이 프로토콜은 McGinnis 연구소, 김 A. 메이스와 조셉 C. 피어슨의 이전 멤버와 공동으로 개발되었습니다. 우리는 가치있는 주식을 정리하고 배포 할 수있는 자신의 작품에 대한 블루밍턴 초파리 증권 센터의 지속적인 노력에 감사드립니다. 이 작품은 건강의 국립 연구소 (R01 GM077197 및 K12 GM68524)과 허버트 스턴의 가족에서 자금에 의해 지원되었다. MTJ는 현재 소수 민족 건강과 건강 불균형에있는 국립 연구소의 연구 자원을위한 국립 센터와 그랜트 번호 8G12MD7603-27에서 부여 번호 5G12RR003060-26에 의해 지원됩니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 소수 민족 건강과 건강 격차 또는 건강의 국립 연구소에있는 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.

Drosophila의 배아 상처 프로토콜은 다섯 단계로 요약 될 수있다 : (1) 배아 컬렉션, (2) 배아 준비 (3) 배아 부상, (4) 배아 미세 주입하고, (5) 배아 고정. 1. 배아 컬렉션 <ol><li> 성인 파리를 수집 2~3일 eclosing 후 배아 수집 케이지에 50 명의 여성과 25 명의 남성을 추가합니다. </li><li> 3 일 동안 매일 아침 신선한 사과 주스 한천 플러스 효모 판을 놓습니다. 주 : 25 ° C 배양기에서 12 시간 낮의 일정에 최적의 배아 수집, 사이클 파리 (17:00 빛 &quot;OFF&quot;, &quot;ON&quot;5시 등), 여성 파리는 빛 사이클의 변화에​​ 대응하고 빛을 &quot;OFF&quot;, 11 &quot;ON&quot;등의 스위치 중에 계란의 큰 수량을 입금합니다. </li><li> 일 - 3 일 오후, 케이지에 신선한 사과 주스 플러스 효모 한천 플레이트를 배치하고 2 시간 동안 배아를 수집합니다. 새장에 새 효모 판을 놓고 저장2 시간 수집 판. </li><li> 배아를 나이에 25 ° C에서 추가로 14 시간 동안 수집 판을 보관합니다. 주의 사항 : 상처 치유는 초파리를 개발하는 동안 모든 단계에서 정량 할 수 있으며,이 문서에 설명 된 상처에 의한 전사 기자는 단계 12월 15일에서 16일까지 사이의 최적의 활성을 갖는다. 말기 (17)에 의해, 배아 쉽게 성숙 표피를 관통하고 효율적으로 상처 기자를 활성화하거나 상처에 의한 전사를 감지 너무 오래. 수집 시간과 상처를 입기 시간이 피크 랩 시간 동안 발생할 수 있도록하기 위해, 우리는 18시 새 접시와 컬렉션 플레이트를 교환, 2 시간 (16시부터 18시까지)에 대한 배아 컬렉션의 스케줄을 따라 세 14 시간 (야간) 25 ° C에서 컬렉션 플레이트, 그리고 (다음 날) 08:00 배아를 상처. </li></ol> 2. 배아 준비 참고 :이 프로토콜은 날카로운 또는 G 만든 다양한 도구와 개체의 사용을 포함아가씨. 부상을 방지하기 위해주의 모든 날카로운 유리 개체를 처리 할 수​​ 있습니다. <ol><li> 조심스럽게 접시와 소용돌이에 2 ~ 3 ㎖의 물을 추가하여 붓 수집 플레이트에서 배아를 제거합니다. 나일론 메쉬 및 수집 관에 접시에서 물과 배아를 전송합니다. </li><li> 플라스틱 페트리 접시 접시의 뚜껑에 표백제의 4 ~ 5 mL를 넣고 2 분 동안 표백의 배아를 포함하는 수집 관의 메쉬 커버 끝 흡수, 태아의 외부 껍질을 제거합니다. 수동으로 수집 관에게 표백제의 응집에서 배아를 방지하기 위해 몇 번 회전합니다. 물 배와 배아를 씻어 종이 타월에 dechorionated 배아를 포함하는 메쉬 커버 포집 관을 건조. </li><li> 한천 플레이트에 나일론 메쉬에서 ~ 50 배아를 전송하는 해부 바늘을 사용합니다. 우리는 배아의 정렬에 대비 및 지원을 추가 할 한천 플레이트에 녹색 식용 색소를 추가합니다. 해부 현미경, 엠브리 정렬 ~ 25 배아의 두 개의 병렬 행을슬라이드 OS가 마이크로 인젝션 장치에 천자 바늘에 대하여 직각이되도록. 가스 교환을 목적으로 배아 사이에 약간의 공간 (약 1 배아의 길이)를 둡니다. 두 개의 병렬 행이 떨어져 대략 5 mm 이상이어야한다. </li><li> 정렬 된 배아의 상단에 두 배 지팡이 테이프와 슬라이드를 놓고 조심스럽게 슬라이드에 그린 접시에서 배아를 전송하는 슬라이드를 누릅니다. 그런 다음 공기 배아를 건조 ~ 25 분 배아에서 내부 압력을 감소시키고 상처를 입는 경우 버스트를 방지합니다. </li><li> 더 탈수를 방지하기 위해 배아에 할로 카본 오일 혼합의 2 ~ 3 방울을 넣습니다. </li></ol> 3. 배아 부상 <ol><li> 주사 현미경 단계에있는 배아 슬라이드를 놓습니다. 보기의 분야에서 배아를 찾아 거꾸로 현미경의 무대를 이동 연습. 참고 : 바늘을 사용하기 전에, dorsoventral 축을 따라 배아의 중간면에 초점을 맞 춥니 다. 효율적으로 상처를 입기을 허용하기 위해정렬 된 배아는 가까이 바늘 장치에 행을 부상 시작합니다. 보기의 필드에 정렬 된 배아의 행의 상단을 가지고 무대를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 배치하고 바늘 홀더에서 뽑아 바늘을 고정합니다. 슬라이드를 향해 아래로 바늘을 이동하는 미세 조작기를 사용합니다. 같은 초점면에서, 배아와 바늘을 맞 춥니 다. 바늘이 배아에 초점되면, 미세 조작기로 바늘을 이동하지 않습니다. </li><li> 다음 행의 다음 배아로 이동을 통해 통해 배아를 천공 단계를 이동합니다. 첫 번째 행을 부상 할 때, 슬라이드를 이동하기 전에 단계로부터 멀리 완​​전히 바늘을 이동하는 미세 조작기를 사용하여, 수동으로 슬라이드를 180 ° 회전하고 두 번째 행 상처. </li><li> 실온에서 할로 카본 오일에서 배아를 저장하고 배아 고정 진행 현장 하이브리드 또는 항체 염색에서하고있는 경우 (절차의 단계 5 참조). 또한, 4 ~ 6 시​​간 동안 배아를 저장할로 카본 오일에서와 상처 전사 형광 기자 시각화 (대표 결과)를 진행합니다. 참고 : 형광 기자의 시각화를 위해, 우리는 50 % 1 - 페녹시 -2 - 프로판올 (13)를 사용하여 배아를 마취. 배아는 할로 카본 오일에서 제거하고 새 슬라이드에 배치됩니다. 우리는 배아의 주위에 유리 구슬을 배치 마취 몇 방울을 추가하고, 배아에 커버 슬립을 배치합니다. </li></ol> 4. 배아 미세 주입 주 : 우리가 프로토콜에서 사용하는 미세 주입 장치는 분석 기간 동안 특정 볼륨을 제공하는 자동화되지 않습니다. 우리는 미세 주입을 시각화하고 전달 볼륨을 정상화하려고 솔루션에 염료를 추가합니다. 너무 많은 솔루션이 배아에 주입되는 경우, 난황 막 파열 것이다. <ol><li> 화학 용액 플러스 염료의 1 μL와 후면에서로드 바늘 (예 : 0.6 MH 2 O 2). 모세 혈관이 허용바늘의 끝 부분에 화학 용액을 그리는 작업입니다. </li><li> 바늘을 중단하려면 슬라이드 코트 할로 카본 오일 믹스 가장자리에 각도로 커버 슬립을 배치합니다. 각진 커버 슬립의 가장자리에 초점에 장착 된 바늘을 가지고 부드럽게 깨진 때까지 바늘의 끝을 가로 질러 커버 슬립의 가장자리로 이동합니다. 미세 주입 장치에 압력을 적용하고 화학 용액 플러스 염료 바늘을 유출되어 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경 단계에 맞춰 배아를 포함하는 슬라이드를 놓습니다. 동일 평면에있는 배아와 바늘에 초점을 진행합니다. 동시에 찔린 microinject 화학 솔루션 플러스 각 배아로 염색. 참고 : 막힌 바늘 자주 발생, 불완전 미세 주입을 방지하기 위해 새로운 바늘을 휴식. 무딘 바늘 끝은 깔끔 각도 바늘 끝과 같은 상처를하지 않습니다. 파손하는 동안 비 90 ° 각도로 커버 슬립을 조정하면 각도 바늘 끝을 생산하기에 최적입니다. </li></ol> 5. 포름 알데히드 인터넷xation 참고 :이 초파리의 고정에 사용되는 화학 물질은 유해하다. 화학 약품을 처리하는 개인 보호 장비 (예 : 장갑, 실험복, 안전 고글)를 사용합니다. 규제 화학 물질의 처분을 위해 개별 기관의 지침을 따르십시오. <ol><li> 남긴 상처 후 발생하는 상처 유발 유전자의 전사 활성화를 위해 15, 30, 60, 분 이상 기다립니다. 사출 슬라이드에서 배아를 제거하려면, 조심스럽게 슬라이드에서 할로 카본 오일 혼합 드레인 랙에 슬라이드 기대어 킴 와이프로 끝을 얼룩. </li><li> 슬라이드에 헵탄을 씻어 유리 페트리 접시에 린스 액을 씻어 유리 피펫을 사용합니다. 헵탄 테이프를 녹여 배아를 발표 할 예정이다. 모든 배아가 슬라이드에서 제거 될 때까지 계속 세척 할 것. 모든 배아가 슬라이드에서 제거 될 때까지, 다음 슬라이드로 이동합니다. </li><li> 20 ㎖의 공상 과학에 유리 접시에서 헵탄 플러스 배아 솔루션을 전송ntillation 유리 병. 2 ~ 3 분 동안 병을 흔들어, 헵탄을 제거하고 신선한 헵탄 5 ㎖를 추가합니다. </li><li> 신선한, 고정 솔루션의 5 ML을 추가합니다 (조리법에 대한 시약의 목록 참조). 유리 병 모자와 궤도 플랫폼 통에 연결합니다. 220 ~ 230 rpm에서 25 분 동안 배아를 포함하는 유리 병을 흔들어. </li><li> 흔들어, 인터페이스 팝업에서 거품을 할 수 있습니다. 완전히 배아를 잡아 당겨 피 피펫 아래, 수성 단계를 제거합니다. 바닥 층은 고정 솔루션으로 구성되어 있으며 제대로 처리해야합니다. </li><li> 메탄올 5 ㎖를 추가 유리 병 캡을 20 ~ 30 초, 소용돌이에 손으로 격렬하게 흔들 벤치에 놓습니다. 부상 배아는 계면에 남아있을 것하고 아래로 침몰하지 않습니다. 주의 사항 : 고정 후 unwounded 배아의 난황 막 일반적으로 메탄올 탈수 단계에서 폭발합니다. 그러나, 부상당한 배아의 난황 막 이미 고장 및 탈수 단계는 난황의 MEMB을 제거하지 않습니다RANE. 손 devitellinzation는 고정 프로토콜을 완료하는 데 필요합니다. </li><li> 조심스럽게 상단 헵탄 층을 제거하고 신선한 메탄올 5 ㎖를 추가합니다. 유리 병을 흔들어 배아 싱크해야합니다. </li><li> 유리 전송 피펫으로 메탄올 플러스 배아 용액을 제거하고 유리 접시에 나일론 메쉬 포집 관에 수집한다. </li><li> 메탄올을 제거하고 1X PBS 용액으로 배아를 씻어. </li><li> 사과 주스 플레이트에 나일론 메쉬에서 배아를 전송합니다. 판의 표면을 따라 배아를 확산. </li><li> 두 배 지팡이 테이프 유리 슬라이드에 배아를 전송합니다. 1X PBS와 배아를 커버. 참고 : 배아 때문에 난황 막 응집하는 경향이있다. 사과 주스 장소를 사용하여 응집 배아를 빠르게 분리 할 수​​ 있습니다. 힘에서 배아를 제거하기 위해 적용되었을 때 배아 한천 플레이트에 싱크 때문에 배아는 플레이트로부터 제거되고 이중 스틱 테이프 유리 슬라이드로 전송해야난황 막. </li><li> 조심스럽게 난황 막 &quot;팝업&quot;으로 해부 바늘로 배아를 밀어 넣습니다. 배아는 PBS에 침몰한다. </li><li> 1.5 ML 튜브에 1X PBS 플러스 배아를 전송하는 유리 피펫을 사용합니다. 4 ℃에서 1X PBS 및 저장과 배아를 씻어 PBS 시리즈와 현장 하이브리드 또는의 면역 프로토콜 14을 계속 : 에탄올을 사용하여 배아를 탈수로 이동합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Germeraad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+in+Drosophila+by+microinjection+of+DNA.">Genetic transformation in Drosophila by microinjection of DNA.</a> Nature. 262 (5565), 229-231 (1976).</li><li>Payre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+epidermis+differentiation+in+Drosophila.">Genetic control of epidermis differentiation in Drosophila.</a> Int. J. Dev. Biol. 48 (2-3), 207-215 (2004).</li><li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).</li><li>Mace, K. A., Pearson, J. C., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidermal+barrier+wound+repair+pathway+in+Drosophila+is+mediated+by+grainy+head.">An epidermal barrier wound repair pathway in Drosophila is mediated by grainy head.</a> Science. 308 (5720), 381-385 (2005).</li><li>Ting, S. B., Caddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+homolog+of+Drosophila+grainy+head+is+essential+for+epidermal+integrity+in+mice.">A homolog of Drosophila grainy head is essential for epidermal integrity in mice.</a> Science. 308 (5720), 411-413 (2005).</li><li>Pearson, J. C., Juarez, M. T., Kim, M., Drivenes, &. #. 2. 1. 6. ;., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+transcription+factor+codes+activate+epidermal+wound-response+genes+in+Drosophila.">Multiple transcription factor codes activate epidermal wound-response genes in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (7), 2224-2229 (2009).</li><li>Campos, I., Geiger, J. A., Santos, A. C., Carlos, V., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screen+in+Drosophila+melanogaster+uncovers+a+novel+set+of+genes+required+for+embryonic+epithelial+repair.">Genetic screen in Drosophila melanogaster uncovers a novel set of genes required for embryonic epithelial repair.</a> Genetics. 184 (1), 129-140 (2010).</li><li>Lesch, C., Jo, J., Wu, Y., Fish, G. S., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+UAS-RNAi+screen+in+Drosophila+larvae+identifies+wound+closure+genes+regulating+distinct+cellular+processes.">A targeted UAS-RNAi screen in Drosophila larvae identifies wound closure genes regulating distinct cellular processes.</a> Genetics. 186 (3), 943-957 (2010).</li><li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Sandoval-Guillen, E., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duox,+Flotillin-2,+and+Src42A+are+required+to+activate+or+delimit+the+spread+of+the+transcriptional+response+to+epidermal+wounds+in+Drosophila.">Duox, Flotillin-2, and Src42A are required to activate or delimit the spread of the transcriptional response to epidermal wounds in Drosophila.</a> PLoS Genet. 7 (12), e1002424 (2011).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+light+condition+modification+on+the+circadian+rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+Drosophila+melanogaster.">Influence of light condition modification on the circadian rhythm of vitellogenesis and ovulation in Drosophila melanogaster.</a> J. Insect Physiol. 22 (8), 1075-1080 (1976).</li><li>Allemand, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythm+of+vitellogenesis+and+ovulation+in+photoperiod+ld+12:12+of+Drosophila+melanogaster.">Rhythm of vitellogenesis and ovulation in photoperiod ld 12:12 of Drosophila melanogaster.</a> Insect Physiol. 22 (7), 1031-1035 (1976).</li><li>Pierre, S. E., Thurmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlyBase+101+-+the+basics+of+navigating+FlyBase.">FlyBase 101 - the basics of navigating FlyBase.</a> Nucleic Acids Res. 40 (D1), D706-D714 (2012).</li><li>Wyeth, R. C., Croll, R. P., Willows, A. O. D., Spencer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Phenoxy-2-propanol+is+a+useful+anaesthetic+for+gastropods+used+in+neurophysiology.">1-Phenoxy-2-propanol is a useful anaesthetic for gastropods used in neurophysiology.</a> J. Neurosci. Methods. 176 (2), 121-128 (2009).</li><li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos.">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305 (5685), 846 (2004).</li><li>Barolo, S., Castro, B., Posakony, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Drosophila+transgenic+reporters:+insulated+P-element+vectors+expressing+fast-maturing+RFP.">New Drosophila transgenic reporters: insulated P-element vectors expressing fast-maturing RFP.</a> BioTechniques. 36 (3), 436-440 (2004).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Casso, D., Ram&#237;rez-Weber, F., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+balancer+chromosomes+for+Drosophila+melanogaster.">GFP-tagged balancer chromosomes for Drosophila melanogaster.</a> Mech. Dev. 91 (1-2), 451-454 (2000).</li><li>Patterson, R. A., Juarez, M. T., Hermann, A., Sasik, R., Hardiman, G., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serine+proteolytic+pathway+activation+reveals+an+expanded+ensemble+of+wound+response+genes+in+Drosophila.">Serine proteolytic pathway activation reveals an expanded ensemble of wound response genes in Drosophila.</a> PloS one. 8 (4), e61773 (2013).</li><li>Evans, I. R., Zanet, J., Wood, W., Stramer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+melanogaster+embryonic+hemocyte+migrations.">Live imaging of Drosophila melanogaster embryonic hemocyte migrations.</a> J. Vis. Exp. (36), e1696 (2010).</li><li>Small, C., Paddibhatla, I., Rajwani, R., Govind, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+parasitic+wasps+of+Drosophila+and+the+antiparasite+immune+response.">An introduction to parasitic wasps of Drosophila and the antiparasite immune response.</a> J. Vis. Exp. (63), e3347 (2012).</li><li>Repiso, A., Berganti&#241;os, C., Corominas, M., Serras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+repair+and+regeneration+in+Drosophila+imaginal+discs.">Tissue repair and regeneration in Drosophila imaginal discs.</a> Dev. Growth Differ. 53 (2), 177-185 (2011).</li><li>Worley, M. I., Setiawan, L., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+and+transdetermination+in+Drosophila+imaginal+discs.">Regeneration and transdetermination in Drosophila imaginal discs.</a> Annu. Rev. Genet. 46, 289-310 (2012).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

외부 신호에 즉시 전사 조절 반응은 세포가 스트레스, 손상 또는 감염을 포함 할 수있다 세포 자극에 대한 지역화 된 응답을 조정 할 수 있습니다. 지역화 된 응답의 부적절한 조절은 손상을 복구하는 손상 이웃 세포에 대한 영향뿐만 아니라 자원의 낭비가있을 수 있습니다. Drosophila의 배아는 저렴하고 유지 관리가 쉬운 모델 생물의 기본적인 상처 치유 실험을 수행 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다. 다른 모델 생물의 연구와 초파리 사이의 협력의 가능성은 많은 생물 학적 질문을 탐험 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 상처 기자의 추가적인 기술은 표피 상처 반응 경로의 활성화에 새로운 유전자의 포스팅을 테스트하기위한 효율적인 방법을 제공하는 돌연변이의 유전 적 배경을 조합이다. 우리는 표피 상처에 의한 전사 기자 AV가2 차 및 3 차 염색체 5 모두 ailable. 이 연구에서 우리는 UAS 및 과발현 (16)의 GAL4 시스템을 사용합니다. 치명적인 돌연변이 대립 형질을 가진 연구를 위해 우리는 형광 균형 염색체, 예를 들어 크 룹펠-GFP (17)를 사용하여 유전 적 배경을 결정합니다. 우리는 여러 가지 유전 적 배경 (표 1)에 상처 기자 현지화를 분석 하였다. 기술의 가능한 변형은 미세 주입 및 상처를 입기를 결합하는 것입니다. 마이크로 인젝션은 배아에 약액을 도입하는데 사용될 수있다. 몇몇 화합물은 화학적 검사를 마친 표피 상처 기자 9의 활성을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 동시 상흔 및 마이크로 인젝션이 방법은 상처 신호를 직접 반응 (18)을 부상 후 유전자 발현의 변화를 모니터링하는데 사용될 수 초파리 배아 세포의 수를 증가하는 것이 유용 할 수있다. 미세 주입 기술의 미래 응용 프로그램은 표피 상처 반응의 조절에 대한 새로운 화학 물질을 테스트하는 것입니다. 유전자 연구를위한 모델 시스템으로 초파리 효율적으로 복잡한 문제를 해결하기 위해 간단한 프로토콜의 넓은 범위를 제공합니다. 초파리 기법의 타당성에 대한 최근의보고는 더욱 초파리 연구계의 영향 범위를 확장하기위한 수단으로서 혈구 이주 (19)과 기생 말벌 감염 (20)의 사용을 강조한다. 상처 수리 연구뿐만 아니라, 초파리, 상상 디스크 시스템 (21, 22)와 재생을위한 고전적인 모델을 제공합니다. 가상적인 디스크 재생 연구와 펑크 / 마이크로 인젝션 남긴 상처의 결합 발전은 조직 복구의 잘 보존 된 구성 요소를 발견 할 수있는 훌륭한 시스템을 제공합니다.

미세 주입 기술을 이용하여 초파리 배아의 조작은 잘 확립 된 분석 1. 표피 상처 응답 리포터 방법의 중요성은 형광 기자와 펑크 / 미세 주입을위한 프로토콜을 결합하고 Drosophila의 배아 표피 손상에 생체 반응을 시각화하는 것입니다. 이 방법의 목적은 표피 천자 부상으로 전사 반응을 조절하는 과정을 조사하기위한 도구로서 초파리를 사용하는 과학자의 광범위한 세트를 사용하는 것이다. 초파리의 단일 층 표피는 펑크 부상이 후 표피 상처의 반응을 연구 할 수있는 간단한 시스템을 제공합니다. Drosophila의 배아는 유전자 상처 반응, 염증, 및 재 상피화 3 등의 상처 보수의 단계를 해부에 대한 강력한 모델 시스템입니다. 많은 또는 대부분의 접합체 돌연변이 embryogenes의 단부에 생존 때문 부분에과 발달 패턴 뿌리깊은 틀려서 경우에도 표피 장벽을 개발한다. GRH-표적 유전자 아미노산의 일종 탈 카르복시 화 효소 (DDC)과 티로신 수산화 효소 (PLE)을 전사적으로 부상 (4)의 사이트를 중심으로 활성화됩니다. 확인 잘 보존 전사 인자 거친 헤드 (GRH), 이전 특성 초파리 상처 대응을위한 모델 생물로 포유 동물의 상처 치유 5에서 연구를 진행하는 조사의 보완 라인을 제공합니다. 후속 연구는 추가 초파리 상처 유발 유전자를 발견하고 6 명이 부상 청소 생체 표피 상처의 반응을 모니터링하는 많은 형광 상처 기자의 &quot;키트&quot;를 개발했다. 초파리 상처 치유의 규제에 관한 최근의 보고서는 세포 이동을 규제 7,8 많은 경로의 검색을 허용 상처 봉합 표현형에 초점을 맞추고있다. 의 분석형광 상처 기자는, 우리의 연구는 표피 상처 유도 유전자 (9)의 지역화 식에 필요한 유전자의 새로운 세트를 발견했습니다. 상처 응답 리포터 방법의 장점 중 하나는 결과 신호가 인접 셀에 부상의 사이트에서 형질 도입하는 방법의 메커니즘에 대한 추가 통찰력을 제공한다는 것이다. 그러나, 상처 응답 리포터 방법의 단점 중 하나는 결과 직접 상처 치유 또는 수리 표현형을 링크하지 않는다는 것이다. 유전 및 화학 화면의 깨끗한 상처 천자 프로토콜의 광범위한 사용은 전사 반응의 새로운 규제 식별 할 부상 표피 및 부상 치료의 포유 동물 모델로 상처 치유 발견의 번역을 증진 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="576">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">yeast</td>
			<td style="width:124px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:133px;">51475</td>
			<td style="width:121px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">apple juice</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-824-297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">bleach</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H8773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1-phenoxy-2-propanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>484423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">toluidine blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>89640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, 16%</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>18814-20</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">heptane</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H360-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A412-1</td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-899-90013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-255-956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2819-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Equipment</td>
			<td style="width:124px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:121px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila incubator</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fly cage</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">embryo collection tube</td>
			<td>Genessee Scientific</td>
			<td>46-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-202-037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">double-stick tape</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">paintbrush</td>
			<td>Generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissection needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-965A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass cover slip</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3306</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microscope slide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4445</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">dissecting microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Stemi-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">capillary needle</td>
			<td>FHC</td>
			<td>30-30-1</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">microinjection needle holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MINJ4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MN151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>Primo-Vert</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-747A</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass Pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-063-172</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">transfer bulb</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">scintillation vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-337-7</td>
			<td>sharp object</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">14-259-260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5 ml tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">laser scanning confocal</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fixation solution</td>
			<td>(5 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">16% formaldehyde</td>
			<td>2.5 ml</td>
			<td></td>
			<td>toxic chemical</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10x PBS</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5 M EGTA</td>
			<td>0.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">RNase free H2O</td>
			<td>1.5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Halocarbon oil mix</td>
			<td>(10 ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 700 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">halocarbon oil, 27 W</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in drosophila embryos.

초파리 배아 모두 거친 외부 환경으로부터 내부의 세포를 보호 할뿐만 아니라, 세포의 항상성을 유지하는 역할을 강력한 표피층을 개발한다. 유리 바늘 구멍 부상 생활 배아 또는 유충의 지역화 기자 신호에 의해 시각하실 수 있습니다 상처 전사 기자가 활성화 빠른 표피 상처 반응을 일으킬 수있는 직접적인 방법을 제공합니다. 구멍을 뚫거나 레이저 부상은 상처 사이트에 혈구 세포의 채용을 촉진 신호를 제공한다. 놀랍게도, 최종 단계의 배아에서 심각한 (철저히) 빵꾸 부상은 거의 같은 부상 배아의 90 % 이상이 배아가 펑크 사이트에서 체액 즉시 누출을 최소화하는 오일 매체에 주입 할 때 성년 생존과 정상적인 배아 발달을 방해하지 . 상처 절차는 AG에 태아의 수동 정렬을 포함하여 초파리 배아의 미세 조작을 필요로하지AR 플레이트와 슬라이드를 현미경 정렬 된 배아의 전송. 초파리 표피 상처 반응 분석은 상처 치유뿐만 아니라 상처 치유를 촉진 잠재적 인 화합물을 선별하는 방법을 촉진 생물학적 기능의 다양한 유전 적 요건을 테스트하는 퀵 시스템을 제공한다. 짧은 수명주기 쉬운 배양 루틴이 초파리 강력한 모델 생물합니다. 초파리 깨끗한 상처 치유 규제 보존 찾을 수있는 훌륭한 시스템을 제공 아직 조사를 받고있다 방법으로, 타고난 면역 반응으로, 표피 재생 응답을 조정하기 위해 나타납니다 초파리와 포유 동물의 표피 상처를 입기에 공통 메커니즘.

이 방법에 나타낸 결과를 얻으려면, 녹색 형광 단백질 (GFP)의 오픈 리딩 프레임은 도파 디카 르 복실 라 아제 (DDC) 및 DsRed를가 (티로신 수산화 효소로부터 상처 인핸서 서열에 융합에서 프로모터 / 상처 유발 인핸서 서열에 융합 PLE) 4,6. 라이브 Drosophila의 배아에서 형광 상처 기자 단백질의 성숙 최적의 4-6 충분한 단백질의 축적을위한 시간을 시각화 할 수 있습니다 부상 후 시간뿐만 아니라 형광 상태 (15)로 산화하는 형광 단백질을위한 시간이다. 기자 현지화를 관찰하기 위해, 화합물 형광 현미경은 충분하다. 기자 현지화의 높은 배율을 관찰하기 위해, 공 초점 현미경은 여러 광학 부분의 최대 투사 (그림 1)를 생성하는 최적입니다. Drosophila의 배아의 생체 내 이미징 공 촛점은 RA 복잡합니다배아의 PID 기복. . 배아의 전체보기는 20X 목적으로 취득 할 수 있고, 상처 사이트의 근접 촬영보기 40X 목적으로 얻을 수있다. 표피 상처 기자 현지화의 상위 뷰는 10 연속 1 ㎛의 광학 부분에 몇 군데 있습니다. 표피 상처 기자 현지화의 측면 뷰는 40 연속 1 μm의 광학 부분에 몇 군데 있습니다. 표준 유전자 횡단 방법을 사용하면, 유전자 변이 권취 기자 조합 될 수있다. 이 논문에서 제시 한 예는 Flotillin-2 (FLO-2)이다, 때문에 (P 요소의 삽입에 의해 생성 NULL 대립 유전자) 손실 함수와 기능 획득 (모든 세포에서 유비쿼터스 식으로 생성 과발현) 돌연변이의 FLO-2 FLO-2 유전자의 제품은 기자들에게 9 상처 DDC-GFP의 현지화를 억제하기 위해 필요하고 충분한 설명 (그림 2A와 2B). MI를 사용하여croinjection 프로토콜, 그것은 화학 솔루션 superactivates의 도입 또는 상처 기자의 지역화를 억제하는지 여부를 테스트 할 수 있습니다. 화학적 부상 배아 동시에 부상 및 1 % 톨루이딘 블루 염색 및 가용화 된 화합물의 1:4 비율로 주입 하였다. 톨루이딘 블루 염색은 체강에 주입되는 용해 된 화합물의 시각적 확인을 허용했다. 제어 배아는 화학하지 않고 1 % 톨루이딘 블루 염색 및 고용 1:4 비율을 포함 부러진 바늘로 부상했다. 본 논문에서 제시된 두 가지 예는 과산화수소이다 (H 2 O 2) 및 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD), 모두 화학 솔루션은 전 세계적으로 DDC-GFP의 현지화 기자 상처를 활성화하기에 충분하기 때문에 9 (그림 2C와 2D) . 과산화수소 (H 2 O 2) H에서 희석 2 O M. 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD) 0.6은 1m에 용해 된M NaOH를 3 mm로. 배아 고정 프로토콜을 사용하면, 상처 사이트를 둘러싸고, 국소 영역에서 권취 반응 유전자의 전사 활성을 검출 할 수있다. 이 논문에서 제시 한 예는 DDC와 PLE 성적 4,6,9 (그림 3a 및 3b)를 검출하기 위해 RNA 프로브의 현장 하이브리드입니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> 그림 1. DDC-GFP 및 PLE-DsRed를은 (B). (A) DDC-GFP 상처 기자의 높은보기. 부상 야생 형 배아 기자 현지화. 명 시야 및 형광 이미지를 상처 PLE-DsRed를의 높은보기 기자 상처. 모든 이미지는 20X 목적으로, 라이카 SP2 공 초점 현미경에 수집되었다. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널에서 점선의 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 그림 2. 유전자 돌연변이 배경과 화학 미세 주입 배아. 명 시야 및 부상 Flotillin-2 (FLO-2) 돌연변이 배아의 형광 이미지의 DDC-GFP 상처 기자의 현지화. (A) 손실의 기능 FLO-2 {KG00210} 돌연변이, 모든 상피 세포 걸쳐 리포터 활성의 팽창. (B) 기능 획득 FLO-2 (아르마딜로-GAL4, UAS-Flo2) 돌연변이 모두 상피 세포 걸쳐 리포터 활성의 억제. (C) 과산화수소 (H 2 O 2 ) 솔루션 미세 주입, 담당자의 확장의 orter 활동 모든 표피 세포에 걸쳐. (D) 메틸-β-사이클로 덱스트린 (MβCD) 솔루션 미세 주입, 모든 표피 세포에 걸쳐 기자 활동의 확장. 모든 이미지는 20X 목적으로, 라이카 SP2 공 초점 현미경에 수집되었다. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널의 점선은 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 그림 3. 상처 반응 유전자의 RNA 전 사체의 탐지. 부상당한 야생 형 배아 현장 하이브리드와 RNA의 검출의 형광 이미지. DDC (A)와 PLE (B) RNA 전 사체는 상처 사이트 주위에 축적된다. 모든 이미지는 컬렉터 엔진이었다20X의 목적으로 라이카 SP2 공 초점 현미경에 테드. 화살표는 상처의 위치를​​ 표시합니다. 데이터 패널의 점선은 배아의 윤곽을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="표 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> 표 1. 표피 상처 응답 기자의 요약. 네 상처 응답 기자 (DDC, PLE, MSN, KKV)의 삽입 내용은 두 번째와 세 번째 염색체에 사용할 수 있습니다. 상처 응답 기자의 모든 야생형 배경 (예 : &quot;로컬&quot;표현형)에 찔린 상처의 사이트를 주변 표피 세포의 제한된 수의 형광 유전자 (GFP 또는 DsRed를)를 활성화합니다. DDC와 MSN 상처 응답 기자에 GRH가 필요 fluorescen의 활성화찔린 상처 (예를 들어, &quot;없음&quot;표현형) 후 CE 유전자. 상처 기자의 모든 구멍 부상 (예 : &quot;글로벌&quot;표현형) 후 형광 유전자의 국산화 FLO-2가 필요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos. at JoVE.com

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다.

미세 주입 상처 분석 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 표피의 현지화는 응답 기자의 상처<em&gt; 초파리</em&gt; 태아.

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

12.3K 조회수.  The City College of New York.  아주 늦은 단계 Drosophila의 배아의 배아 표피 빠른 찔린 상처의 응답 분석을위한 생체 시스템을 제공하고, 포유 동물 모델로 번역 상처 치료에 대한 연구를 진행하기 위하여 유전자 조작 물질 또는 화학 물질 미세 주입 치료와 결합 될 수있다. 

비디오: Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

연구

생체공학

Therapeutic Gene Delivery and Transfection in Human Pancreatic Cancer Cells using Epidermal Growth Factor Receptor-targeted Gelatin Nanoparticles

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. Urgent need exists to develop novel clinically-translatable therapeutic strategies that can improve on the dismal survival statistics of pancreatic cancer patients. Although gene therapy in cancer has shown a tremendous promise, the major challenge is in the development of safe and effective delivery system, which can lead to sustained transgene expression. 
Gelatin is one of the most versatile natural biopolymer, widely used in food and pharmaceutical products. Previous studies from our laboratory have shown that type B gelatin could physical encapsulate DNA, which preserved the supercoiled structure of the plasmid and improved transfection efficiency upon intracellular delivery. By thiolation of gelatin, the sulfhydryl groups could be introduced into the polymer and would form disulfide bond within nanoparticles, which stabilizes the whole complex and once disulfide bond is broken due to the presence of glutathione in cytosol, payload would be released 2-5. Poly(ethylene glycol) (PEG)-modified GENS, when administered into the systemic circulation, provides long-circulation times and preferentially targets to the tumor mass due to the hyper-permeability of the neovasculature by the enhanced permeability and retention effect 6. Studies have shown over-expression of the epidermal growth factor receptor (EGFR) on Panc-1 human pancreatic adenocarcinoma cells 7. In order to actively target pancreatic cancer cell line, EGFR specific peptide was conjugated on the particle surface through a PEG spacer.8
Most anti-tumor gene therapies are focused on administration of the tumor suppressor genes, such as wild-type p53 (wt-p53), to restore the pro-apoptotic function in the cells 9. The p53 mechanism functions as a critical signaling pathway in cell growth, which regulates apoptosis, cell cycle arrest, metabolism and other processes 10. In pancreatic cancer, most cells have mutations in p53 protein, causing the loss of apoptotic activity. With the introduction of wt-p53, the apoptosis could be repaired and further triggers cell death in cancer cells 11. 
Based on the above rationale, we have designed EGFR targeting peptide-modified thiolated gelatin nanoparticles for wt-p53 gene delivery and evaluated delivery efficiency and transfection in Panc-1 cells.

Type B gelatin-based engineered nanovectors system (GENS) was developed for systemic gene delivery and transfection in the treatment of pancreatic cancer. By modification with epidermal growth factor receptor (EGFR) specific peptide on the surface of nanparticles, they could target on EGFR receptor and release plasmid under reducing environment, such as high intracellular glutathione concentrations.

표피 성장 인자를 사용하여 인간의 췌장 암 세포의 유전자 전달 및 Transfection은 다행 기반 엔지니어링된 Nanovectors를 수용체 타겟

More than 32,000 patients are diagnosed with pancreatic cancer in the United States per year and the disease is associated with very high mortality 1. ...

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

에 대한 간단한 마이크로 유체 장치<em&gt; 생체 내</em의&gt; 이미징<em&gt; C. elegans</em&gt;<em&gt; Drosophila</em&gt;와 Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised the only means available, the development of noninvasive imaging modalities (echocardiography, MRI, CT) having high temporal and spatial resolution provide a new window for quantitative diastolic function assessment. Echocardiography is the agreed upon standard for diastolic function assessment, but indexes in current clinical use merely utilize selected features of chamber dimension (M-mode) or blood/tissue motion (Doppler) waveforms without incorporating the physiologic causal determinants of the motion itself.&#160;The recognition that all left ventricles (LV) initiate filling by serving as mechanical suction pumps allows global diastolic function to be assessed based on laws of motion that apply to all chambers. What differentiates one heart from another are the parameters of the equation of motion that governs filling. Accordingly, development of the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism&#160;has shown that the entire range of clinically observed early transmitral flow (Doppler E-wave) patterns are extremely well fit by the laws of damped oscillatory motion.&#160;This permits analysis of individual E-waves in accordance with a causal mechanism (recoil-initiated suction) that yields three (numerically) unique lumped parameters whose physiologic analogues are chamber stiffness (k), viscoelasticity/relaxation (c), and load (xo).&#160;The recording of transmitral flow (Doppler E-waves) is standard practice in clinical cardiology and, therefore, the echocardiographic recording method is only briefly reviewed. Our focus is on determination of the PDF parameters from routinely recorded E-wave data.&#160;As the highlighted results indicate, once the PDF parameters have been obtained from a suitable number of load varying E-waves, the investigator is free to use the parameters or construct indexes from the parameters (such as stored energy 1/2kxo2, maximum A-V pressure gradient kxo, load independent index of diastolic function, etc.) and select the aspect of physiology or pathophysiology to be quantified.

Accurate, causality-based quantification of global diastolic function has been achieved by kinematic modeling-based analysis of transmitral flow via the Parametrized Diastolic Filling (PDF) formalism. PDF generates unique stiffness, relaxation,&#160;and load parameters and elucidates &#39;new&#39; physiology while providing sensitive and specific indexes of dysfunction.

매개 변수화 이완기 충전 형식주의를 통해 Transmitral 흐름의 운동 학적 모델링 기반의 분석에 의하여 세계적인 이완기 기능의 정량화

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of cutaneous wound healing on the skin. Existing methods, however, still rely on visual inspections through various microscopic tools and devices that normally include high-cost, sophisticated systems and require well trained personnel for operation and data analysis. Here, we describe methods and protocols to fabricate a conformal, skin-like electronics system that enables conformal lamination to the skin surface near the wound tissues, which provides recording of high fidelity electrical signals such as skin temperature and thermal conductivity. The methods of device fabrication provide details of step-by-step preparation of the microelectronic system that is completely enclosed with elastomeric silicone materials to offer electrical isolation. The experimental study presents multifunctional, biocompatible, waterproof, reusable, and flexible/stretchable characteristics of the device for clinical applications. Protocols of clinical testing provide an overview and sequential process of cleaning, testing setup, system operation, and data acquisition with the skin-like electronics, gently mounted on hypersensitive, cutaneous wound and contralateral tissues on patients.

This article presents methods to fabricate and characterize a conformal, skin-like electronic system and protocols for the use in clinical applications, particularly on cutaneous wound management.

양적, 피부가 상처 관리를위한 등각 피부와 같은 전자 시스템의 제조 및 특성

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence microscopy and environmental scanning electron microscopy (ESEM) of whole cells in hydrated state. Fluorescent quantum dots (QDs) were coupled to EGFR via a two-step labeling protocol, providing an efficient and specific protein labeling, while avoiding label-induced clustering of the receptor. Fluorescence microscopy provided overview images of the cellular locations of the EGFR. The scanning transmission electron microscopy (STEM) detector was used to detect the QD labels with nanoscale resolution. The resulting correlative images provide data of the cellular EGFR distribution, and the stoichiometry at the single molecular level in the natural context of the hydrated intact cell. ESEM-STEM images revealed the receptor to be present as monomer, as homodimer, and in small clusters. Labeling with two different QDs, i.e.,&#160;one emitting at 655 nm and at 800 revealed similar characteristic results.

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative light- and electron microscopy of whole cells in hydrated state. The label contained fluorescent quantum dots. The protocol can be used to study the stoichiometry of EGFR at the single molecule level.

상호 현미경을 사용하여 본래 세포의 표피 성장 인자 수용체의 화학 양론을 공부

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although RNA interference (RNAi) has proved to be a powerful tool for studying WCR biology, it has its limitations. Specifically, RNAi itself is transient (i.e. does not result in long-term Mendelian inheritance of the associated phenotype), and it requires knowing the DNA sequence of the target gene. The latter can be limiting if the phenotype of interest is controlled by poorly conserved, or even novel genes, because identifying useful targets would be challenging, if not impossible. Therefore, the number of tools in WCR&#39;s genomic toolbox should be expanded by the development of methods that could be used to create stable mutant strains and enable sequence-independent surveys of the WCR genome. Herein, we detail the methods used to collect and microinject precellular WCR embryos with nucleic acids. While the protocols described herein are aimed at the creation of transgenic WCR, CRISPR/Cas9-genome editing could also be performed using the same protocols, with the only difference being the composition of the solution injected into the embryos.

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Here we present protocols for collecting and microinjecting precellular western corn rootworm embryos for the purpose of performing functional-genomic assays such as germline transformation and CRISPR/Cas9-genome editing.

Microinjection 웨스턴 옥수수 Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, 배아의 생식 변환, 또는 CRISPR/Cas9 게놈 편집과

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

엄밀한 포함의 고정 및 스테인드, 전체, 마이크로 단층에 의해 섹션-무료 3D 조직학에 대 한 밀리미터 단위 표본

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...