화이트홀 재단이 이 사업을 수행한 스크립스 연구소의 자금 지원과 스타트업 기금에 진심으로 감사드립니다.

1. 복 부 신경의 준비, 전기 생리 측정, 및 Aplysia californica의 복부 신경절에서 단일 식별 된 뉴런의 격리
<ol><li>12:12 빛:어두운 조건에서 16°C에서 인공 해수(ASW)를 순환하는 실험실 수족관에서 액량증을 유지합니다.</li>
	<li>복부 신경절의 격리.<ol>
<li>5-10 분 (동물의 체중의 30-35 %에 해당)에 대한 380 mM MgCl2 용액을 주입하여 동물을 마취.</li>
		<li>중추 신경계의 위치에 따라 복부 신경절을 식별24,28.</li>
		<li>외과수술에 의한 신경담을 제거하고 450mM NaCl, 10mM KCl, 10mM MKCl 2, 55mM MgCl2,2.5mM NaHCO3,10mM HEPES(pH 7.4)로 구성된 인공 해수에 즉시 보관한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로테아제 치료.<ol>
<li>상술한 ASW에서 희석된 0.1%의 프로테아제(dispase)를 가진 페트리 접시에서 34°C±0.5에서 30분 동안 복부 신경절을 배양한다. 참고: 사용되는 프로테아제의 양은 동물의 나이와 무게로 표준화되어야 합니다. 일반적으로, 더 오래 되고 더 큰 동물은 더 많은 protease를 요구할 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간리아 칼집의 제거.<ol>
<li>효소 치료 후, 세포 챔버의 실가드 실리콘 베이스에 간리아를 고정 (Ø = 1cm; vol. = 0.3 ml) 실온에서 ASW (유량 : 150 μl/min) 실온 (18 °C±2). 참고: 확인된 뉴런의 가시성을 높이기 위해, 20X 및 40X 배율을 가진 쌍안경 스테레오현미경을 사용하여 바닥에서 쉽게 발광할 수 있는 폴리카보네이트 유리 실린더(도1) (직경Ø= 2mm 변형 된 세포 챔버)의 상단에 신경절을 놓습니다.</li>
		<li>집게와 미세 시저를 사용하여 신경절에서 칼집을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 개의 뉴런에서 동시 전기 생리학적 기록.<ol>
<li>관심의 뉴런을 식별합니다.</li>
		<li>3 M KCl 용액으로 채워진 저항 10-15 MΩ으로 단일 세포 내 날카로운 마이크로 전극으로 뉴런을 임팔레.</li>
		<li>셀룰러 내 레코딩 시스템을 사용하여 기록된 신경 활동(10kHz 대역 패스).</li>
		<li>축사그래프와 같은 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 기록 데이터를 처리합니다. 참고: 여러 뉴런에서 녹음을 쉽게 수행할 수 있습니다. 뉴런 L7, L11 또는 R15 및 R2는 자신의 위치에 따라 쉽게 식별됩니다. 2개의 증폭기 및 2개의 마이크로조작기는 2개의 L7 및 R15 뉴런(그림2)에서동시에 기록하기 위해 요구됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약물 응용 프로그램.<ol>
<li>부드러운 파이펫팅으로 셀 챔버에 선택의 약물을 적용하거나 뉴런에 직접 주입.</li>
		<li>전기 생리학적 측정을 수행합니다. 참고: 실험 목표에 따라 약물 적용 전, 도중 및 이후에 막 전위(MP) 또는 작용 잠재력(AP)의 변화와 같은 뉴런의 다른 전기생리학적 파라미터를 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 뉴런의 격리.<ol>
<li>전기 생리학적 실험이 끝나면 ASW의 관류를 중단하고 100% 에탄올로 신경절을 씻는다.  에탄올에 노출되면 뉴런이 석화되고 미세 포셉을 사용하여 신경절에서 다른 뉴런을 손상시키지 않고 개별 뉴런을 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
		<li>스테레오현미경으로 단일 뉴런을 제거하고 얼음 감기 500 μl RNA 추출 시약을 포함하는 작은 Eppendorf 튜브로 이송하십시오. 고립 된 단일 뉴런은 향후 분석을 위해 -80 °C에서 RNA 추출 시약에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정량적 실시간 PCR에 의한 단일 뉴런 및 유전자 발현 분석에서 RNA 절연(qPCR)
<ol><li>RNA 분해를 최소화하기 위한 예방 조치: 리보누알리스 (RNases)는 RNA를 저하시키고 매우 안정적이고 활성 효소입니다. RNA를 처리하는 동안 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>RNase 비활성화 에이전트로 작업 영역과 계측기 청소.</li>
		<li>RNA를 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하고 장갑을 자주 교체하십시오.</li>
		<li>RNA를 처리하기 위해 RNase 무료 플라스틱만 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 뉴런에서 총 RNA를 격리:<ol>
<li>RNA 절연을 위한 표준 트리졸 프로토콜은 단 하나 뉴런에서 RNA를 격리하기 위하여 이용될 수 있습니다. 트리졸에 20% v/v의 클로로폼을 짧게 넣고 짧은 소용돌이로 잘 섞어드린다.</li>
		<li>튜브를 회전기에 4°C에서 10분 동안 배치합니다. 트리졸-클로로폼 믹스를 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 회전시하십시오.</li>
		<li>수성 단계를 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다.</li>
		<li>아세테이트 용액(pH 5.5)을 최종 농도0.3M, 100 ng/ml의 coprecipitant GlycoBlue, 및 RNA침전을 위해 100% 에탄올의 2.5부피를 첨가한다.</li>
		<li>샘플을 잘 섞고 하룻밤 동안 -80 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>4°C에서 20분 동안 12,000 x g의 샘플을 회전시키고 작은 파란색 펠릿이 튜브 의 바닥에 볼 수 있습니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 펠릿을 75% 얼음 차가운 에탄올850μl로 4°C에서 10분 동안 12,000 x g로 세척합니다.</li>
		<li>상체를 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 최대 7-10분 동안 공기 건조시하십시오. 참고: RNA 펠릿을건조하면 용해도가 매우 어려워집니다.
</li>
		<li>일단 건조되면, RNA 펠릿을 RNA 자유 수의 10 μl에서 재중단하고 RNA 농도를 결정합니다. 참고: 분광계를 사용하여 RNA 농도를 결정합니다. 즉시 사용하지 않을 때는 RNA를 -80°C로 저장하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 뉴런에서 aRNA 합성:<ol>
<li>시판되는 선형 RNA 증폭 시스템을 사용하여 RNA(실험 목적에 따라 하나 또는 두 개의 탄환)를 증폭시한다. 참고: 단일 뉴런의 총 RNA는 ~10-60 ng범위입니다. 증폭의 첫 번째 라운드의 예상 수율은 ~100-300 ng이며, 증폭의 두 번째 라운드는 RNA의 ~0.8-1.5 μg이다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA의 역 전사:<ol>
<li>aRNA에서 cDNA를 생성하려면 역전사 반응의 20 μl에 aRNA 1.0 μg를 사용하십시오. 이러한 목적으로 여러 키트를 시판할 수 있습니다. 참고: cDNA는 열 사이클러에서 다음 설정을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 합성되었습니다. 25°C에서 5분 42°C에서 30분 85°C에서 5분 4°C에서 유지</li>
		<li>역전사 단계 후, cDNA를 -20°C에 저장하여 장기 저장한다.</li>
	</ol></li>
	<li>프라이머 설계 및 표준화: 실시간 증폭을 위해 프라이머를 설계하기 위해 몇 가지 우수한 소프트웨어 프로그램을 무료로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>70-110 bp 앰플리통을 생성하고 상업적 인 소스를 사용하여 프라이머를 합성 하는 18-24 mer 올리고 뉴클레오티드를 선택합니다. 참고: 2~3개의 프라이머 쌍은 관심있는 각 유전자를 위해 설계되어야 합니다. 각 프라이머 세트는 qPCR에 의해 표준화되어야 합니다. 유전자 CREB1(그림 4)에사용되었던 전방 및 역 프라이머 쌍은 다음과 같습니다. 프라이머 세트 1 포워드: 5'-TGATTCTGACGCAAAAAAAAAAAAA-GA-3' 역: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTGGTAGGTAGA-3' 프라이머 세트 2 포워드: 5'-아가트GTCGATGA아가아가-3' 역: 5'-GACACACAGGAAGTCAAA-3'</li>
		<li>다운스트림 해석에 사용할 최적의 프라이머를 선택하려면 qPCR에서 Ct 값과 증폭 곡선의 모양을 모니터링합니다. 참고: PCR의 기하급수적 단계 동안 40개의 원형 증폭 및 매끄러운 곡선에서 Ct(사이클 임계값) 값을 제공하는 프라이머는 유전자 발현 분석을 위한 최적의 다.</li>
	</ol></li>
	<li>정량적 실시간 PCR (qPCR): 참고: qPCR 기계와 호환되는 적절한 튜브 또는 플레이트를 사용합니다.<ol>
<li>핵증 이없는 물로 cDNA를 5배로 희석시다.</li>
		<li>희석 된 cDNA의 2 μl에, H2O의 2 μl, 2 x SYBR 그린 마스터 믹스의 5 μl, 10 μM (각) 전방 및 역 프라이머를 포함하는 qPCR 마스터 믹스의 8 μl을 추가합니다.</li>
		<li>튜브를 닫고 cDNA와 마스터 믹스를 피펫팅 한 후 플레이트를 밀봉하십시오. 30초 동안 1,500rpm에서 부드러운 두드리고 회전하여 내용들을 섞습니다.</li>
		<li>qPCR 기계 설정으로 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

뉴런 R15는 심혈관 조절, 소화, 호흡기 및 생식시스템(30)에관여한다. AP의 정기적으로 리듬 파열 활동은 R15의 특징입니다. 결과 섹션에 도시된 바와 같이, R15 및 L7의 페어링된 레코딩은 신경리아 제제가 R15 뉴런의 활성을 보존하고 있음을 보여준다. R15 및 L7 뉴런은 Ach에 적절하게 반응했습니다. 이 신경질 제제는 8-10 시간까지 유지 될 수 있고 전기 생리 활성은 지속적으로 모니터링 될 수있?...

인간의 뇌는 거의 1,000억 개의 뉴런과 수조 개의 시냅스 연결로 매우 복잡합니다. 뉴런과 상호 작용하고 뇌에서 의 기능을 조절하는 비 신경 세포의 거의 동일한 수가 있습니다. 뉴런은 특정 행동을 조절하는 회로로 구성됩니다. 뇌 기능 및 신경 회로에 대한 이해의 발전에도 불구하고 특정 동작을 제어하는 회로 구성 요소의 정체성에 대해서는 알려진 것이 거의 없습니다. 회로의 다양한 구성 요소의 정체성에 대한 지식은 크게 행동의 세포 및 분자 기초의 우리의 이해를 용이하게하고 신경 정신 장애에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이.
해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동1-14의근본적인 신경 회로를 결정하기위한 주력이었다. Aplysia 신경계는 9개의 다른 신경통으로 조직되는 대략 20,000의 신경세포를 포함합니다. Aplysia의 뉴런은 크고 그들의 크기, 전기 적 특성 및 신경리아의 위치에 따라 쉽게 식별 할 수 있습니다. Aplysia는 연구할 수 있는 행동의 풍부한 레퍼토리가 있습니다. 잘 연구 된 행동 중 하나는 아가미 철수 반사 (GWR)입니다. 이 반사의 중앙 구성 요소는 복부 신경통에 위치하고 있습니다. GWR 회로의 구성 요소가 매핑되고 다양한 구성 요소의 기여가 결정되었습니다. 중요한 것은, GWR 회로는 연관 및 비연관적 학습5,6,15-19를겪는다. 이 반사에 대한 연구의 수십 년은 또한 학습및 기억20-24에중요한 역할을 여러 신호 경로를 확인했다.
Aplysia의 몇몇 다른 준비는 기억 저장의 세포 그리고 분자 기초를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에는 온전한 동물2,3,반전준비1,7,13,14,16 및 신경 회로의 주요 성분의재구성이 포함된다 25-29. 확인된 신경 회로의 전기 생리학적 및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경리아를 탐구하기 위한 감소된 준비는 여기에서 기술됩니다. 다음 4 개의 확인 된 뉴런 을 공부 했다. R15, 파열 뉴런, L7 및 L11, 두 개의 다른 모터 뉴런과 R2, 콜린성 뉴런을 연구했다. R2는 무척추 동물 신경계에 설명 된 가장 큰 뉴런입니다. 간단히 말해서, 이 방법론은 신경리아의 프로테아제 치료, 약리학적 치료 전후의 전기 생리학적 측정, 유전자 발현의 정량적 분석을 위한 단일 뉴런의 분리를 포함합니다. 이 방법론은 분자 분석을 여러 뉴런의 동시 기록과 결합할 수 있게 해줍니다. 이 방법론은 성공적으로 쌍 세포 내 기록에 의해 아세틸 콜린 (Ach)에 R15 및 L7 뉴런의 응답을 연구하는 데 사용되었다. 전기생리학적 측정 에 이어 R15 및 L7 및 L11 및 R2와 같은 다른 확인된 뉴런은 메모리 저장에 중요한 전사 인크레B1의 발현의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 격리되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

신경생물학의 주요 과제는 특정 행동을 지배하는 신경 회로의 분자 기초를 이해하는 것입니다. 특정 분자 메커니즘이 확인되면 퇴행성 질환이나 신경계 노화로 인한 특정 행동의 이상을 치료하기 위해 새로운 치료 전략을 개발할 수 있습니다. 해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동의 근본적인 신경 회로가 쉽게 결정될 수 있고 회로의 개별 적인 분대가 쉽게 조작될 수 있기 때문에 행동의 세포 및 분자 기초의 조사에 적합합니다. Aplysia의 이러한 장점은 학습과 기억의 신경 생물학의 몇 가지 근본적인 발견으로 이어졌습니다. 여기에서 우리는 개별 적인 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경계의 준비를 기술합니다. 간단히, 신경계에서 해부된 신경절은 신경세포가 노출되나 그대로 동물에서와 같이 신경 활성을 유지하도록 신경절 칼집을 제거하기 위해 프로테아제스에 노출된다. 이 준비는 단일 또는 다중 뉴런의 전기 생리학적 측정을 수행하는 데 사용됩니다. 중요한 것은, 간단한 방법론을 사용하여 기록을 따라, 뉴런은 유전자 발현 분석을 위해 신경질로부터 직접 분리될 수 있었다. 이러한 프로토콜은 L7 및 R15 뉴런으로부터 동시 전기 생리학적 기록을 수행하고, 아세틸콜린에 대한 반응과 분리된 단일 L7, L11, R15 및 Aplysia의R2 뉴런에서 CREB1 유전자의 양화 발현을 연구하는 데 사용되었습니다.

이 연구에서 사용 된 동물의 무게는 100-200 g에서 배열. 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 2-5 g에서 200-300 g에 구역 수색하는 동물에서 분리된 복부 신경의 신경의 전기 생리학적 측정 및 분자 분석을 실시했습니다.
프로테아제 치료의 표준화는 신경교에서 뉴런의 성공적인 전기 생리학적 측정에 중요합니다. 처음에, 다중 프로테아제(Dispase) 농도 및 지속시간이 사용되었고 R15 뉴?...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K 조회수.  The Scripps Research Institute, Florida. 해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

비디오: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

DNA 손상 감지를위한 세미 인공 분자 기계 및 이용 체외 조립에

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

연구

생체공학

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

분자 얽힘과 생체 고분자의 Electrospinnability

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

압축 된 콜라겐에 다진 조직 : 단일 무대 재건 복구를위한 세포 함유 Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

단일 벽 탄소 나노 튜브에 바이오 모방 고분자와 공학 분자 인식

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

음경 골의 해부, MicroCT 스캔 및 형태 학적 분석

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

준비, 정화, 및 지방산 포함 된 리의 사용

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

잎 반사 및 엽록소 형광 분석의 동시 측정을 통해 광합성 거동 평가

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...