이 작품은 (BV에) 브리티시 컬럼비아 대학에서 재학하고 (DPS에) 건강 연구의 낭포 성 섬유증 캐나다와 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 프로토콜의 초기 준비를 위해 재클린 정 감사합니다.

1. 문화의 성장 (일 1 +2) <ol><li> 밤새 37 ° C의 회전에 스냅 상위 15 ML 튜브에 루리아 베르 타니 (LB) 국물 3 ㎖ : 스타터 문화를 성장. OD 0.6의 600 하룻밤 성장을 희석. 250 ㎖의 삼각 플라스크에 LB 액체 배지 100 ㎖에이 희석 1 ML을 추가합니다. 더 나은 약을, 고정상 (SP)에 16 시간 동안 250 rpm으로 진탕 37 ° C에서 알을 품다 배치 문화, 감염 조건과 같은 업무를 간소화하고 쿼럼 정지상 신호 요인의 통제하에 그 박테리아 독성 요인을 보장하기 위해 감지, 표현된다. 대안 적으로, 초기 SP 또는 중간 또는 늦게 대수 성장 단계에서 박테리아 박테리아 적응 위상에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. </li><li> 16 시간이 OD 600을 측정하고 확인 후 문화는 동일한 조건에서 이전에 생성 된 성장 곡선과 비교하여 SP에 도달하였습니다. </li></ol> 2. 단백질 추출 (3 일) <ol><li&gt; 하룻밤 냉장고에 미리 모든 미디어 및 솔루션을 풀어. 모든 단계는 얼음 양동이에 튜브와 함께 수행되어야한다. 마이크로 원심과 베크만 쿨터 고성능 원심 분리기 (또는 이에 상응하는 금액) 4 ° C에 내부 로터 (회 전자 = JA-20, 원심 분리기 = J2-HS) Prechill. </li><li> 신선한 0.1 M 페닐 메탄, 불화 PMSF ( &#39;주의&#39;PMSF가 사용 얼굴 방패와 장갑 독성과 부식성이)입니다 ( &#39;주의&#39;아세톤 아세톤 1 ㎖에서의 0.0174 g을 용해하여 아세톤 (PMSF, 174.19 g / 몰) 솔루션을 준비합니다 독성 및 가연성) 얼굴 방패와 장갑을 사용합니다. </li><li> 0.1 ml의 0.1 M PMSF, 0.5 M EDTA 0.1 ml의 PBS의 9.8 ML : PBS / EDTA / PMSF 솔루션을 구성한다. 이 SP에 있어야 할 곳에 16 시간 문화의 OD는 약 확인합니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 4,500 × g에서 오크 릿지의 원심 분리기 튜브와 원심 분리기 문화 박테리아 문화와 전송의 35 mL를 취하여 </li><li> 폐기물 용기에 상층 액을 제거하고냉각 PBS의 35 ML을 추가하고 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 20 분 동안 4,500 × g에서 4 ℃에서 </li><li> 차가운 PBS 1 ㎖에 뜨는에 resuspend를 제거합니다. 2 ㎖ 에펜 도르프, 4 ℃에서 14,000 × g에서 마이크로 원심 높은에 원심 분리기 1 분 멸균로 전송 제거하고 상층 액을 버린다. </li><li> PBS / EDTA / PMSF 용액 1 ㎖를 추가, 2 ㎖에 펠릿 및 전송 ~ 0.5 ㎖의 유리 구슬 (presterilized)를 포함 (O-링) 캡 튜브를 나사를 resuspend. 유리 구슬과 구슬 차가운 방에서 1 분 동안 4 ° C에서 그들을 비난이 들어있는 튜브에 다시 중단 펠렛을 추가합니다. 각 강타 후 얼음에 샘플을 넣고,이 배를 수행합니다. </li><li> 마이크로 원심에서 1 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 뜨는을 제거하고 멸균 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 넣어. </li><li> 수율이 같은 튜브에 PBS / EDTA / PMSF 용액 1 ㎖를 추가 높이려면 다시 유리 구슬을 포함한다. 구슬 bash는 1 분 4 ° C에서 튜브. 이 배는 얼음 AF에 샘플을 넣어 마십시오타 강타. 원심 분리기의 한 분 14,000 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 제거하고 단계 2.8에서 뜨는을 추가 할 수 있습니다. 새로운 멸균 2 ㎖ 에펜 도르프 튜브에 폴리스티렌 튜브에서 1 ML의 주사기와 0.20 μm의 필터 뜨는을 사용합니다. </li><li> 이때 시료는 피어스 MicroBCA 단백질 추출 키트 및 200 μg의 분취 량을 사용하여, 단백질의 양에 대해 분석한다은 냉동되어야 -80 ° C까지 필요한. </li></ol> 3. 샘플 준비 (4 일) <ol><li> 25 ml의 수분 보충 주식 솔루션을 준비합니다 (8 M 요소, 2 % CHAPS, 2 % IPG 버퍼, 블루 0.002 % 브로 모 페놀) -20 ℃에서 2.5 ㎖를 분취에 저장 수분 보충 원액 2.5 ㎖를 분취에 사용하기 바로 전에 7 MG 디티 오 트레이 톨 (DTT, 154.2 g / 몰)를 추가합니다. </li><li> 프로세스 단계 3.1에서 제조 한 수분 보충 원액 450 μL의 최종 재 부상과 장비를 2-D 클린을 사용하여 단계 2.10에서 샘플을 해동. </li></ol> 4. 처음으로집중 차원 등전점 (IEF) (주 4) 이 섹션의 모든 단계는 Ettan IGPhor IEF 시스템을 사용하고 있습니다. <ol><li> IPG 첫 번째 차원 스트립 설정 : 지구 청소 솔루션으로 깨끗한 스트립 홀더를 한 후 건조 거꾸로두고, 밀리 Q 물에 씻는다. 겔 스트립 홀더 번호로 각 샘플을 할당합니다. </li><li> (-) 끝에서 두 번째 넓은 지역에서 재수 단계에서 샘플을로드합니다. 포장 중 젤 스트립을 당겨 깨끗한 집게를 사용합니다. 겔 스트립에서 보호 층을 가지고. (+) 끝과 끝 (-) 선에서 길을 따라 젖은 스트립을 얻을 수있는 느린, 슬라이딩 동작으로 거친면을 제거합니다. </li><li> 소모를 방지하기 위해 전극 위에 겔 스트립에서 멸균 물에 젖은 모래 바닥 용지를 넣습니다. 정제수, 에탄올와 라운드 사이에 핀셋을 씻어. 모든 거품을 제거 건조 아웃을 방지하기 위해 미네랄 오일을 얇게 오버레이. 시스템에 겔 스트립 홀더 라인. </li><li> rehyd 20 ° C에서 12 시간을 실행식량, 200 V에서 1 시간, 500 V에서 1 시간, 1,000 V에서 1 시간, 4,000 V에서 0.5 시간, 8,000 V에서 12 시간, 300 V 및 24 시간 파악이 시간에 밖으로 가지고 갈 수있다. </li><li> IEF가 완료된 후 IPG 스트립 향후 분석을 위해 미네랄 오일로 코팅 사란 랩 -80 ° C에서 동결되지 않는 한, 그것은 제 차원 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동을 수행하는 것이 추천된다. 대안으로 인해 DTT 액세스 포인트에 스트리킹을 피하기 위하여는 IPG는 요오도 아세트 아미드를 포함하는 완충액으로 종래 초 차원 스트립 제 평형화 단계를 더 포함 할 수있다. </li></ol> 5. 두 번째 차원 SDS-폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (5 일) 이 섹션의 모든 단계는 Ettan DALTsix 전기 영동 장치를 사용하고 있습니다. <ol><li> 젤 캐스터 장치를 조립하기 위해, 철저하게 모든 구성 요소를 청소하고 있는지 확인 겔 캐스터 수준 및 바인딩 회색 고무 실리콘 젤로 윤활된다. 블랙 마찰을 넣어바닥에 삼각형 마개를 발상지. 그런 다음, 교대 유리 전면을 마주의 짧은 플레이트를 분리하고 유리판을 배치합니다. 구분은 뒷면과 앞면에 있는지 확인합니다. 필러 (약 5 매)에 남아있는 공간을 채우기 때문에 정상은 평평하다. 외부에 레드 팁에 전면 패널을 넣어. 사용은 각 측면을 강화하고 하단 나사를 조여 클램프. </li><li> 젤 준비 : Duracryl의 297.3 ML을 추가, 트리스 버퍼의 147 ml의 1.5 M 산도 8.8, 진공 팁이 포함와 플라스크에 밀리 Q 물 143.3 ㎖ ( &#39;주의&#39;Duracryl 독성 사용 얼굴 방패와 장갑입니다) 교반 막대. 상단에 뚜껑을 넣고 20 분간의 진공 적당한 속도로 솔루션을 섞는다. 진공이 용액을 탈 가스보기 위해 사용된다. 밀리 Q 물 2 ㎖에 APS 0.2 g : 황산 암모늄 용액 (APS, 218.8 g / 몰)의 새로운 10 %를합니다. </li><li> 겔 캐스터 겔 혼합물을 추가 : 진공이 완료되면 10 % 황산 도데 실 나트륨 6 ㎖ (SDS, 228.38 g / 몰) 부가플라스크의 측면에 솔루션에 더 많은 거품을 가하고 방지 할 수 있습니다. , APS를 추가 저어 &#39;, N&#39;-테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED, 116.20 g / 몰)을 0.25 ㎖의 N, N, N을 추가합니다 (&#39;주의 &#39;TEMED 가연성 사용 얼굴 방패와 장갑입니다) 및 교반. </li><li> 장치의 뒷면에 삽입 된 깔때기를 통해 젤 캐스터로 젤 혼합물을 부어. 짧은 플레이트 아래 인치까지 붓는다. 젤의 상단에 물 포화 부탄올 1.5 mL를 넣고 탈수를 방지하기 위해 사란 랩으로 정상을 감싸줍니다. 전체 중합을 보장하기 위해 1 시간 동안 기다립니다. </li><li> 젤을 확인 : 젤이 (플라스크 확인) 완료되면, 싱크 겔 캐스터를 분해. 따뜻한 물 유리 접시를 세척하는 동안 젤 무결성 확인, 물이 판을 입력 할 수 없습니다. 부탄올을 붓고 부탄올를 제거하기 위해 물로 2 회 젤의 상단을 씻어. 다시 물에 정상을 입력하고 젤을 바로 사용하지 않으면 앉아 보자. </li><li> 스트립을 준비 :에서 평형 완충 용액을 준비냉동고 (6 M 우레아, 75 MM 트리스 - 염산의 pH 8.8, 29.9 % SDS, 블루 0.002 % 브로 모 페놀). 이 -20 ℃에서 preprepared 및 10 ㎖ 분량 씩 저장할 수 있습니다 평형 완충액 10 ml로 DTT 0.1 g을 녹이고. 하나의 튜브는이 IPG 스트립을 위해 사용될 수있다. 버퍼에 내려 스트립 얼굴의 젤을 넣고 30 분 동안 앉아 보자. 어떤 어떤 말을 기억하십시오. </li><li> 전기 장치 (2-D 분리 장치)를 준비한다 : 1x 전기 영동 버퍼 (25 MM 트리스 자료 [121.1 g / 몰], 192 mM의 글리신 [288.38 g / 몰], 0.1 % W / V SDS [288.38 4.5 L 추가 g / 몰]) 실행중인 탱크. 이 버퍼는 3 배까지 사용될 수있다. 전기 영동 장치를 켭니다. 물 냉각 시스템의 수위를 확인하고이 낮 으면 물을 채워. 10 ° C.해야 지정된 온도를 확인 키를 눌러 모드에서 컴퓨터를 켭니다 </li><li> 배 실행 버퍼의 1 L 버퍼를 실행의 1 배 1 L를 확인하고 4 ℃에서 보관 무게 agaros 0.25 G : 아가로 오스 밀봉 솔루션 확인전자 및 1X 실행 버퍼 50 ㎖에 용해. 15 초마다 펄스. </li><li> 전기 장치 설정 : 사용 핀셋 각 스트립을 꺼내 깨끗한 종이 타월로 양쪽에 여분의 버퍼를 제거 할 수 있습니다. 스트립을 만지지 마십시오. 젤 위에 물을 붓고 1X 실행 버퍼 젤 톱 라인. 깨끗한 핀셋을 사용하여 겔 측면쪽으로 향, 긴 접시 위쪽에 스트립을 배치합니다. 그것을 윤활 스트립에 1X 버퍼를 추가합니다. 슬라이드 스트립 더 아래 플라스틱 스트립을 사용하여. 지구와 젤 사이에있는 모든 거품을 제거합니다. </li><li> 그것을 밀봉 스트립의 상단에 아가로 오스 밀봉 솔루션을 추가합니다. 스트립의 나머지 부분에 대해 반복합니다. 젤 탱크에 유리 겔 크래들에 젤을 포함하는 플레이트와 하부를 놓습니다. 외부 챔버에 1X 버퍼 수준에 다락방을 놓기 전에 지정된 맨 아래 줄에 있는지 확인하십시오. </li><li> 유리판 위에 상부 버퍼 챔버의 프레임을 배치하고 모든 서호주 확인바닥을 아래로 눌러 Y 다운. 깔때기를 사용하여 중간 선까지 상부 챔버에 2 배 실행 버퍼를 추가합니다. 깔때기를 사용하고 베스트 라인에 도달 할 때까지 외부 챔버에 1X 실행 버퍼를 추가합니다. 상단에 뚜껑을 배치하고 전기 장치와 파워 팩의 전원을 켭니다. </li><li> , 52 V에서 하룻밤 96mA, 5 W. 현재는 상단에있는 실버 와이어에 거품을 찾아가는 경우 검사를 실행합니다. 최고의 선이 바닥에서 1cm 때까지 젤을 실행합니다. </li><li> 단백질은 제조자의 지시에 따라, 장비 및 다른 회사와 같은 BIORAD 또는 호 우퍼에서 시약을 사용하여 분석 할 수있다. </li></ol> 6. 젤 시각화를위한 젤의 실버 스테 이닝 (일 5-6) <ol><li> (플라스틱 양동이에 800 ㎖의 에탄올, 200 ㎖의 아세트산 및 흄 후드에서 밀리 Q 물 1,000 ml)을 수정 솔루션 1을 준비합니다. 해결 방법 6 젤 좋다. 오프 모든 컴퓨터의 전원을 켜고 전기 장치와 PU의 전체 중간 부분을 가지고싱크대에 게요. 또한 싱크대에 흰색 스탠드를 넣어. 2X 실행 버퍼를 포함하는 상부 트레이를 잡아 당깁니다. </li><li> 장치를 분해 및 수정 솔루션 1에 유리 접시에서 젤을 제거합니다. 젤 그들이 유리판으로부터 제거 될 때 코너를 절단에 의해 식별 될 수 있고, 모서리의 개수는 캐스터의 겔의 순서에 대응 잘랐다. </li><li> 적어도 1 시간에 4 박 ° C에서의 로커에 수정 솔루션 및 젤과 용기를 올려 </li><li> (50 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde), 에탄올 600 ㎖, 5 칼륨 tetrathionate의 G (302.46 g / 몰), 136 아세트산 나트륨 (82.03 g / 몰)의 G, 그리고 밀리 Q 물에 20 ㎖를 해결 방법 2를 해결하기 위해 젤로 이동 2,000 ml)에 1 시간 동안 로커에 장소. </li><li> 젤이 밀리 Q 물에 15 분마다 4 배 씻으십시오. </li><li> 30 분 또는 최대 48 시간 동안은 질산염 용액 (2,000 ML에 질산은 (169.87 g / 몰), 포름 알데히드 500 μL, 그리고 밀리 Q 물 4g)에 젤을 얼룩. </li><li> 1 젤을 씻으분 밀리 Q 물에. </li><li> 5-30 분 (2,000 밀리리터에 탄산나트륨 60g (105.99 g / 몰), 포름 알데히드 300 μL, 티오 황산나트륨 (158.11 g / 몰) 15 ㎎, 및 밀리-Q 물) 현상액에 전송 될 때까지 겔을 염색한다. </li><li> 10 분 동안 (2000 ㎖의 트리스 - 염기 (121.14 g / 몰), 아세트산 40 ㎖ 100 g을 밀리-Q 물) 정지 용액에서 겔을 넣어. </li><li> (장기 저장이 요구되는 경우에, 글리세롤 40 ㎖ 또는 400 ㎖, 및 밀리 Q 물 1600 ㎖)에 저장을 위해, 글리세롤 용액에 겔을 전송할 10 분간 후 겔 건조기를 사용하여 건조. </li><li> 젤은 광 트랜스 일루미네이터 또는 젤 화상 카메라를 사용하여 촬영 스캐너 / 농도계로 영상 시스템을 사용하여 염색 한 후 시각화 할 수 있습니다. 그러한 BIORAD에서 PDQuest 2-D 분석과 같은 이미지 분석 소프트웨어는 다음 샘플의 단백질에서 정량적 정보를 얻기 위해 사용될 수있다. </li></ol> 7. 질량 분석기 분석을위한 젤은 염색 </P&gt; <ol><li> 50 % 메탄올에 젤을 수정하고, 1 시간 동안 5 % 아세트산. </li><li> 밤새 적어도 10 분에 50 % 메탄올로 세척 할 것. </li><li> 10 분 동안 증류수의 3 배에 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 0.02 % 소듐 티오 설페이트 (158.11 g / mol)의 2 배와 감광. </li><li> 10 분 동안 식힌 증류수 배에서 3 배 세척. </li><li> 4 ° C에서 1 시간에 최소한 20 분 동안 식힌 1 % 질산은 용액 (169.87 g / 몰)에서 젤 잠수함 </li><li> 증류수로 1 분간 세척 배. 트레이 / 물통을 변경합니다. </li><li> 2 % 탄산나트륨 무수물 (105.99 g / 몰)에 0.04 %의 포름 알데히드에 개발하고 꽤 빠른 노란색으로 바뀔 때 폐기, 3 개의 배치를 가지고 5 분마다 변화 할 준비가되어. </li><li> 5 % 아세트산으로 세척 한 후 1 % 아세트산에 저장합니다. </li><li> USP 등급의 에탄올과 공기 건조 사용하기 전에 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브 (현장 컷 아웃을 얻을 유지하기 위해) 씻어. </li><li> 청소 집게, 100 % 메탄올 면도날 및 표면. </li><li> 에탄올 장갑 표면을 스프레이. </li><li> 흐름 후드 또는 깨끗한 공기 영역에서 소비세 명소. 스포트 또한 자동화 스폿 커터를 사용하여 절제 될 수있다. </li><li> 얼음에 에펜 도르프 튜브 및 선박에 넣어 또는 냉장고에 보관하십시오. </li></ol>

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Biol. 424, 35-42 (2008).</li><li>von der Haar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+protein+extraction+for+quantitative+proteomics+of+yeasts.">Optimized protein extraction for quantitative proteomics of yeasts.</a> PLoS One. 2, e1078 (2007).</li><li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins.">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J. Biol. Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).</li><li>Gygi, S. P., Rist, B., Griffin, T. J., Eng, J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+low-abundance+proteins+using+multidimensional+chromatography+and+isotope-coded+affinity+tags.">Proteome analysis of low-abundance proteins using multidimensional chromatography and isotope-coded affinity tags.</a> J. Proteome Res. 1, 47-54 (2002).</li><li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents.">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol. Cell Proteomics. 3, 1154-1169 (2004).</li><li>Velapati&#241;o, B., Limmathurotsakul, D., Peacock, S. J., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+proteins+from+Burkholderia+pseudomallei+isolated+during+primary+and+relapsing+melioidosis.">Identification of differentially expressed proteins from Burkholderia pseudomallei isolated during primary and relapsing melioidosis.</a> Microbes. Infect. 14, 335-340 (2012).</li><li>Chung, J. W., Speert, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+identification+and+characterization+of+bacterial+factors+associated+with+Burkholderia+cenocepacia+survival+in+a+murine+host.">Proteomic identification and characterization of bacterial factors associated with Burkholderia cenocepacia survival in a murine host.</a> Microbiology. 153, 206-214 (2007).</li><li>Rotz, L. D., Khan, A. S., Lillibridge, S. R., Ostroff, S. M., Hughes, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Public+health+assessment+of+potential+biological+terrorism+agents.">Public health assessment of potential biological terrorism agents.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 225-230 (2002).</li><li>Thon, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+proteomic+analysis+of+protein+changes+during+platelet+storage+requires+complementary+proteomic+approaches.">Comprehensive proteomic analysis of protein changes during platelet storage requires complementary proteomic approaches.</a> Transfusion. 48, 425-435 (2008).</li><li>Wu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+New+and+Emerging+Proteomic+Techniques.">In New and Emerging Proteomic Techniques.</a> Methods Mol. Biol. 328, 71-95 (2006).</li><li>Lopez, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+silver+stain+and+SYPRO+Ruby+Protein+Gel+Stain+with+respect+to+protein+detection+in+two-dimensional+gels+and+identification+by+peptide+mass+profiling.">A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling.</a> Electrophoresis. 21, 3673-3683 (2000).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

단백질의 제조 방법은 재현성 좋게 부르크 홀데 단백질의 대부분을 추출 할 수있는 것을 설명 하였다. 이는 그림 1과 같이 LB 또는 YEM 배양액에서 성장 같은 세균 배양을 사용하여 다른 일을 수행 두 개의 독립적 인 준비에서 같은 단백질 프로파일을 획득하여 보여줍니다. 그러나 우리가 접시에 성장 세균이 방법을 시험하지 않았다; 추출 액체 배지에서 자란 박테리아 효율적이?...

속 부르크 홀데 이상의 62 종, 틈새의 넓은 범위로부터 분리 그람 음성균를 포함하고, 그것은 두 가지 주요 클러스터 1,2에서 분할된다. 첫번째 클러스터는 인간, 동물 및 phytotrophic 유기체를 포함하고, 대부분의 연구는 그들의 임상 적 중요성이 그룹의 병원성 종에 초점을 맞추고있다. 대부분의 병원성 회원 B.합니다 의 pseudomallei와 B. (각각 melioidosis 및 저병의 원인이됩니다) mallei 3,4 및 낭포 성 섬유증 (CF) 및 만성 육아 종성 질환 (CGD)에 질병을 일으키는 원인이 기회 병원균 5 (Burkholderia의의 세파 시아 단지, BCC의 정의 17 종), 1. 이상의 30 비병원성 종 번째 클러스터는, 식물 또는 환경과 연관된 박테리아를 포함하고, 호스트 (2)에 대한 잠재적으로 유리한 것으로 간주된다. 많은 합병증은 FR 등장이러한 이유로 인해 경우 6-9 대부분의 근절하기 위해 열심히하는 항생제에 내장 함수 나 인수 저항의 환자, 질병의 확산 및 치료 실패의 병원체의 전송로 Burkholderia의 속의 병원성 멤버와 톰 세균 감염. 따라서 세균 감염의 설립을위한 기준의 명확한 이해를 얻는 것은 이러한 생물에 의한 질병의 치료에 매우 중요합니다. 감염의 확립에 대한 통찰력을 얻기 위해, 병인과 관련된 세균 성분에 대한 광범위한 연구가 필요하다. 프로테오믹스 방법을 사용 부르크 홀데 유기체의 프로테옴 분석에 집중 연구는 세균성 병인에 연루뿐만 아니라 프로테옴 변화가 10-16 프로파일 된 단백질을 설명했다. 높은 진한 함유 용해 버퍼에서 초음파 처리 및 동결 해동 사이클을 이용한 단백질 추출 방법요소의 entration, 세제 및 양쪽 성과 함께 티오는 Burkholderia의 프로테오믹스 연구 10-13에 적용되었습니다. 우레아는 단백질 변성에 대해 매우 효율적이지만, 그것에 의해 (의해 carbamylation 반응) 아티팩트 (17)를 형성하는 아미노산 그룹과 반응 할 수있는 암모늄 이소시아네이트와 수용액 평형을 확립 할 수있다. 따라서, 시안의 청소부 역할을 캐리어 양쪽 성을 포함, 37 ° C 17 이상의 온도를하지 않는 것이 좋습니다. 또한, 단백질 정량화 함께 용해 완충액의 화학적 간섭을 방지하기 위해, 동일 용해 완충액은 샘플 및 표준이 동일한 배경 (10)를 가질 수 있도록 표준 곡선을 생성하는데 사용될 수있다. 다른 방법은 열 배양 기간 (17, 18)와 알칼리 버퍼와 세제의 사용을 포함하지만 이러한 조건은 프로테옴의 변화를 유도 할 수 있으며 일부 세제 홍보와 호환되지 않습니다oteomics 출원은 후속 세제 제거 단계 (17, 18)를 포함하지 않는 경우. 적절한 추출 및 정량 한 결과, 각각의 단백질의 해외 단백질 발현은 이차원 (2-D) 겔 전기 영동 등 프로테오믹스 방법을 사용하여 조사 할 수있다. 이 기술은 제 O&#39;Farell 19에 의해 설명되고 제 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질을 분리 한 다음 그 분자량에 따른 것으로 구성 하였다. 그것의 해상도와 감도로,이 기술은 복잡한 생물학적 소스 (19, 20)에서 단백질의 분석 및 검출을위한 강력한 도구입니다. 이 분리 기술은 전사 후 수정이나 단백질 분해 처리에 의한 단백질 이소 해결의 큰 장점과 단백질 중심의 접근 방식에서 현재 사용할 수 있습니다. 양 변경겔 (20)의 염색 후에 해당 스팟의 강도를 비교함으로써 검출 될 수있다. 그러나,이 기술은 매우 큰 단백질, 막 단백질, 매우 염기성 및 산성 또는 소수성 단백질의 식별에 적합하고, 다소 힘들고 시간 소모적 기법 20 아니다. 보다 강력하고 객관적 새로운 펩타이드 중심의 접근 방식 (비 젤 기준) 사용할 수있게하고 (ICAT) 21에 태그를 동위 원소 코드 친화력에 의해 시스테인 라벨 및 아미노기로 차등 안정 동위 원소 표지 방법으로 정량적 비교를 위해 사용될 수있다 상대 및 절대 정량 (iTRAQ) 22 동위 원소의 태그에 의해 표시. 하나의 프로테오믹스 기술의 사용은 충분한 정보를 줄 수도 있으므로 두 개의 보완적인 단백질 체학 접근 방법의 사용은 프로테옴에서 가장 완벽하게 평가하는 변화가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 2-D 겔 전기 널리 사용되며 일상적 콴 적용될 수있다다른 생물의 여러 단백질의 발현을 titative. 여기에 우리가 적응하고 최적화 된 GE 헬스 케어 2-D 전기 원리 및 방법 핸드북 80-6429-60AC 2004 (한 부르크 홀데 리아 종에 대한 전체 세포 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 절차에 대해 설명 <a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a> )를. 단백질 추출은 5 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 및 1mM의 PMSF (페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드)를 함유하는 PBS의 존재하에 유리 비드와 비드 비터를 사용하여 실시 하였다. 이 절차는 최소한의 분해와 단백질의 정량화를 허용하고 이전에보고 15,23,24 등 프로테오믹스 방법에 대한 수정할 수있는 것입니다. 2-D 겔 전기 영동은 24 ㎝ 길이 고정화 pH를 4-7 구배 및 단백질을 사용하여 수행된다 그들의 등전점에 따라 분리 하였다. 그런 단백질은 자신의 molec에 따라 분리SDS-폴리 아크릴 아마이드 젤에 의해 신경근 무게. 또한, 우리는 자리 단백질의 시각화 및 질량 분석기 분석을위한 호환 실버 얼룩 방법을은 염색 방법을 설명했다. 함께 이러한 절차는 병인에 관여 할 수 부르크 홀데 리아 종에서 중요한 단백질의 식별을 허용 할 수 있습니다.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Reagents</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P7626</td>
 <td>Toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A18-1</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBS Buffer</td>
 <td>Bioscience</td>
 <td>R028</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP118-500 </td>
 <td>toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass beads (0.1 mm)</td>
 <td>BioSpec Products</td>
 <td>11079101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml)</td>
 <td>VWR</td>
 <td>21009-342</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroBCA protein extraction kit</td>
 <td>Pierce</td>
 <td>23235</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>02-681-375</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2-D Clean-Up kit</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6484-51</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15505-050</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CHAPS</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>17-1314-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dithiothreitol (DTT)</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>856126</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm</td>
 <td>Amersham Biosciences</td>
 <td>176002-46</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Duracryl</td>
 <td>Proteomic Solutions</td>
 <td>80-0148</td>
 <td>Very toxic, carcinogen</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ammonium persulfate</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP179-100</td>
 <td>Flammable, toxic, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15524-010</td>
 <td>Flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP166-500</td>
 <td>Acute toxicity, flammable</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Agarose</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15510-027</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>HC1100-1GL</td>
 <td>Flammable, toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A491-212</td>
 <td>Flammable, corrosive</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glutaraldehyde</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>G151-1</td>
 <td>Very toxic, corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium tetrathionate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P2926</td>
 <td>Irritant</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium acetate</td>
 <td>EM Science</td>
 <td>7510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Silver nitrate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>209139</td>
 <td>Corrosive, dangerous for the environment</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Formaldehyde</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>252549</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium thiosulfate</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>S7026</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>EMD</td>
 <td>9230</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycine</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>808831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glycerol</td>
 <td>MPBiomedical, LCC</td>
 <td>800688</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>A412-4</td>
 <td>Flammable, toxic, health hazard</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium carbonate anhydrous</td>
 <td>EMD</td>
 <td>SX0400-3</td>
 <td>Toxic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mineral oil</td>
 <td>ACROS</td>
 <td>415080010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>Equipment </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JA-20 ultracentrifuge rotor</td>
 <td>Beckman Coulter</td>
 <td>334831</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini Beadbeater</td>
 <td>Biospec Products</td>
 <td>3110BX</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6505-03</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system</td>
 <td>GE Healthcare</td>
 <td>80-6485-27</td>
 <td><a href="http://www.amershambiosciences.com" target="_blank">www.amershambiosciences.com</a></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

total protein extraction and 2-d gel electrophoresis methods for burkholderia species

세균 종의 세포 내 단백질 수준의 조사가 이들 유기체에 기인 한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요하다. 여기에서 우리는 인산염 완충 생리 식염수에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및 페닐 메틸 불소의 존재에 유리 구슬을 사용하여 기계적인 용해에 따라 부르크 홀데 리아 종에서 단백질을 추출하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 성장 조건을 위해, 다른 부르크 홀데 종에 사용될 수 있고, 다른 균의 프로테오믹스 연구에 사용하기위한 것으로 적당하다. 단백질 추출 후, 이차원 (2-D) 겔 전기 단백체 기술은 이러한 유기체의 프로테옴에서 해외 변화를 연구하는 기술된다. 이 방법은 분자량에 기초하여 분액하여 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질의 분리, 이루어져두 번째 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해. 분리 된 단백질의 시각화를 실버 염색으로 수행된다.

두 개의 서로 다른 경우에 동일한 균 배양에서 추출 된 단백질 프로파일의 비교 분석은 성공적인 단백질 추출을 나타내는 유사한 패턴 밴딩을 보여 주었다. 추출 된 분자량 단백질은 10-150 kDa의에서였다. Burkholderia의의 multivorans에서 전체 세포 단백질 추출의 1은 대표 쿠마시 블루 염색 젤 (BCC의 구성원)도 LB 또는 효모 / Manitol (YEM) 국물과 성장 임상 분리 정지 단계에?...

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Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Burkholderia의 속의 구성원은 임상 중요성 병원균이다. 우리는 기계적 중단하고 후속 단백질체 분석에 2-D 겔 전기 영동을 사용하여, 전체 박테리아 단백질을 추출하는 방법을 설명한다.

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한<em&gt; Burkholderia의</em&gt; 종

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

total-protein-extraction-2-d-gel-electrophoresis-methods-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

28.9K 조회수.  University of British Columbia.  Burkholderia의 속의 구성원은 임상 중요성 병원균이다. 우리는 기계적 중단하고 후속 단백질체 분석에 2-D 겔 전기 영동을 사용하여, 전체 박테리아 단백질을 추출하는 방법을 설명한다. 

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A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium. Because resistance to ampicillin and vancomycin in E. faecalis is still uncommon compared to resistance in E. faecium, the development of rapid tests allowing differentiation between enterococcal species is important for appropriate therapy and resistance surveillance. The E. faecalis OE PNA FISH assay (AdvanDx, Woburn, MA) uses species-specific peptide nucleic acid (PNA) probes in a fluorescence in situ hybridization format and offers a time to results of 1.5 hours and the potential of providing important information for species-specific treatment. Multicenter studies were performed to assess the performance of the 1.5 hour E. faecalis/OE PNA FISH procedure compared to the original 2.5 hour assay procedure and to standard bacteriology methods for the identification of enterococci directly from a positive blood culture bottle.

A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures

A rapid protocol for the direct identification of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species from a positive blood culture using a Peptide Nucleic Acid fluorescent in situ hybridization assay (PNA FISH).

의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus</em직접 혈액 배양에서> 종

Enterococci are a common cause of bacteremia with E. faecalis being the predominant species followed by E. faecium.  Because resistance to ampicillin and ...

연구

면역학 및 감염병학

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

조류 FTA 카드 인플루엔자 감시 : 필드 방법, Biosafety, 그리고 교통 문제 해결

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Procedures for Identifying Infectious Prions After Passage Through the Digestive System of an Avian Species

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission of TSE diseases, such as chronic wasting disease (CWD), is presumed to be from animal to animal2,3 as well as from environmental sources4-6. Scavengers and carnivores have potential to translocate PrPRes material through consumption and excretion of CWD-contaminated carrion. Recent work has documented passage of PrPRes material through the digestive system of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common North American scavenger7.
We describe procedures used to document passage of PrPRes material through American crows. Crows were gavaged with RML-strain mouse-adapted scrapie and their feces were collected 4 hr post gavage. Crow feces were then pooled and injected intraperitoneally into C57BL/6 mice. Mice were monitored daily until they expressed clinical signs of mouse scrapie and were thereafter euthanized. Asymptomatic mice were monitored until 365 days post inoculation. Western blot analysis was conducted to confirm disease status. Results revealed that prions remain infectious after traveling through the digestive system of crows and are present in the feces, causing disease in test mice.

Scavengers have potential to translocate infectious transmissible spongiform encephalopathy prions in their feces to disease-free areas. We detail methods used to determine if mouse-adapted scrapie prions remain infectious after passage though the digestive tract of American crows (Corvus brachyrhynchos), a common consumer of dead animals.

조류 종의 소화 기관을 통과 한 후 감염성 프리온을 확인하기위한 절차

Infectious prion (PrPRes) material is likely the cause of fatal, neurodegenerative transmissible spongiform encephalopathy (TSE) diseases1. Transmission ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

설립과 연구에 높은 처리량 설정 최적화<em&gt; 표피 포도 구균</em&gt;와<em&gt; Mycobacterium의 박테</em&gt; 감염 신약 개발의 모델로

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP)

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research is deciphering how these dynamic protein complexes act to integrate signals from multiple sources in order to direct a specific biological response, and how this becomes deregulated in many disease settings. Despite the importance of this key biochemical mechanism, there is a lack of experimental techniques that can facilitate the specific and sensitive deconvolution of these multi-molecular signaling complexes.
Here this shortcoming is addressed through the combination of a protein complementation assay with a conformation-specific nanobody, which we have termed Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel technique facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any pair of interacting proteins, to the exclusion of un-complexed individual proteins and complexes formed with competing binding partners. 
The BiCAP technique is adaptable to a wide array of downstream experimental assays, and the high degree of specificity afforded by this technique allows more nuanced investigations into the mechanics of protein complex assembly than is currently possible using standard affinity purification techniques.

Dissecting Multi-protein Signaling Complexes by Bimolecular Complementation Affinity Purification BiCAP

This manuscript describes the protocol for Bimolecular Complementation Affinity Purification (BiCAP). This novel method facilitates the specific isolation and downstream proteomic characterization of any two interacting proteins, while excluding un-complexed individual proteins as well as complexes formed with competing binding partners.

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해

The assembly of protein complexes is a central mechanism underlying the regulation of many cell signaling pathways. A major focus of biomedical research ...

총 단백질 추출 및 2-D 겔 전기 영동 방법에 대한

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의 식별을위한 1.5 시간 절차 Enterococcus 종

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의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험

미생물 감염 및 분석에 대 한 초파리 melanogaster 애벌레에서 Hemocytes의 추출

해 다중 단백질 신호 복합물 분자 보완성 친 화력 정화 (BiCAP)에 의해