이 작품은 BBSRC (BB/1006478/1)에 의해 부분적으로 투자되었다. PRR은 왕립 학회 대학 연​​구 활동의받는 사람입니다.

1. 전략적 고려 사항 <ol><li> microseeding 실험에 사용되는 종자 결정의 선택은 실험의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 시작 부분에 크리스탈 최적화를 위해 다른 시작 지점을 제공 할 수있는 몇 가지 결정 히트를 찾기 위해 도움이됩니다. 상질 결정 교란 다음 또는 시스템이 평형 상태로 복귀 핵화 곳 영역 즉 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성이 있으므로 rMMS 크게 결정 최적화의 필요성을 감소시킨다. 따라서 우리는 첫 번째 결정이 (즉시 최초의 결정이 성장 정지로, 더 정확하게, 또는) 얻을 수있다로 정기적으로 즉시 rMMS을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> rMMS의 초기 라운드, 시드 콘텐츠는 극력 결정질 재료로 만들어 져야한다. 하나의 잘 사용할 수있는 경우 그 결정을 포함, 또는 결정이 작은 경우, 다수의 반복을 설정하는 것이 도움이 될 수 있습니다결정의 공급을 증가하는 (시드 제외) 원본 히트. 그러나, 여러 가지 히트를 얻을 수 있으며, 경우, 종자 결정은 몇 가지 조건에서 수확과 함께 혼합 할 수 있습니다. </li><li> 상 분리를 방지하기 위해, 높은 염 조​​건에서 성장 된 결정을 높은 PEG 조건에서 성장 된 결정 별도로 수확한다. 여러 우물에서 결정이 혼합되어있는 경우, 소금 결정을 줄 가능성이 적습니다 저장 솔루션은 씨앗 서스​​펜션을 선택해야합니다. 예를 들어, 인산염, 황산염, 칼슘, 마그네슘의 고농도는 피해야한다. </li><li> 나중에 프로젝트는, 회절을 향상 한쌍으로 결정을 피하고, 리간드 결합에 적합한 결정을 얻기 위해 서로 다른 단위 세포와 결정을 찾기 위해 중요 할 수있다. 이 단계에서 (예를 들면 최선을 회절하는 것) 가장 적당한 결정 시드 재고를 확인하는 데 사용되어야한다. microseeding의 반복을 라운드는 여기서 만 &quot;최고, 필요&quot;결정은 다음 라운드에 씨앗 주식을 만드는 데 사용됩니다. 가능하면,&quot;이러한 PEG 3000 중립 &quot;침전제는 새로운 결정 연락처를 장려하기 위해 높은 불안정 할 수 있습니다 단지를 구체화 할 수있는 종자 결정을 중지하는 데 사용되어야합니다 소금 솔루션 12. </li><li> 하나의 결정화 조건을 사용하는 고전 microseeding 실험은 유망한 조건의 후속 최적화 동안 식별 다음 종종 도움이된다. 그것은 드롭 당 결정의 원하는 번호를 얻기 위하여 종자 스톡을 희석하는 것이 필요하다. (증가 희석의 씨앗 주식의 일련의 결정화 조건에 추가됩니다) &quot;조합&quot;microseeding 실험 씨앗 주식의 최적의 희석을 찾기위한 빠른 방법입니다. 이 방법은 아래에 설명된다. </li></ol> 2. 시드 재고 준비 <ol><li> 분젠 불꽃을 사용하여 유리 파스퇴르 피펫으로부터 둥근 유리 프로브를 만들. <ol><li> 부드러운 될 때까지 중간 근처 피펫을 가열 한 후 신속하게 불에서 제거하고 끝을 따로 잡아 당겨 끌어. 아래 0.25 mm 이하의 직경 유리를 당겨하는 것을 목표로하고 있습니다. </li><li> 이 약 0.25 mm이며, 간단히 화염에 깨진 끝을 뛰어 점에서 유리 휴식. ~ 825 mm의 직경이 단부에 형성되어있는 유리의 반구 때까지 이것을 반복한다. 이 적절하게 0.01 ~ 1.0 mm의 규모에 단단한 물체에 부딪혀서에 맞는 크기와 그것이 결정 트레이 하위 잘 또는 커버 슬립의 플라스틱 표면을 손상하지 않는 한이 프로브는 결정 성 물질을 분쇄하는 데 유용합니다. 결정이 유리와 플라스틱 사이에 갇혀 있기 때문에 큰 프로브 (~ 1.0 mm)를보다 효율적으로 작은 결정을 분쇄 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 얼음에 시드 비드를 포함하는 1.5 ML의 microcentrifuge 관을 배치합니다. </li><li> 쌍안 현미경 또는 결정 촬상 시스템을 이용하여 미리 설정된 결정화 트레이를 검사하고, 하나 이상의 AP를 선택시드 재고 세대를위한 결정 자료를 수확되는 트레이에서 우물와 적합한. 모든 물질은 미세 바늘, 구정, 미결정 및 불규칙한, 잘못 구성된 결정을 포함하여 사용 할 수 있습니다. 구형 물질이 부분적으로 가교 결합 될 가능성 같이 시드 콘텐츠는 따라서 시드 실험에 사용하기위한 그것의 적합성을 줄여, 가능한 빨리 결정 성장 정지 후에 만​​들어 져야한다. 의심은 수확 될 결정질 재료가 잘은 UV 형광 현미경 또는 이미징 시스템 전에 개구 행을 사용하여 가시화 될 수 있고, 또는 결정 성 물질은 인 - 시튜 X-선 회절 분석을 실시 할 수있다 염 또는 단백질인지에 존재하지 않으면 트레이. UV 조사하에 형광 것이다 갑 접근법 단백질 결정을 사용하는 경우, 염 결정은 무색 나타날 것이다. </li><li> 잘 선택한 결정 트레이를 엽니 다. 96 - 웰 주위에 상단 플라스틱 밀봉 시트를 잘라 드롭 트레이에 앉아에 대한 USI 잘 선택메스의 칼날을 겨. 24 잘 매달려 드롭 용지함 핀셋을 사용하여 커버 슬립을 제거합니다. 커버 슬립을 반전하고 안정된 깨끗한 표면에 놓으십시오. 저장 용액 50 μl를 제거하고 튜브에 걸쳐 얼음에 남아있는 것을 보장 시드 비드를 포함하는 microcentrifuge 관에이 액체를 전송합니다. </li><li> 철저하게 현미경으로 결과를보고, 2.1 절에서 제조 된 유리의 프로브를 사용하여, subwell (96 - 웰 트레이) 또는 커버 슬립 (24 웰 트레이)에 떨어진다 결정을 분쇄. 작은 결정은 철저하게 분쇄하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 이 단계는 실험자 결정들은 염 결정되지 않는 것을 또한 분쇄하기 쉽기 때문에, 가교되지 않으며, 확인 할 수있다. 소금 결정은 듣고 그들이 분쇄 할 때 느낄 수있는 특유의 클릭을 생산하고 있습니다. 결정은 신선한 재료를 획득하고 사용하는 시도를 분쇄하기 힘든 어려운 경우. </li><li> 씨 구슬 튜브와 t의 저장 용액의 5 μl를 제거를 ransfer에 해당하는 하위 아니라 (드롭 실험에 앉아), 또는 커버 슬립 (낙하 실험을 거는) 수확되는 결정 성 물질을 포함한다. 가능한 한 하위 잘 또는 커버 슬립 내용의 많은 부분을 재현 탁이 액체 위아래로 5 ~ 6 시​​간을 피펫. 씨 구슬 튜브에 서스펜션을 반환하고 많은 결정 물질을 가능한 한 수확하는 것이 보장, 두 번 더이 단계를 반복합니다. </li><li> 얼음에 튜브를 냉각하기 위해 매 30 초 정지, 2 분 씨 구슬을 소용돌이. </li><li> 4 각 단계에서 10의 요인에 의해 저장 솔루션의 씨앗 주식을 희석, 희석 시리즈를 확인합니다. 일반적으로, 너무 많은 결정을 희석 씨의 주식을 사용할 때 얻을, 잘 당 결정의 수를 제어하기 위해 희석 씨의 주식을 사용합니다. 씨앗의 농도보다 더 결정화 히트 수득되기 때문에 rMMS의 첫번째 라운드에서는, 시드 원​​액을 희석하지 않는 것이 중요하다. </li><li> 그것은 즉시 주를 사용할 수없는 경우ately, -20 ° C에 씨앗 주식 서스펜션과 희석 씨의 주식을 전송하거나 저장 -80 C 냉장고 °. 작은 양 분량 씩, 즉 10 ~ 20 μL에이 물질을 저장, 씨앗 주식의 효능을 감소시킬 수있는, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지합니다. 냉동하면 필요할 때까지, 씨앗 주식은 무기한으로 유지 될 수있다. </li></ol> 3. 결정화 트레이 설립 <ol><li> 결정화 설비와 실험자의 환경의 상황에 따라, rMMS 결정화 스크리닝 앉아 드롭 기상 확산법을 이용하여 걸려 드롭 기상 확산법을 이용한 24 - 웰 트레이, 또는 96 - 웰 트레이를 사용하여 수행 될 수있다. rMMS위한 결정화 트레이 로봇 디스펜서 처리 액체, 또는 둘의 조합을 이용하여, 손으로도 설정 될 수있다. </li><li> 손으로 설정 전형적인 rMMS 실험, 1.0 ㎕의 단백질 용액, 1.0 ㎕의 결정화 조건을 포함하고합니다0.5 ㎕의 씨앗의 주식. 결정화 로봇을 사용하여 설정 전형적인 실험은 0.3 ㎕의 단백질 용액, 0.2 ㎕의 결정화 조건, 0.1 ㎕의 씨앗 주식을 포함 할 것이다. </li><li> 24 웰 드롭 트레이 걸려 rMMS 검사를 수행하려면, 첫째, 수동 피펫을 사용하여, 4 × 24 웰 pregreased 결정의 각 웰에 10 ㎖ 단일 튜브 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 300 μl를 전송 트레이. <ol><li> 모두 전면과 후면 보호 역행 스트립 제거 된 해당 플라스틱 커버 슬립의 표면에 각각 300 ㎕의 저수지에서 각 결정화 조건의 양도 1 μL. </li><li> 각 결정화 조건의 1 μL로 결정 씨앗 주식의 0.5 μL 다음에 단백질 용액 1 μl를 추가합니다. 액체의 드롭 하향 잘 적절한 위에 위치되도록 각 coverslip에 전환. </li><li> 아래로 coverslip을 눌러, seali를 압축그리스를 겨 안전한 실을 형성한다. 일단 96 방울을 설립, 트레이는 일반적으로 스토리지에 대한 범위 4-18 °의 C에서 인큐베이터 또는 일정한 온도의 방에 전송해야합니다. </li></ol></li><li> 96 - 웰 드롭 트레이는 먼저 각각의 결정화 트레이 잘 대응에 깊은 우물 블록 형식의 96 - 웰 조건 결정화 화면에서 각 조건의 20 ~ 50 μl를 전송 앉아 rMMS 검사를 수행합니다. 이 전사 공정은 8 - 채널 피펫을 사용하여 결정화 로봇 또는 수동 전송로를 사용하여 수행 될 수있다. <ol><li> 손으로 또는 3.1에 ​​설명 된 볼륨을 사용하여 로봇 방울로 전송 저수지, 단백질과 씨앗 주식 솔루션을 제공합니다. 일부 상용 결정화 로봇은 분배를 접촉하지 않고, 이러한 시스템을 사용하여 성능의 씨앗 주식 전송 조언, 관련 배관 분배의 막힘의 원인이 될 수 있습니다. 분배의 순서는 변수 : 일부 로봇은 동시에 모든 솔루션을 분배. 면다음 주식을 배정 저수지 후, 최초의 단백질을 분배 이것은 불가능합니다. </li><li> 로봇을 분배 접촉 무딘 바늘로 장착되어 낮은 볼륨 유리 주사기를 사용하여 씨앗 가능한 전송되지 않습니다. 각 드롭에 씨앗 주식을 분배 저장 솔루션을 통해 전달하여 바늘을 씻어. </li><li> 투명 밀봉 시트를 사용하여 트레이를 밀봉하고 인큐베이터 또는 저장을위한 일정한 온도의 방에 전송할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 4. 결정화 트레이의 검사 <ol><li> 쌍안 현미경 또는 수정 이미징 시스템을 사용하여 모든 결정화 실험을 시각화. 전자는 일반적으로 뷰 깊이 이상의 사용자 큰 제어 및 후자보다 배율 수준을 수득하지만, 더 많은 시간이 걸린다. </li><li> 순서대로 각 sub-well/coverslip를 검사하고 수정 형성의 증거를 기록. 실험마다 24 설립 다음 5 일 동안 시간과 검사해야N 이후에 한 번, 최대 4 주 동안 매 7 일마다. </li><li> 최적의 회절 품질 결정이 생성되기 전에 rMMS의 여러 사이클은 종종 필요합니다. </li></ol>

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	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. 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Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

우리는 공개 아무것도 없어.

본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용...

페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 1, 2에 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 - 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향. 시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 4-7의 숫자, 크기 및 품질을 향상시키기위한 가능한 방법으로 사칭되었다. 이 방법은 결정 핵 생성을 지원 조건이 후속의 결정 성장 및 그 반대를위한 최적이 아닐 수 있다는 전제에 기초한다. 다른 하나의 조건에서 핵 물질을 이동하여, 하나는 효과적으로 이러한 프로세스를 분리하는 새로운, 아직 미개척 결정화 공간에 따라서주는 접근을 시도 할 수 있습니다결과적으로 스크리닝 실험의 성공률을 증가시킬 수있다. 정해진 방법은 일반적으로 예를 들어 사용하는 지향성 압력의인가에 의해 얻어진 (I) macroseeding 다른 8 개의 조건에서 그 전체 단결정의 이동, (II)을 연속 시드, 핵 물질의 이동, 문서화 된 새로운 결정화 드롭 9, 그리고 (iii) &quot;고전적인&quot;microseeding 통해 수염의 후속 통과 한 다음 기존 결정의 표면에 고양이의 수염은, 수확에 의해 생성 된 결정 &quot;씨앗&quot;의 전송 결정 (또는 결정을 분쇄 씨앗 10를 산출하는 것과 유사한 조건에 자료). 특히 이러한 방법의 세 가지 확실히 현대 액체 처리 결정화 로봇과 달성 가능한 비교, 시간과 제대로 확장됩니다. 이러한 요소는 인식에, 적어도 어떤 수준에 기여하는 씨앗ING는 다른 접근이 결실을 맺기에 실패한 경우에만 방문 할 수있는 방법입니다. 임의의 행렬 microseeding (rMMS)는 높은 처리량 검사 및 확장 성을 11 ~ 13 그 전통 microseeding의 장점을 결합하여 최근의 방법 론적 혁신입니다. 이 방법은 표준 96 - 조건 결정화 화면 내의 각 sub-well/coverslip에 /로 분주 할 수있다 유핵 결정 성 물질에서 생산 된 종자 주식의 생성에 의존합니다. 이 방법은 두 손으로 또는 24도 또는 96도 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 증기 확산 실험을, 앉아 또는 교수형에 적용 할 수있다. rMMS 크게 결정화 성공률을 증가시키고, 더 큰 회절 질 및 양으로 18, 13, 14의 결정을 생성하기 위하여 실험적으로 증명하고, O에 접근 결정 학자 &#39;병기 혁신적인 공구를 나타내고있다결정화 성공을 향한 노력을 ngoing. 여기에서 우리는 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명하고이 기​​술의 효과를 보여주는 샘플 데이터를 제공합니다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 - 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.

rMMS 실험 (A) 예 rMMS 검사의 효과를 입증하기 위해 우리는 암탉의 달걀 흰자위 라이소자임 (HEWL)과 소 간 카탈라제 (BLC)의 결정화에이 방법을 적용했다. 이 효소는 저명 결정화하고 구조적으로 잘 대상 (15, 16)를 특징으로 두. 등 모두 rMMS로 달성 향상된 결정화 성공률을 설명하기 위해 우수한 시험 과목을 제공하기 때문에. 결정화 실험은 96 - 웰 액체 처리 로봇을 사용하여 ...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.7K 조회수.  University of Bristol.  여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다. 

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Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

액상 복구와 분자량 기반 분류에 대한 GELFREE 8100 분획화 시스템을 사용하여

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

연구

생물학

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

전자 Crystallography에 의해 구조 생물학 연구에 대한 작은 막 단백질의 2 차원 결정화 평가판을 평가

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X - 선 Crystallography에 대한 단백질 결정화

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Zymography의 기능 매트릭스 Metalloproteinases의 감지

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Lipidic Mesophases의 막 단백질의 결정화

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Lipidic Bicelle 방법을 사용하여 막 단백질의 높은 처리량 결정

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

MBP 기반 태깅 전략에 의해 Mgm101 재조합 단백질의 제조

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

살아있는 세포의 단백질 조각 보완 분석 (PCA)에 의해 게놈 전체 단백질 - 단백질 상호 작용 상영

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...