이는 담배 관련 니코티아나 벤타미안 식물에서 GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법의 데모이다. 이 프로토콜은 식물생산 항체, 항체 융합 및 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있는 대부분의 단백질의 정화 및 시각화를 위해 활용될 수 있다. 이 프로토콜은 대학 작업 실험실에서 연구원과 학생들이 단백질 생산 과정의 대부분의 단계에서 GFP 태그 단백질을 시각화 할 수 있습니다.
흙 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은 뜨거운 물을 토탄 펠릿 위에 부어 완전한 확장을 합니다. 펠릿은 완전히 확장하는 데 몇 분 정도 걸릴 것입니다. 팔레트가 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2~3개의 니코티아나 벤타미안 씨앗을 놓습니다.
이 작업이 완료되면 트레이의 바닥을 덮기 위해 약 0.5 인치의 물을 부어야합니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정하는 것을 잊지 마십시오. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다.
트레이는 허미돔 상단으로 덮여 성장 챔버에 배치해야합니다. 시드 토탄 펠릿은 섭씨 23~25도의 성장챔버에 보관해야 하며, 16시간 사진 주기와 60%의 상대 습도를 유지해야 합니다. 일주일 후, 펠릿에서 추가 식물을 제거하여 각 토탄 팔레트를 한 번의 모종으로 남깁니다.
식물이 2~3주 생후, 각 토탄 펠릿을 수분 조절 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮깁니다. 리터 비료 당 1 그램으로 매일 물 묘목을 계속, 토양을 완전히 건조 떠나지 마십시오. 식물은 5~6주 전에 침투할 준비가 되어 있습니다.
다음 단계는 분젠 버너 옆에 수행해야하며 오염을 방지하기 위해 기본 무균 기술을 적용해야합니다. 당신은 Lb 카나마이신 플레이트가 필요합니다. 밀리리터 카나마이신 농도당 1마이크로그램.
원하는 카나마이신 내성 구조를 수용하고 하룻밤 사이에 재배되는 두 가지 돌연변이 EHA105가 엄격하게 증가합니다. EHA105는 아그로박테리움 2개의 돌연변이의 가장 일반적으로 이용되는 긴장의 한개입니다. 문화를 시작하려면, lb 매체의 10 밀리리터와 원내 관을 채우기, 다음, 10 밀리리터 당 10 마이크로 리터 10 밀리리터 당 카나마이신, 당신은 또한 전자 대장균 오염을 방지하기 위해 리팜피신의 밀리리터 당 2.5 마이크로 그램의 10 마이크로 리터를 추가 할 수 있습니다.
접시에서, 당신은 당신의 새로운 문화를 성장하기 위해 PCR에 의해 검증 된 하나의 고립 된 식민지를 사용합니다. 고립 된 식민지를 선택하고 파운드에 접종. 교란을 셰이커에 놓습니다.
하룻밤 사이에 섭씨 30도, 120~150RPM에서 배양합니다. 다음 날, 아그로박테리움 문화가 0.6에서 0.9에 해당하는 OD600에 끌리면 침투에 사용될 수 있다. 1~2밀리리터 이상으로 OD600을 자란 경우 항생제를 가진 신선한 파운드로 옮겨야 하며 필요한 OD600으로 재배되어야 한다.
적절한 OD600에 한 번 원심분리기의 문화를 배치하여 원심분리기의 균형을 이룹니다. 상온에서 20 분 동안 4, 500G에서 원심 분리에 의해 박테리아를 펠트. 두 샘플 모두에서 는 슈퍼네이트할 수 없습니다.
그런 다음 최종 OD를 0.4로 가져오기 위해 각 펠릿과 하나의 X 침투 버퍼를 다시 일시 중지합니다. 각 IgG 퓨전 구조와 라이트 체인 구조의 동일한 볼륨을 결합하여 각 튜브의 구조당 0.2의 최종 OD를 가져옵니다. 종이 클립과 5~6주 된 벤타미안 식물을 1단계에서 가져 가라.
전개된 클립의 날카로운 가장자리를 사용하여 잎의 첫 번째 표피 층에 작은 구멍을 만듭니다. 잎을 끝까지 뚫지 마십시오. 준비된 Agrobacterium 용액과 부착된 바늘 없이 1밀리리터 주사기를 채우세요.
주사기의 끝으로 이전 단계에서 만든 구멍을 덮습니다. 그리고 잎 뒤에서 부드러운 카운터 압력을 가하면서 천천히 나뭇잎에 박테리아를 주입합니다. 잎의 대부분을 침투하고 잎을 최대 3 ~ 4 번 찌르려고하면 과도한 잎 손상이 단백질 수율을 방해 할 수 있습니다.
주사기에 너무 많은 압력을 가하지 않고 용액이 주입됨에 따라 잎이 어두워지는 것을 지켜보십시오. 침투된 식물 잎은 아래쪽 보기에서 대부분 어둡게 나타납니다. 이 세균용 용액은 구조당 적어도 3~4개의 식물에 충분해야 합니다.
폐기하기 전에 남은 세균용 용액을 자동 복제합니다. 바늘이 없는 침투를 완료한 후 식물을 다시 성장 챔버에 배치하고 매일 물을 계속합니다. 클로로시스, 괴사뿐만 아니라 GFP 형광, 겨울 길이 및 단파 UV 램프에 대한 잎을 관찰했다.
일반적으로 4일과 5일에 잎이 가장 높은 GFP 형광을 보여줍니다. 4~5일 후에 모든 잎을 수확하여 침수 후 잎 재료의 총량을 계량합니다. 당신은 다운 스트림 처리를 위해 즉시 잎 재료를 사용할 수 있습니다, 또는 당신은 그것을 사용할 준비가 될 때까지 마이너스 80섭씨에 동결 할 수 있습니다 다시 성장 챔버에 다시 침수 식물을 배치하고 매일 물을 계속.
클로로시스, 괴사, 침투 부위의 색상 및 잎 조직 사망의 변화를 관찰했습니다. GFP 형광을 위한 관찰된 식물. GFP가 길고 짧은 웨이브 UV 램프 아래에 존재하는 경우.
단백질 발현은 시간이 지남에 따라 증가하며, GFP 구조 의 가장 높은 형광은 일반적으로 4 일과 5 일 사이에 발생합니다. 4~5일 후에 모든 잎을 수확하여 침투 후 총 잎 재료의 무게를 측정합니다. 다운스트림 프로세스에 즉시 사용하거나 사용할 준비가 될 때까지 음의 80도에서 동결하십시오.
블렌딩 공정 중에 버퍼와 블렌더 컵을 얼음이나 섭씨 4도에서 유지해야 합니다. 4단계에서 식물 조직을 예심 블렌더 컵에 넣습니다. 각 PMSF 및 나트륨 아스코르바테 농도를 함유한 냉각 추출 버퍼에서 블렌더 컵에 농도가 있습니다.
블렌더 컵을 블렌더에 놓고 파라 필름의 사전 컷 시트를 가져 와서 블렌더 컵 의 상단에 스트레칭하십시오. 잎 조직을 추출 버퍼와 혼합하여 80을 22 간격으로 상상합니다. 필요에 따라 블렌드 주기 사이에 잘 저어주어야 합니다.
혼합물은 잎 재료의 덩어리없이 균일하게 나타나야합니다. 혼합 된 재료를 비커로 옮기. 교반 바에서 단백질 용해도를 높이고 고체의 강수량을 허용하기 위해 섭씨 40도 를 30분 간 저어줍니다.
깨끗한 비커 위에 맨천 두 층을 놓고 추출물을 부어 큰 잎 파편을 제거합니다. 결국 추출물을 거울 천을 통해 부어 거울 천을 접어 잔류 잎 추출물을 짜냅니다. 추출은 눈에 보이는 미립자 없이 어두운 녹색 으로 표시 되어야 합니다.
추출물을 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 16, 000G에서 4°C에서 20분 동안 추출물을 원심분리합니다. 이것은 남아있는 불용성 물질을 펠렛것입니다.
두 튜브의 균형을 유지하고 로터 뚜껑이 단단히 조여 있는지 확인합니다. 원심 분리 후 펠릿이 보이고, 상설하고, 펠릿을 폐기해야 합니다. 50 밀리리터 주사기와 유리 섬유 필터를 사용하여 상체를 필터링합니다.
나중에 분석을 위해 50마이크로리터의 샘플 및 라벨 원유 추출물을 수집합니다. 20 밀리리터의 시료를 담은 폴리프로필렌 컬럼을 설정합니다. 대상 면역글로불린 유형및 수지에 대한 선호도에 따라 필요한 슬러리의 양을 추정한다.
이 데모에서는 슬러리 3밀리리터를 사용합니다. 일반적으로 1.5 밀리리터 침대 볼륨을 가진 총 슬러리의 3 밀리리터는 항체의 몇몇 밀리그램의 정화를 위해 능률적입니다. 제한된 기둥에 필요한 양의 재일시 슬러리를 조심스럽게 피펫합니다.
열 아래쪽에서 열 콘센트를 열고 대부분의 버퍼가 사라질 때까지 드레인할 수 있습니다. 즉시 10 밀리리터의 워시 버퍼를 1회 위에 PBS로 붓습니다. 이 세척 단계를 두 번 배수하고 반복하십시오.
5단계에서 열에 필터링된 샘플을 적용하고 흐름을 수집합니다. 나중에 분석을 위해 50 마이크로리터의 흐름을 분석합니다. 항체가 수지에 결합하지 않은 경우 유동의 나머지 부분을 저장합니다.
수지 10밀리리터1회 PBS로 두 번 세척하여 특이적이지 않은 결합을 줄입니다. 원하는 경우, 충완이 컬럼을 통해 배수됨에 따라 세척의 50 마이크로리터를 알리쿼트하여 표적 항체가 세척 버퍼로 암시되지 않는지 확인한다. 세척 버퍼가 수지를 통해 실행되는 동안, 125 마이크로리터의 멸균소로 5개의 마이크로 원심분리기 튜브를 설치및 라벨, 용출 버퍼를 중화하기 위한 pH 8의 1개의 어금니 트리스-HCL 1개가 있습니다.
또는 두 개의 어금니 트리베이스의 마이크로리터 30개를 추가하여 더 농축 된 용루를 얻습니다. 용출 하는 동안, UV 빛 시각화에 사용할 수 있습니다. 용출 기간 동안 이 작업을 수행할 필요가 없습니다.
자외선을 사용하는 경우 눈과 피부손상을 피하기 위해 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 용출 단계에서 는 UV 광을 사용할 필요가 없습니다. 천원에 용출 완충제 의 5 밀리리터를 적용하여 항체를 엘테우고 이전 단계에서 지정된 각 튜브에 1 밀리리터 분획을 수집합니다.
20 밀리리터를 적용한 다음 10밀리리터의 세척 버퍼를 적용하여 컬럼을 즉시 재생합니다. 수지는 오랜 시간 동안 산성 환경에 남아 있지 않은지 확인합니다. 용출은 형광으로 나타나야 합니다.
종종 가장 높은 형광은 두 번째 용출에서 볼 수 있지만 추출에서 추출에 이르기까지 다를 수 있습니다. 수지용으로 수지 10밀리리터20%에탄올과 PBS를 세척하고 중간 배수를 허용합니다. 상부를 다시 한번, 다음 열의 바닥을 4도C.280 나노미터에서 흡광도를 측정하여 사진 분광계를 사용하여 항체 농도를 결정합니다.
추가 분석을 위해 각 분획의 음수 80도 및 알리쿼트 50 마이크로리터에 용출을 별도의 튜브에 저장합니다. 일반적으로 단백질 지속 시간은 상당한 효율성 손실 없이 최대 10회 재사용할 수 있습니다. 280 나노미터에서 흡광도계를 측정하여 분광계를 사용하여 항체 농도를 결정하는 특정 세부 사항에 대한 제조업체의 지침을 참조하십시오.
용출액을 영하 80도의 섭씨와 알리쿼트 50 마이크로리터를 별도의 튜브에 저장하여 추가 분석을 위해 추가 분석을 위해 합니다. Zs 페이지에 의한 정제 단백질의 분석은 표준 프로토콜에 따라 수행 될 수있다. GFP를 포함하는 구체의 복제, 침투 및 발현의 성공을 나타내는 결과로 관찰된 형광.
며칠 동안 형광은 4 일과 5 일에 높은 형광으로 점진적으로 증가해야합니다. 단백질 G가 사용되는 경우 컬럼으로부터형 단백질 결합 및 후속 용출은 안정적인 GFP로서 함유된 IgG 융합의 정제를 나타낸다. 그리고 UV 노출 젤, 당신은 사다리의 25KDa와 75KDa 밴드를 볼 수 있습니다.
또한 감소되지 않은 용출 2 샘플을 볼 수 있습니다. 감소되지 않은 용출은 안정적인 GFP 융합으로서 그대로 IgG에서 기대할 수 있는 상대 크기로 형광을 유지합니다. 쿠마시 얼룩 젤에서 감소 및 비 감소 된 샘플 모두 시각화된다.
모든 래더 성분은 볼 수 있으며, 네이티브 단백질 및 IgG 융합은 총 추출물 에서 볼 수 있으며 샘플을 통해 흐르고 있습니다. 워시에는 소량의 IgG 융합이 포함되어 있습니다. 용출 1 및 4개의 함유된 대부분의 단백질은 일반적으로 두 번째 및 제 3용출 단계에서 배제됨에 따라 예상되는 바와 같이 덜 농축된 단백질이 함유되어 있다.
용출 2 비감소는 또한 모든 감소 용출 샘플에 여러 밴드가 존재하는 것을 볼 수 있습니다. 75KDa는 GFP에 대한 무거운 사슬 퓨즈를 나타냅니다. 50KDa는 단독으로 무거운 사슬을 나타내고, 25KDa는 단독으로 라이트 체인을 나타내며, 10 KDA는 프로테아제 억제제의 첨가에 의해 방지될 수 있는 분해를 나타낸다.
이 프로토콜은 원하는 표적 단백질에 융합된 항체의 정제를 위해 사용될 수 있다. 이 과정은 다양한 양의 잎 물질을 수용하기 위해 편집할 수 있으며, 단백질 추출 및 정제 과정의 결론 전, 도중 및 정제 과정의 결론 이후에 단백질 존재의 시각적 판단을 허용합니다. 이러한 방법은 컨트롤로 유용할 수 있으며 기술을 가르치는 목적이 될 수 있습니다.
