Needle wounding methods for C. elegans were first developed by Nathalie Pujol and Jonathan Ewbank; we thank Nathalie Pujol for comments on the manuscript. Work in our laboratory on C. elegans epidermal wound repair is supported by a grant from the NIH to A.D.C. (R01 GM054657).

다음 프로토콜은 C.에 대한 자세한 절차를 설명 엘레 피부 상처와 상처 응답을 분석합니다. 1. 바늘 상처 3,4 <ol><li> 표준 NGM (선충 성장 매체) E.와 함께 접시에 건강한 unstarved 웜 성장 20 ° C 배양기에서 유지 음식으로 대장균 OP50 박테리아,. 참고 : NGM 한천 플레이트와 C의 일상 재배하는 방법 엘레 www.wormbook.org (6)에서 확인할 수있다. </li><li> 20 ° CO / N에서 부상과 문화 전에 갓 시드 플레이트 일일 25 L4 무대 웜을 선택합니다. </li><li> 부상하기 전에 바늘 풀러를 사용하여 모세 혈관에서 바늘을 빼냅니다. 상처에 사용되는 바늘의 C. 마이크로 인젝션에 사용되는 것과 동일하다 엘레. </li><li> 모든 벌레 젊은 성인 단계에 있는지 확인합니다. 약 30 분 동안 얼음에 벌레의 접시를 놓습니다. 냉각 동물 바늘 상처를 용이 부진 할됩니다. <li> 해부 실체 현미경으로 얼음에서 한천 플레이트를 제거합니다. 웜 픽을 사용하여 한천 플레이트의 중심에 25 벌레를 이동합니다. </li><li> 더 쉽게 바늘을 잡고 100 μL 피펫 팁에 바늘을 놓습니다. 생식선을 피하고, 바늘 웜 본체의 전방 또는 후방 부 천공. 일반적으로, 후방 및 전방 인두 생식선 사이 또는 후방 생식소와 항문 사이에 감겨 시도. 재사용 바늘 여러 번, 깨지까지. 주 : 동물에 ~ 5 ~ 10 μm의 침투, 상처가 표피와 피부에 구멍을 간략하게, 부드러운 거시기 있는지 확인. 바늘 ANIM를 입력해야합니다피부 알 대략 직각. 상처는 내부 장기에 손상이 없는지, 또는 신체의 즉각적인 파열의 원인이 안됩니다. 세포질 상처 후 몇 초 스며 나오는 모습을 소량 관찰; 휴대 내용이 장시간에 걸쳐 누출 그러나 동물들은 살아남지 못할 것이다. 최적 영상화, 횡 표피 syncytium (hyp7) 또는 측면 솔기 상처. 참고 :이 절차는 유리 바늘의 사용을 포함한다. </li><li> 웜은 20 ° C에서 다음 실온에서 문화를 복구 할 수 있습니다. 아래에 설명 된 분석의 수에 의하여 바늘 상처의 성공을 판사. 야생형 동물의 95 % 이상은 바늘이 젊은 성인 단계에서 부상 후 24 시간 생존. 유충 세 이상 성인에서 부상의 효과는 아직 광범위하게 분석되지 않았습니다. </li></ol> 2. 레이저 상처 3 보다 정확한 상처를 수행 할 펨토초 레이저 조사 (800 나노 미터)를 사용합니다. <ol><li> 한천 페이지 준비용융 2 % 한천 7 유리 슬라이드에 광고. C. 패드의 라이브 영상을 위해 사용 한천 패드 비슷 확인 엘레. </li><li> 웜 선택과 아가로 오스 패드에 10 젊은 성인 웜을 전송, 12 mM의 levamisole을 용액 2 μL 드롭을 추가합니다. 동물과 커버 슬립와 액체를 커버. 벌레가 마비 1-2 분을 기다립니다. </li><li> 회전 디스크 공 초점 현미경 상으로 유리 슬라이드를 놓습니다. 벌레를 찾아 100X의 목적으로 측면 전방 또는 후방 세포 융합 표피 (NA 1.4-1.46)에 초점을 무대로 이동합니다. </li><li> 140 메가 와트 펨토초 레이저의 파워를 설정 (목적 전에 측정). 80 MHz의 반복율로 펨토초 레이저를 사용한다. 참고 : (20 밀리로 구분) 200 밀리 초 각의 두 펄스가 우리 손에 상처 충분합니다. </li><li> 표피 세포의 꼭대기의 표면에 초점 표피 상처. 세포질 (버블)의 현지 중단, 또는 로컬 표백 O를 관찰사용 된 형광 마커 바. 참고 : 펨토초 레이저를 사용하는 경우 적절한 레이저 안전 절차를 따르십시오. 이러한 두 광자 현미경에서와 펨토초 레이저를 사용하여 라인 또는 포인트 스캔 레이저 상처에 대한 충분한 전력을 제공해야한다. 참고 : 우리는 다른 레이저를 사용하여 직접 경험을하지 않지만, 원칙 상처에 (C. 세포 절제 엘레 간스에서 사용) 기존의 UV 레이저를 사용하여 수 있어야한다. 선택적으로, 표피 (N. 푸욜, 개인 통신) 상처는 디스크 공 초점을 회전에 (FRAP) 모듈을 광표백 후 형광 복구를 사용합니다. </li></ol> 상처에 표피 칼슘 응답 3. 시각화 <ol><li> 유전자 변형 C.를 사용하여 성인 상피 세포 특이 적 프로모터 COL-19 (그림 1A의 제어하에, 표피 (예 : GCaMP 시리즈의 것과 같은) 칼슘 센서를 표현 엘레 균주, 유전자는에 나열되어 있습니다 <stroNG&gt; 표 1). 형질 전환 유전자 발현 수준에 대한 내부 통제 등 tdTomato로 적색 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 유전자를 사용합니다. 참고 : 우리는 표피 tdTomato 형광이 상대적으로 안정적으로 유전자 발현을위한 내부 통제로 tdTomato를 사용하고 GCaMP 영상을 방해하지 않습니다. </li><li> 표피에 트리거 칼슘 상승 부상 바늘과 레이저 모두. 니들 상처 용이 스피닝 디스크 촛점을 수행 할 수 없습니다 그러나, 레이저 상처는 칼슘 응답 (도 1)의 정량 분석을하는 것이 바람직하다. </li><li> 100X의 목적으로 회전 디스크 공 초점 (NA 1.4-1.46) 및 적절한 필터 세트를 사용하여 다차원 획득 모드 (간격 시간 114 밀리 초 여기 레이저 노출 2 초)의 시간 경과 이미지를 획득 (GFP 필터는 GCaMP3에 대해 작동합니다). 참고 : 칼슘 RESP를 검사하는 데 약 2 시간 동안 시간 경과 이미지마다 30 초를 취득긴 시간의 과정을 통해 부상에 온세. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 백그라운드에서 표피 세포 세포질 다섯 중심 다섯 관심있는 (ROI)의 열 동등한 영역에서 평균 GCaMP 형광을 측정한다. </li><li> 그때 부상 전에 배경 5의 ROI 평균을 감산 표피에서의 ROI에서 5 형광의 평균을 기준선 형광 (F 0)을 얻었다. 기준선 [(F T는 -F 0) / F 0]에 대한 변화의 비율 ΔF 형광의 변화를 표현한다. </li></ol> 부상 후 F - 굴지 역학 4. 시각화 <ol><li> 주 : 바늘 상처에 응답하여, 서서히 상처 주위 폐쇄 상처 부위에서 액틴 링을 관찰한다. 이 프로토콜 부 분석법 액틴 링 직경을 측정함으로써 폐쇄 권취. </li><li> 이러한 융합 초파리 moesin 액틴 결합 도메인으로 F - 굴지 마커를 표현하는 유전자 변형 벌레를 생성GFP, 예컨대 (트랜스 juIs352) COL-19 (도 2a)로 표피 특이 적 프로모터의 제어하에 발현. 참고 : 우리는 Lifeact 또는 F-tractin (게시되지 않은 결과)로 도메인 마커 바인딩 다른 액틴을 사용하여 유사한 결과를 얻었다. </li><li> P COL-19- GFP-moesin 유전자 변형 웜에 상처 바늘을 수행합니다. 바늘 상처 후 ~ 5 분으로 상처 부위 주변 GFP-moesin의 반지를 관찰합니다. 액틴 링 직경이 작아지고 결국 야생형 동물 (그림 2A)에 부상 2 ~ 3 시간 게시물을 닫습니다. </li><li> 유리 슬라이드에 2 % 한천 패드를 준비하고 12 mM의 2 μL의 levamisole 용액에 패드 (10) 상에 웜을 전송. 기존의 공 초점 현미경을 사용하여 부상 후 이미지 GFP-moesin 반지 1 시간. 참고 : 사용 공 초점 현미경은 1 시간 부상 후 액틴 링의 Z-스택 (13 X 0.5 μm의)을 취득합니다. </li><li> 부상 후 액틴 링의 직경을 측정한다. 표피 G를 정량하는 방법FP-moesin 먼저 Z 스택의 최대 강도 투사을 다음 4 라인 스캔을 그릴 GFP-moesin 링을 통해 (서로 45 °에서). 링 직경은 4 개의 라인 스캔 (그림 2B)의 피크 거리에 평균 피크로 정의된다. 이미 닫은 반지를 들어, 직경은 0 μm의로 정의된다. 참고 :이 야생형에 상처 봉합 과정을 통해 약 절반 방법이기 때문에 F - 굴지 링 편리 부상 1 시간 게시물을 측정한다. F 액틴 링은 또한 상처 폐쇄 시간 코스를 유도하도록 여러 시점에서 측정 될 수있다. 상처 폐쇄의 시간 경과 영화의 levamisole 고정화 웜을 사용하여 디스크 공 초점 현미경을 회전 얻을 수있다. </li></ol> 표피 항균 펩타이드의 5 분석 유도 참고 : 상처도 C에서 선천성 면역 반응을 유발 엘레 피부. 항균 펩타이드 (AMPS)를 코딩하는 유전자의 전사 산업사입니다표피 uced. NLP-29 (신경 펩타이드와 같은 단백질) AMP 강력 4 명이 부상에 의해 유도된다. 표피 상처 후 AMP 발현을 조절하는 방법을 개별 AMP 사체 레벨을 검출하는 트랜스 제닉 리포터 또는 실시간 PCR을 사용하여 분석한다. <ol><li> 4 명이 부상에 대한 선천성 면역 반응에 대한 유전자 변형 기자 분석. </li><li> 내부 통제로 P의 NLP-29- GFP 및 P COL-12을 DsRed를 포함하는 유전자 변형 기자 frIs7을 표현 성인 동물 (프로토콜 1과) 바늘 상처를 수행합니다. GFP 긴 패스 필터에 어두운 빨간색이나 주황색 unwounded 성인 동물을 관찰한다. 참고 : 상처 야생 형 웜 P의 NLP-29 -GFP 발현을 유도하지만 GFP 긴 패스 조명 아래 오렌지, 노란색 또는 녹색을 표시 벌레 결과, P의 COL-12 -dsRed에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 PMK-1 또는 p38 MAPK 경로에서의 유전자의 기능의 상실 nsy-1 차단 NLP-29 -GFP4 명이 부상 후 유도. P의 NLP-29- GFP는 유충 단계에서 높은 수준으로 발현된다 </li><li> 젊은 성인 동물 AMP 유도 분석을 수행합니다. unwounded 제어 동물 GFP의 낮은 수준을 가지고 있는지 확인하십시오. 주 : P-29- NLP GFP 발현은 또한 삼투 스트레스 (8)에 의해 유도되고, 다른 환경 스트레스에 민감 할 수있다. </li><li> 상처 후 6 시간은 GFP 긴 패스 필터와 범위를 해부 형광을 이용하여 P의 NLP-29 -GFP 유도 (그림 3) 9이 웜의 수를 점수. 참고 : 1 시간 후 상처의 P NLP-29- GFP가 눈에 띄게 유도에서, 다음 6 시간 후 - 상처에 대한 피크에 도달하고하면 24 시간 후 상처까지 상승 남아. 시각 득점 4,9에 의해 발현을 정량화. 대안 적으로, 형광 활성화 웜 소터 4를 사용 발현 수준을 정량화. 웜 분류기를 들어, 적어도 50 동물 부상 될 필요가있다. </li><li> ...로서 실시간 PCR 분석AMP 개별 유전자의 전 사체 수준을 ntitating. 여러 유전자 ​​분석 성적 수준 : NLP-29, NLP-30, CNC-1 및 CNC-5. </li><li> 야생형 또는 돌연변이 웜에 상처 바늘을 수행합니다 (프로토콜 1 참조) </li><li> 원하는 시간에 50 명이 부상 웜 및 50 unwounded 웜 (예 : 3, 6, 24 시간) 후 상처를 수집합니다. </li><li> RNA는 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 압축을 풉니 다. </li><li> 상업 역전사 효소 키트를 사용하여 총 20 μl의 cDNA의를 얻기 위해 역전사를 수행합니다. </li><li> RT-PCR의 경우, 녹색 형광 및 수퍼 믹스와 0.2 μM 프라이머와 조합하여 각 샘플 0.2 μL의 cDNA (1/40)을 사용한다. RNA의 질을 비교하기 위해 기준으로서 AMA-1 또는 SNB-1 RT-PCR을 사용한다; 내부 통제 (AMA-1 또는 SNB-1)로 정규화하여 AMP 상대적 발현 량을 비교, 또는 규범에 의해 (부상 웜 / unwounded 웜에 AMP 유도) 배 유도 후 상처를 비교내부 통제를 지향 모델. 참고 : CNC-1과 CNC-5는 누구의 전사 10 명이 부상에 의해 활성화되는 가족 항균 펩티드를 caenacin 있습니다. 전형적으로, 바늘 상처가 발현을 유도 (CNC-1 ~ 500 배) 4 시간 10 시간 걸쳐. 출판 작업에 사용되는 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다. </li></ol> 6. 분석 생존 후 부상 <ol><li> 참고 : 칼슘 의존 상처 수리 경로 및 선천성 면역 반응 경로 : 상처는 표피에 적어도 두 개의 독립적 인 신호 전달 경로를 활성화합니다. 두 경로 멸균 상처의 전체 생존을 위해 필요합니다. 돌연변이 또는 RNAi의 치료는 상처 치유에 영향을 미치는 여부를 테스트하기 위해, 24 ~ 48 시간 포스트 상처에서 생존을 측정한다. 선택적으로, 장에 -4,9- 부상의 효과를 결정하기 위해 종래의 수명 세이를 사용한다. </li><li> (젊은 성인 (L4 + 24 시간) 웜에 50 벌레 부상 바늘을 수행, 반복 세비위의 프로토콜 한 다음 RAL 회). 컨트롤과 같은 unwounded 웜의 동등한 수를 유지한다. </li><li> 생존에게 (새로운 한천 판 매 24 시간에 전송 부상 웜) 매 24 시간을 확인합니다. 이러한 GTL-2 또는 사격-1, 정규화 unwounded 제어 동물로 상처 수리에 결함이 돌연변이 체에서 부상 후 50 %의 생존율 ~ 24 시간을 관찰한다. 죽음은 웜의 선택에 의해 접촉하는 전위의 응답의 부족으로 정의된다. </li></ol>

<ol>
	<li>Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair+and+regeneration.">Wound repair and regeneration.</a> Nature. 453, 314-321 (2008).</li><li>Sonnemann, K. J., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+repair:+toward+understanding+and+integration+of+single-cell+and+multicellular+wound+responses.">Wound repair: toward understanding and integration of single-cell and multicellular wound responses.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 237-263 (2011).</li><li>Xu, S., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G&#945;q-Ca2++signaling+pathway+promotes+actin-mediated+epidermal+wound+closure+in+C.+elegans.">A G&#945;q-Ca2+ signaling pathway promotes actin-mediated epidermal wound closure in C. elegans.</a> Curr Biol. 21, 1960-1967 (2011).</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+innate+immune+responses+to+infection+and+wounding+in+the+C.+elegans+epidermis.">Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis.</a> Curr Biol. 18, 481-489 (2008).</li><li>Chisholm, A. D., Xu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+epidermis+as+a+model+skin.+II:+differentiation+and+physiological+roles.">The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. II: differentiation and physiological roles.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 879-902 (2012).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook : the online review of C. elegans biology. , 1-11 .</li><li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans.+Methods+in+cell+biology.">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans. Methods in cell biology.</a> 48, 225-250 .</li><li>Pujol, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-fungal+innate+immunity+in+C.+elegans+is+enhanced+by+evolutionary+diversification+of+antimicrobial+peptides.">Anti-fungal innate immunity in C. elegans is enhanced by evolutionary diversification of antimicrobial peptides.</a> PLoS Pathog. 4, (2008).</li><li>Tong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+regulation+of+Caenorhabditis+elegans+epidermal+damage+responses+by+death-associated+protein+kinase.">Negative regulation of Caenorhabditis elegans epidermal damage responses by death-associated protein kinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 1457-1461 (2009).</li><li>Zugasti, O., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+of+antimicrobial+peptide+expression+by+a+noncanonical+TGF-beta+signaling+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+epidermis.">Neuroimmune regulation of antimicrobial peptide expression by a noncanonical TGF-beta signaling pathway in Caenorhabditis elegans epidermis.</a> Nat Immunol. 10, 249-256 (2009).</li><li>Zhao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+chip-based+C.+elegans+microinjection+system+for+investigating+cell-cell+communication+in+vivo.">Microfluidic chip-based C. elegans microinjection system for investigating cell-cell communication in vivo.</a> Biosensor., &amp; Bioelectronics. 50, 28-34 (2013).</li><li>Jansson, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Conidia+of+Drechmeria+coniospora+to+Caenorhabditis+elegans+Wild+Type+and+Mutants.">Adhesion of Conidia of Drechmeria coniospora to Caenorhabditis elegans Wild Type and Mutants.</a> J Nematol. 26, 430-435 (1994).</li><li>Hodgkin, J., Kuwabara, P. E., Corneliussen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bacterial+pathogen,+Microbacterium+nematophilum,+induces+morphological+change+in+the+nematode+C.+elegans.">A novel bacterial pathogen, Microbacterium nematophilum, induces morphological change in the nematode C. elegans.</a> Curr Biol. 10, 1615-1618 (2000).</li><li>Hochbaum, D., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+transgenic+C.+elegans+by+biolistic+transformation.">Generation of transgenic C. elegans by biolistic transformation.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li><li>Hashmi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+nematodes+using+arrays+of+micromechanical+piercing+structures.">Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.</a> BioTechniques. 19, 766-770 (1995).</li></ol>

The authors are not aware of any competing interests.

바늘과 레이저 상처 여기 제시된 방법은 손상을 복구하는 표피 상피의 능력을 평가하기위한 보완적인 접근법을 제공한다. 바늘 상처가 표피, 표피 및 내부 가능성 기저막을 방해하는 반면 레이저 상처는 표피에 국한 될 수 비교적 지역화 및 (레이저 구성에 따라)이다. 바늘 상처보다 정확하게 병원균이나 자연 환경에서 기계적 손상에 의해 입은 상처과 유사 할 수 있습니다. 일반적으로, 바늘 상?...

피부 상처 치유 메카니즘은 기초 생물학이 관심있는 인간의 건강에 관련된. 척추 동물 및 포유 동물에서 상처 치유가 코디 응답 여러 조직 및 1 시그널링의 복잡한 시리즈를 포함한다. 많은 간단한 유전자 모델 생물은 피부 상처 (2)를 치유 할 수있다. 이는 피부 상처 복구 유전자 취급 용이 모델을 분석하는 것이 흥미 롭다. 우리와 다른 피부 상처에 대한 새로운 모델이 3,4 치유로 예쁜 꼬마 선충을 사용하기 시작했다. 이 프로토콜의 목적은 C.을 사용하는 연구자의 ​​광범위한 세트를 활성화하는 것 도구로 elegans의 표피 상처 치유의 분자 및 세포 메커니즘을 조사합니다. C. 엘레 피부 (피하도라고도 함) 및 표피 세포 외 5 표피를 포함한다. 성인 표피가 가장 큰 k를 syncytium 인 multinucleate syncytia의 소수로부터 형성된다nown으로 hyp7. 표피는 선 단면에 표피를 분비 단순한 상피이다. 피부는 적극적으로 피부를 관통 병원균에 대한 방어 및 작은 상처 (4)를 복구 할 수 있습니다. C.의 상처 수리 엘레 피부 모두 야생형 동물 바늘, 또는 레이저 조사에 의한 로컬 피부 손상에 의한 작은 천공 상처 견딜 수 생존 거의 견고하다. C. 엘레 피부 상처는 표피 선천성 면역 반응, 상처 폐쇄 및 흉터 형성 (4)를 포함하여 응답의 제품군을 트리거합니다. 성인 표피 포스트 - 유사 분열하고, 상처 치유 표피 증식 또는 세포 이동과 반대로 지방 세포 반응을 포함한다. 우리는 피부에 상처가 막 TRPM 채널 GTL-2 및 내부 칼슘 저장 (3)을 필요로하는, 칼슘 2 + 표피에 큰 지속적인 증가를 유발 보여 주었다. 표피 칼슘 신호에서 F - 굴지 고리의 형성과 폐쇄 WO 필요싶게 사이트. 상처를 입는 또한 NLP-29 암페어의 전사를 활성화 선천성 면역 반응을 유도한다. 앰프의 상처에 의한 전사는 TIR-1 표피 4 자율적으로 행동 / PMK-1 P38의 MAP 키나제 캐스케이드에 따라 달라집니다. 중 칼슘 신호 전달 경로 또는 선천성 면역 반응의 결함은 낮은 생존 후 상처로 이어질 것입니다. C.의 비교적 간단한 구조 elegans의 표피, 생체 내 이미징을위한 유전의 취급 용이성 및 장점은 상처 수리의 여러 측면을 연구하기 위해 그것에게 우수한 시스템을 확인합니다. 바늘 상처 및 레이저 상처 : 여기에서 우리는 상처의 두 가지 일반적인 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 바늘 상처는 (바늘 풀러 제외)에는 전문 장비가 필요하지 않으며, 경험 하루에 벌레 수백 수행 할 수 있습니다. 바늘 상처는 한천 플레이트에 성장 동물에서 수행됩니다. 대조적으로, 레이저는 상처에 대해 수행된다 anesthetized 동물 커버 슬립 아래 패드 한천에 장착하고, 손상 세포 반응의 라이브 영상에 적합합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Name</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:227px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:227px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Agarose</td>
			<td style="width:227px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:227px;">CA3510-8</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Plastic Petri plate</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">T3308</td>
			<td style="width:227px;">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Levamisole</td>
			<td style="width:227px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">L9756</td>
			<td style="width:227px;">12 mM</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;"><a name="RANGE!A5">Borosilicate Glass Capillary&#160;</a></td>
			<td style="width:227px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:227px;">1B100F-4</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Needle puller</td>
			<td style="width:227px;">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td style="width:227px;">P-2000</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Worm pick (Platinum wire)</td>
			<td style="width:227px;">Tritech Research</td>
			<td style="width:227px;">PT-9010</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:87px;width:227px;">M9 solution</td>
			<td style="width:227px;">Home-made</td>
			<td colspan="2" style="width:453px;">3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Trizol</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:227px;">15596026</td>
			<td style="width:227px;">Use 500 ml for 50 worms</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">iQ SYBR Green</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td align="right" style="width:227px;">1708882</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">SuperScript III</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:227px;">18080-051</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">PCR machine</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">C1000/CFX96</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">96-well PCR tubes</td>
			<td style="width:227px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:227px;">MLL9601</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:227px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:227px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:227px;">Metamorph</td>
			<td style="width:227px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for skin wounding and assays for wound responses in c. elegans

C. elegans의 표피와 표피는 부상으로 인한 국부적 손상을 복구 할 수있는 간단하면서도 정교한 피부 층을 형성한다. 이 모델에 상처 응답 및 수리의 연구는 세포 골격과 조직 손상에 대한 게놈의 답변에 대한 우리의 이해를 조명했다. 두 개의 가장 일반적으로 사용되는 방법을 권취하기 C. 엘레 성인 피부는 미세 주사 바늘 및 지역의 레이저 조사와 거시기 있습니다. 로컬 부상 바늘은 표피, 표피 및 관련 세포 외 매트릭스를 방해하고, 또한 내부 조직에 손상을 줄 수 있습니다. 더 현지화 된 손상에 레이저 조사 결과. 상처는 상승 표피 칼슘 (초 분) 형성과 상처 사이트 (1-2 시간), 항균 펩타이드 유전자의 높은 전사에서 액틴 함유 링의 폐쇄를 포함하여 쉽게 분석 응답의 연속 (2-24 트리거 시간), 흉터 형성. 본질적으로 모든 야생형 성인 동물 여기서 상처 생존상처 수리 또는 다른 응답에 결함이있는 돌연변이로 생존을 감소 보여줍니다. 자세한 바늘과 레이저 상처에 대한 프로토콜 및 정량 상처 응답 및 복구 프로세스 (칼슘 역학, 굴지 역학, 항균 펩타이드 유도, 생존)의 시각화에 대한 분석은되게됩니다.

이러한 GCaMPs 같은 칼슘 센서 (그림 1)과 시각으로 레이저 또는 바늘 상처는 표피 칼슘 수준의 신속하고 지속적인 상승을 트리거합니다. 칼슘 상승 초 이내에 발생하고 수십 분에 대한 높은 남아있다. 재현성 부상 바늘 상처 사이트 (그림 2)에서 F - 굴지 고리의 형성을 초래; 이러한 분 이내에 나타나며, 부상 후 점차 가까이 1-2 이상의 시간. 액틴 링이 적게보다 정확한 레이?...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans at JoVE.com

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

methods-for-skin-wounding-and-assays-for-wound-responses-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

10.2K 조회수.  University of California, San Diego. The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity. 

비디오: Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the anatomy and connectivity of its nervous system has been determined from electron micrographs and refined by pharmacological assays. In this video, we describe how two complementary neural stimulants, an acetylcholinesterase inhibitor, called aldicarb, and a gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor antagonist, called pentylenetetrazole (PTZ), may be employed to specifically characterize signaling at C. elegans neuromuscular junctions (NMJs) and facilitate our understanding of antagonistic neural circuits.
Of 302 C. elegans neurons, nineteen GABAergic D-type motor neurons innervate body wall muscles (BWMs), while four GABAergic neurons, called RMEs, innervate head muscles. Conversely, thirty-nine motor neurons express the excitatory neurotransmitter, acetylcholine (ACh), and antagonize GABA transmission at BWMs to coordinate locomotion. The antagonistic nature of GABAergic and cholinergic motor neurons at body wall NMJs was initially determined by laser ablation and later buttressed by aldicarb exposure. Acute aldicarb exposure results in a time-course or dose-responsive paralysis in wild-type worms. Yet, loss of excitatory ACh transmission confers resistance to aldicarb, as less ACh accumulates at worm NMJs, leading to less stimulation of BWMs. Resistance to aldicarb may be observed with ACh-specific or general synaptic function mutants. Consistent with antagonistic GABA and ACh transmission, loss of GABA transmission, or a failure to negatively regulate ACh release, confers hypersensitivity to aldicarb. Although aldicarb exposure has led to the isolation of numerous worm homologs of neurotransmission genes, aldicarb exposure alone cannot efficiently determine prevailing roles for genes and pathways in specific C. elegans motor neurons. For this purpose, we have introduced a complementary experimental approach, which uses PTZ.
Neurotransmission mutants display clear phenotypes, distinct from aldicarb-induced paralysis, in response to PTZ. Wild-type worms, as well as mutants with specific inabilities to release or receive ACh, do not show apparent sensitivity to PTZ. However, GABA mutants, as well as general synaptic function mutants, display anterior convulsions in a time-course or dose-responsive manner. Mutants that cannot negatively regulate general neurotransmitter release and, thus, secrete excessive amounts of ACh onto BWMs, become paralyzed on PTZ. The PTZ-induced phenotypes of discrete mutant classes indicate that a complementary approach with aldicarb and PTZ exposure paradigms in C. elegans may accelerate our understanding of neurotransmission. Moreover, videos demonstrating how we perform pharmacological assays should establish consistent methods for C. elegans research.

This video demonstrates how to employ two neural stimulants, aldicarb and pentylenetetrazole (PTZ), in complementary ways to study synaptic function in the nematode, C. elegans. This complementary approach may also be used to shed light on evolutionarily conserved mechanisms for modulating neuronal synchrony and has implications for epilepsy and seizures.

C. 엘레간스 시냅틱 전송 돌연변이의 약리 특성에 대한 패러다임

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

연구

생물학

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해<em&gt; C. 엘레</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here protocols are presented for preparing embryos and adult C. elegans animals for short- and long-term time-lapse microscopy and methods for tracking and quantification of developmental processes. The methods presented are all based on C. elegans strains available from the Caenorhabditis Genetics Center and on open-source software that can be easily implemented in any laboratory independently of the microscopy system used. A reconstruction of a 3D cell-shape model using the modelling software IMOD, manual tracking of fluorescently-labeled subcellular structures using the multi-purpose image analysis program Endrov, and an analysis of cortical contractile flow using PIVlab (Time-Resolved Digital Particle Image Velocimetry Tool for MATLAB) are shown. It is discussed how these methods can also be deployed to quantitatively capture other developmental processes in different models, e.g., cell tracking and lineage tracing, tracking of vesicle flow.

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...