연속 결정학 실험은 어려울 수 있습니다. 그들의 관행에서 중요한 장애물은 미세 결정질 샘플의 생성입니다. 이 프로토콜은 이러한 샘플을 안정적으로 만들 수 있는 방법을 보여줍니다.
이 방법은 엔도티아펩신을 사용하여 소량 증기 확산 플레이트에서 성장한 큰 결정을 대량의 미결정 슬러리로 최적화하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 우리는 이 프로토콜이 보편적으로 성공할 것이라고 주장할 수 없습니다. 그러나 우리는 여기에 제안된 아이디어와 방법이 다른 사람들에게 다른 단백질에 적용할 수 있는 실험적 틀을 제공하기를 바랍니다.
먼저 Formulatrix 로봇을 사용하여 결정화 완충액으로 2 드롭 96웰 플레이트를 준비합니다. 액체 취급 로봇 믹스를 사용하여 각 웰에서 갓 해동된 엔도티아펩신 150나노리터와 결정화 완충액 150나노리터를 혼합합니다. 플레이트를 밀봉하고 Formulatrix Hotel 내부에서 결정이 24시간 동안 자라도록 합니다.
24시간 후, 결정을 분해하고 96-웰 결정화 플레이트의 5개의 웰로부터 제거한다. 얼음 양동이에 넣은 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 있는 250마이크로리터의 결정화 버퍼에 넣습니다. 1mm 크기의 유리 구슬 10-15개를 원심분리기 튜브에 추가합니다.
결정체와 구슬을 1000RPM에서 30초 동안 소용돌이치고 얼음 위에서 30초 동안 교체합니다. 그런 다음 씨앗을 바로 사용하거나 섭씨 영하 20도에서 보관할 수 있습니다. 형태 그램 실험을 수행하기 위해, 2 드롭 96 웰 그리드 스크린의 플레이트 컬럼을 따라 pH 7 및 0.15 몰 염화 마그네슘에서 1 몰 Tris-HCl과 함께 PEG 6000의 5 내지 40 % 농도를 8 단계에 걸쳐 밀리리터 당 100 내지 12.5 밀리그램의 0.1 몰 나트륨 아세테이트에서 엔도티아펩신의 순차적 희석을 수리한다.
그런 다음 각 희석액 8마이크로리터를 피펫팅한 후 2마이크로리터의 종자 스톡을 액체 취급 로봇 플레이트에 넣습니다. 액체 처리 로봇을 사용하여 엔도티아펩신의 각 희석액 150나노리터를 스크린의 서브 웰 1과 2에 분배합니다. 서브 웰 2에서 해동 된 종자 스톡 50 나노 리터와 웰 용액 100 나노 리터를 다중 흡인하고 둘 다 단백질 용액에 분배합니다.
결정화 완충액 또는 결정화 완충액을 첨가하고 시드 혼합시 용액을 3회 혼합한다. 이제 첫날의 0, 3, 6, 12, 18, 24시간에 접시와 이미지를 첫 주 동안 매일, 다음 4주 동안 매주 섭씨 20도에서 밀봉합니다. 24시간 후, 현미경으로 플레이트를 보고, 각 웰 내의 결정의 수를 추정하고, 결정의 샘플을 측정한다.
제공된 형태소 생성기 워크시트에 이러한 추정치를 기록합니다. 엔도티아펩신과 PEG 6000의 시작 농도를 적절한 상자에 입력합니다. 워크시트는 X축과 Y축에 각각 침전제와 단백질 농도가 있는 기존 위상 다이어그램 형식으로 결과를 자동으로 표시합니다.
시드된 방울에서만 결정을 생성하는 우물 조건은 다이어그램의 MetaStable 영역을 나타내는 반면, 시드된 방울과 시드되지 않은 방울 모두에 결정이 있는 조건은 핵 형성 영역을 나타냅니다. 형태소 분석기 분석에서 24 웰 플레이트로 스케일링하기에 가장 유망한 조건을 선택합니다. 그런 다음 엔도티아펩신 밀리리터당 100mg과 35% PEG 6000으로 시작하십시오.
35 % PEG 6000, pH 7의 0.1 몰 Tris-HCl 및 0.15 몰 염화 마그네슘으로 5 밀리리터의 결정화 완충액을 준비하십시오. 이제 0.5 밀리리터의 결정화 완충액을 기름칠 된 24 웰 교수형 드롭 플레이트의 3 웰에 넣습니다. 유리 커버 슬립에 15 마이크로 리터의 엔도 티아 펩신과 15 마이크로 리터의 결정화 용액을 혼합합니다.
용액을 웰 위에 놓고 플레이트를 24 시간 동안 그대로 두십시오. 24 시간 후, 현미경으로 플레이트를보고, 방울의 결정 수를 추정하고, 크기를 측정하십시오. 결정이 정확하지 않은 경우 이 단계를 반복하되 결정 핵 형성이 충분히 높지 않으면 단백질 농도를 변경하거나 씨앗을 추가합니다.
더 높은 농도의 PEG 6000에 종자를 추가하여 24웰 스케일링 실험을 반복합니다. 0.5 밀리리터의 새로운 결정화 완충액을 그리스로 칠한 24-웰 행잉 드롭 플레이트의 3개의 웰에 넣는다. 유리 커버 슬립에 15 마이크로 리터의 엔도 티아 펩신을 놓고 5 마이크로 리터의 종자 스톡과 10 마이크로 리터의 결정화 용액을 엔도 티아 펩신 용액과 혼합합니다.
덮개 슬립을 뒤집어 우물 위에 놓고 24시간 동안 그대로 두십시오. 방울을 다시 확인하여 결정이 더 작고 농도가 더 높은지 확인하십시오. 방울의 결정 수를 추정하고 크기를 다시 측정하여 이제 올바른 크기인지 확인합니다.
시드 배치 프로토콜을 수행하기 위해 40% PEG 6000, pH 7의 0.1몰 Tris-HCl 및 0.15몰 염화마그네슘의 결정화 완충액을 준비합니다. 50 마이크로 리터의 종자 스톡과 100 마이크로 리터의 결정화 용액을 미리 혼합하고 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에서 단백질 용액과 혼합합니다. 튜브를 10초 동안 소용돌이치고 섭씨 20도의 로커나 셰이커에 놓습니다.
20분마다 배치 용액의 2.5마이크로리터 분취량을 취합니다. 혈구계를 사용하여 결정의 크기와 수를 모니터링합니다. 결정의 수를 세고 현미경으로 크기를 측정하십시오.
결정이 약 15 미크론 치수에 도달하면 0.5 몰 Tris-HCl, 0.075 몰 염화 마그네슘 및 20 % PEG 6000으로 보충 된 0.5 몰 아세트산 나트륨 150 마이크로 리터로 반응을 소멸시킵니다. 혈구계를 사용하여 결정 크기와 농도를 다시 확인하십시오. 크리스탈을 섭씨 20도에서 보관하십시오.
엔도티아펩신 형태도 분석은 핵형성이 단백질과 침전제 농도 모두에 의해 영향을 받는다는 것을 시사했습니다. 다이어그램의 MetaStable, 핵 형성 및 침전 영역을 잘 구분할 수 있습니다. 씨앗을 추가하면 씨앗이없는 방울에 비해 결정 수가 크게 증가했습니다.
200 내지 300 마이크로리터 부피의 엔도티아펩신 미세결정화의 분석은 시간 경과에 따른 결정 핵형성 및 가장 긴 차원의 변화를 밝혀냈다. PEG 농도를 35 %로 증가시키면 최종 결정 농도가 약 3.6 배 10에서 밀리리터당 6 배이고 가장 긴 결정 치수가 42 마이크로 미터로 결정화가 현저하게 향상되었습니다. 최종 결정의 크기를 줄이기 위해 단백질 농도 감소 접근법이 적용되었는데, 이는 불행히도 결정 농도를 크게 감소시켰고 궁극적으로 더 큰 결정을 생성했습니다.
그러나, PEG 농도를 40 %로 증가시키는 접근법은 약 3.1 곱하기 10에서 밀리리터 당 6 및 약 39 마이크로 미터의 크기를 산출했다. 또한, 종자를 첨가하면 결정 농도가 약 1.1 배 10에서 밀리리터 당 8로 크게 증가하고 약 4.2 마이크로 미터의 더 작은 치수가 발생했습니다. 결정화 반응에서 시도된 담금질 효과는 약 2.6 배 10 내지 6 밀리리터 및 약 15 마이크로미터의 크기를 나타내었다.
X선 데이터로부터의 분해능에 대해 플롯된 CC 반은 결정 분해능이 10 마이크로리터에서 200 내지 300 마이크로리터 부피로 약간 감소한 것으로 나타났다. 그러나 결정은 여전히 1.5 옹스트럼으로 회절되어 충분한 것으로 간주되었습니다. 엔도티아펩신은 작용하기 좋은 단백질입니다.
우리는 이 엔도티아펩신 프로토콜을 시도하는 것이 다른 단백질에 대한 유용한 아이디어와 방법을 생성할 수 있기를 바랍니다. 특히 결정학의 경우 서면 프로토콜만 따르기보다는 사물이 어떻게 보이고 느껴지는지 확인하는 것이 좋습니다. 이 영상이 그 느낌을 조금이나마 줄 수 있기를 바랍니다.
