이 프로토콜은 두 가지 단백질을 표현하는 면역 치료 rhesus T 세포의 생산을 설명합니다: 항 바이러스 키메라 항원 수용체 및 림프모낭세포를 표적으로 하는 화학 요법 수용체 CXCR5. 이 비교적 빠른 9 일 절차는 동물에 주입 후 장기 지속에 대한 잠재력을 가진 덜 분화 중앙 메모리 표현형을 가진 T 세포를 생성합니다. 인간 세포에 이 방법을 적응시키면 항레트로바이러스 약물의 투여 없이 HIV에 대한 지속적인 완화를 유도할 수 있는 면역 치료 용 T 세포의 생산을 허용할 것이다.
이 방법은 관심있는 다른 단백질을 표현하는 rhesus T 세포를 생성하기 위해 광범위하게 사용될 수 있습니다. 그리고 사소한 수정으로, 그것은 인간을 포함하여 그밖 종에 있는 변환된 T 세포를 생성하는 것을 이용될 수 있습니다. 트랜스듀션의 성공은 건강한 자극된 PBMC에 달려 있습니다.
수집, 운송 및 저장에 주의를 기울여야 합니다. 변환하기 전에 세포의 자극을 시각적으로 평가하는 것이 중요합니다. 먼저 기본 rhesus PBMC를 해동합니다.
소량의 얼음만 남아있을 때까지 부드러운 동요와 함께 섭씨 37도 수조에서 세포를 배양하십시오. 세포를 원물 튜브에 부드럽게 피펫합니다. 그런 다음 기본 배지의 1 밀리리터로 바이알을 헹구고 천천히 세포에 추가합니다.
천천히 세포에 따뜻한 기본 매체의 추가 9 밀리리터를 추가합니다. 에어로졸 내성 캐니스터에 튜브를 놓고 원심분리기는 섭씨 22도에서 5분간 600배 g로 배치합니다. 수퍼내티를 흡인하고 소량의 성장 배지에서 펠릿을 재놓습니다.
세포를 계산하려면 10 마이크로리터의 셀을 트라이팬 블루10 마이크로리터에 추가합니다. 챔버 슬라이드를 로드하고 카운터에 삽입합니다. 캡처 버튼을 눌러 셀을 계산합니다.
세포 농도를 부피별로 곱하여 총 세포 수를 계산하고 성장 배지에서 밀리리터당 2백만 개의 세포로 희석합니다. 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도를 위해 안티 CD28을 추가합니다. 그런 다음 안티 CD3 코팅 플레이트에 잘 당 3 ~ 6 백만 세포를 파이펫.
섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 이틀 동안 플레이트를 배양합니다. 원심분리기를 섭씨 32도까지 데우며 2, 000배에서 약 30분간 끓입니다. 한편, 37°C의 수조에서 세럼이 없고 성장매체를 따뜻하게 하고, 섭씨 37도의 수조에서 부드러운 소용돌이로 바이러스를 해동시다.
그런 다음 얼음 위에 놓습니다. 혈청없는 배지에서 소정의 최적의 감염 복합성으로 바이러스를 희석시. 부정적인 대조군 세포를 위해 미디어를 단독으로 사용하여 희석 된 레트로 바이러스의 2 밀리리터를 섬유 네틴 코팅 플레이트의 각 웰에 추가하십시오.
미리 따뜻해진 원심분리기에 플레이트를 마이크로플레이트 캐리어에 놓고 원심분리기를 2시간 000배 g로 놓습니다. 즉시 사용하는 경우 우물에서 바이러스 준비를 흡인하고 성장 배지의 2 밀리리터를 추가합니다. 반전 된 현미경에서 자극 된 PBMC를 확인합니다.
세포는 둥글고 밝아야 하며 빛을 굴절시켜야 합니다. 그(것)들은 또한 자극을 나타내는 응집된 외관이 있어야 합니다. 대상 세포를 수집하고 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기십시오.
성장 매체의 1 밀리리터로 한 번 잘 헹구고 튜브에 추가하십시오. 그런 다음 이전에 설명한 대로 셀을 계산합니다. 32섭씨에서 5분간 600배 g로 원심분리하여 세포를 원심분리하여 세포를 펠렛합니다.
펠릿에서 미디어를 흡인하고 밀리리터 당 150 만 세포의 농도에서 성장 배지에서 세포를 재중단. 각 바이러스 코팅 웰에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가하고 바이러스를 받지 않은 섬유넥틴 코팅 된 우물에 MAC 트랜스듀스 세포를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 32도에서 10분 동안 1, 000배, 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 48시간 동안 배양합니다.
rhesus 세포 및 감마 레트로 바이러스와 함께 작업하려면 실험실 코트 및 장갑과 같은 개인 보호 장비를 사용해야하며 생물 안전 캐비닛에서 작업을 수행해야합니다. 모든 파이펫과 솔루션은 오염제거되어야 합니다. 각 웰의 내용물들을 5밀리리터 파이펫으로 위아래로 피펫하여 세포를 다시 중단하고 50밀리리터 원내 튜브로 옮기다.
각 웰에 성장 매체의 1 밀리리터를 추가하고 파이펫을 위아래로 추가하여 부착 된 세포를 제거하십시오. 그런 다음 이전에 설명된 대로 셀을 계산합니다. 섭씨 25도에서 10분 동안 600배 g의 원심분리.
그런 다음 미디어를 흡인하고 팽창 매체의 세포를 밀리리터 당 백만 개의 세포 농도로 재보힙합니다. 6웰 플레이트의 각 가스 투과성 우물에 셀 5밀리리터를 넣고 웰당 확장 매체의 25밀리리터를 추가로 층으로 정중하게 층화합니다. 그런 다음 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 4일 동안 방해받지 않고 세포를 배양합니다.
우물에서 세포를 수집하려면 세포를 방해하지 않도록 주의하는 20 밀리리터를 제거하고 폐기하십시오. 나머지 미디어를 위아래로 피펫하여 세포를 빼낼 수 있습니다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여 3밀리리터의 미디어로 각각 잘 헹구고 잔류 세포를 수집합니다.
그런 다음 셀 번호와 생존 가능성을 확인하기 위해 계산합니다. 이 프로토콜은 6개의 다른 동물에게서 세포의 변환 그리고 확장을 위해 이용되었습니다. 가스 투과성 우물은 5백만 개의 세포의 시작 밀도로 시드되었고 4일 간의 성장 후 우물당 5,560만 개의 세포의 중간 밀도가 달성되었습니다.
trypan 블루 배제에 의해 모니터링 되는 세포의 생존율에서 유지 되었다 83 받는 사람의 95%프로토콜 에 걸쳐. 유동 세포측정은 변환된 유전자의 공동 발현을 관찰하기 위해 사용되었다. 5일째에는 세포의 중앙값이 CD4-MBL CAR와 CXCR5로 변환되었습니다.
9일째에는 중간식이 47.6%였고, 한 라운드의 트랜스듀션이 있었습니다. 유동 세포측정은 또한 메모리 표현형을 모니터링하는 데 사용되었다. 변환 및 확장 전에, 순진한 중앙 메모리 및 이펙터 메모리 집단을 확인 했다.
순진한 인구는 배양으로 손실되었고 세포는 주로 5 일과 9 일째까지 중앙 메모리 세포였습니다. 전이의 성공은 고품질 시약, 고도로 실행 가능한 세포 및 적정 바이러스뿐만 아니라 프로토콜의 타이밍을 일관되게 따르는 사용에 달려 있습니다. 세포는 면역 요법의 효능을 시험하기 위해 전임상 연구를 위해 동물에 주입뿐만 아니라 이동 및 바이러스 억제 분석서를 포함한 기능적 분석에 사용될 수 있다.
우리는 동물에 있는 CAR와 CXCR5 T 세포의 전임상 시험을 전진하고 곧 HIV 감염한 개별에 있는 이 면역 요법을 시험하기를 희망합니다.
