될 수 있는지 보여준다. 

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Mimicking and Manipulating Pancreatic Acinar-to-Ductal Metaplasia in 3-dimensional Cell Culture

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires further study. To understand the mechanisms regulating acinar-to-ductal metaplasia (ADM), ex vivo 3D culture and differentiation of primary acinar cells to ductal cells offers many advantages over other systems. With the technique herein, modulation of protein expression is simple and quick, requiring only one day to isolate, stimulate or virally infect, and begin culturing primary acinar cells to investigate the ADM process. In contrast to using basement membrane matrix, the seeding of acinar cell clusters in collagen I extracellular matrix, allows acinar cells to retain their acinar identity before manipulation. This is vital when testing the contribution of various components to the induction of ADM. Not only are the effects of cytokines or other ectopically administered factors testable through this technique, but the contribution of common mutations, increased protein expression, or knockdown of protein expression is testable via viral infection of primary acinar cells, using adenoviral or lentiviral vectors. Moreover, cells can be re-isolated from collagen or basement membrane matrix at the endpoint and analyzed for protein expression.

Primary acinar cell isolation, protein expression or activity modulation, culture, and down-stream applications are abundantly useful in the ex vivo study of acinar-to-ductal metaplasia (ADM), an early event in the development of pancreatic cancer.

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

The differentiation of acinar cells to ductal cells during pancreatitis and in the early development of pancreatic cancer is a key process that requires ...

연구

암 연구학

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within pancreatic islets and act in a coordinated fashion to maintain glucose homeostasis. It is becoming increasingly clear that interactions between transmembrane proteins on the surfaces of adjacent beta cells are important determinants of beta-cell function.
Elucidation of the roles of particular transcellular interactions by knockdown, knockout or overexpression studies in cultured beta cells or in vivo necessitates direct perturbation of mRNA and protein expression, potentially affecting beta-cell health and/or function in ways that could confound analyses of the effects of specific interactions. These approaches also alter levels of the intracellular domains of the targeted proteins and may prevent effects due to interactions between proteins within the same cell membrane to be distinguished from the effects of transcellular interactions.
Here a method for determining the effect of specific transcellular interactions on the insulin secreting capacity and responsiveness of beta cells is presented. This method is applicable to beta-cell lines, such as INS-1 cells, and to dissociated primary beta cells. It is based on coculture models developed by neurobiologists, who found that exposure of cultured neurons to specific neuronal proteins expressed on HEK293 (or COS) cell layers identified proteins important for driving synapse formation. Given the parallels between the secretory machinery of neuronal synapses and of beta cells, we reasoned that beta-cell functional maturation might be driven by similar transcellular interactions. We developed a system where beta cells are cultured on a layer of HEK293 cells expressing a protein of interest. In this model, the beta-cell cytoplasm is untouched while extracellular protein-protein interactions are manipulated. Although we focus here primarily on studies of glucose-stimulated insulin secretion, other processes can be analyzed; for example, changes in gene expression as determined by immunoblotting or qPCR.

Transcellular protein interactions are important determinants of pancreatic beta-cell function. Detailed here is a method&#x2014;adapted from a coculture model of synaptogenesis&#x2014;for investigating how specific transmembrane proteins influence insulin secretion. Transfected HEK293 cells express proteins of interest; beta cells do not need to be transfected or otherwise directly perturbed.

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

의학

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

<meta charset="utf8"></head><body>용해성 세포외 기질 ECM 생산을 위한 인간 췌장의 무세제 탈세포화(Detergent-free decellularization of the human pancreas for solveble extracellular matrix ECM production)

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

용해성 세포외 기질(ECM) 생산을 위한 인간 췌장의 세제 없는 탈세포화

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

생체공학

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

생물학

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

The pancreatic acinar cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary role in the secretion of pancreatic enzymes into the pancreatic duct. It is also the site for the initiation of pancreatitis. Here we describe how acinar cells are isolated from whole pancreas tissue and intracellular calcium signals are measured. In addition, we describe the techniques of transfecting these cells with adenoviral constructs, and subsequently measuring the leakage of lactate dehydrogenase, a marker of cell injury, during conditions that induce acinar cell injury in vitro. These techniques provide a powerful tool to characterize acinar cell physiology and pathology.

We describe a reproducible method of preparing mouse pancreatic acinar cells from a mouse for the purpose of examining acinar cell calcium signals and cellular injury with physiologically and pathologically relevant stimuli. A method for adenoviral infection of these cells is also provided.

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared from live human and mouse pancreatic tissue embedded in agarose and cut using a vibratome. This method allows for the tissue to maintain viability and function in addition to preserving underlying pathologies such as type 1 (T1D) and type 2 diabetes (T2D). The slice method enables new directions in the study of the pancreas through the maintenance of the complex structures and various intercellular interactions that comprise the endocrine and exocrine tissues of the pancreas. This protocol demonstrates how to perform staining and time-lapse microscopy of live endogenous immune cells within pancreatic slices along with assessments of islet physiology. Further, this approach can be refined to discern immune cell populations specific for islet cell antigens using major histocompatibility complex-multimer reagents.

This study presents the application of live pancreatic tissue slices to the study of islet physiology and islet-immune cell interactions.

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

면역학 및 감염병학

복강내 약물 주입을 통한 마우스의 췌장 손상 유도

Preparing a Mice Model of Severe Acute Pancreatitis via a Combination of Caerulein and Lipopolysaccharide Intraperitoneal Injection

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological changes associated with SAP using animal models can aid in identifying potential therapeutic targets and exploring novel treatment approaches. Previous studies primarily induced pancreatic injury through retrograde bile duct injection of sodium taviaurocholate, but the impact of surgical damage on the quality of the animal model remains unclear. In this study, we employed various frequencies of intraperitoneal Caerulein injections combined with different doses of LPS to induce pancreatic injury in C57BL/6J mice and compared the extent of injury across five intraperitoneal injection protocols. Regarding inducing acute pancreatitis in mice, an intraperitoneal injection protocol is proposed that results in a mortality rate as high as 80% within 5 days. Specifically, mice received ten daily intraperitoneal injections of Caerulein (50 &#181;g/kg), followed by an injection of LPS (15 mg/kg) one hour after the last Caerulein administration. By adjusting the frequency and dosage of injected medications, one can manipulate the severity of pancreatic injury effectively. This model exhibits strong controllability and has a short replication cycle, making it feasible for completion by a single researcher without requiring expensive equipment. It conveniently and accurately simulates key disease characteristics observed in human SAP while demonstrating a high degree of reproducibility.

저자 스포트라이트: 마우스의 중증 급성 췌장염에 대한 새로운 치료법을 개발하기 위한 치료 표적 식별

Intraperitoneal drug administration is a safe and effective non-invasive approach for inducing pancreatic injury. This study compared five distinct intraperitoneal injection protocols on mice to induce varying degrees of pancreatic injury and established a model of severe pancreatic injury to investigate the pathological changes and treatment strategies for severe acute pancreatitis (SAP).

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

The treatment of severe acute pancreatitis (SAP), with high mortality rates, poses a significant clinical challenge. Investigating the pathological ...

췌장 선포 세포의 분비 능력 평가

요약

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이 비디오의 챕터

흉내 낸 고 3 차원 세포 배양에서 췌 장 Acinar-Ductal Metaplasia 조작

췌장의 베타 세포가 인슐린 분비에 영향을 미치는 세포 외 단백질 상호 작용의 배양 분석

용해성 세포외 기질(ECM) 생산을 위한 인간 췌장의 세제 없는 탈세포화

용해성 세포외 기질(ECM) 생산을 위한 인간 췌장의 세제 없는 탈세포화

마우스 췌장 섬의 분리 및 세포 내 cAMP를 결정하는 방법

칼슘 이미징의 목적, 세포 상해 측정 및 아데노 바이러스 감염 췌장 포상 세포의 준비

마우스 기본 췌장 포상 세포의 분리 및 문화

살아있는 췌장 조직 조각에서 아일렛 기능 및 아슬레 면역 세포 상호 작용을 관찰

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사