O9-1 세포주 체외에서 신경 문장 세포를 공부 하기 위한 매우 유용한 도구. 그것은 연구의 다양 한 사용에 응용 프로그램의 넓은 범위에서 사용 하기 위한 큰 잠재력을 가지고. O9-1 세포는 쉽게 접근할 수 있고 실험을 위해 충분한 세포 수를 빠르게 획득하는 등 명백한 이점이 있어 신경 문장 세포의 체외 연구에 무료로 제공되는 강력한 방법입니다.
먼저 텍스트 프로토콜에 따라 O9-1 세포 배양을 위한 기초 매체를 준비합니다. 그런 다음 기초 매체를 걸게 하고 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 활성화된 STO 셀에서 조건된 기초 매체를 수집합니다.
첫째, 2 시간 동안 얼음에 지하 막 매트릭스의 알리쿼트를 해동. 이어서, 10%의 FBS로 여과된 멸균 DMEM으로 지하 막 매트릭스를 0.5mg/ml의 최종 농도로 희석시켰다. 1 시간 동안 실온에서 지하 멤브레인 매트릭스로 플레이트를 코팅합니다.
그런 다음, 플레이트를 기울이면서 지하 멤브레인 매트릭스를 흡인한다. 30분간 30°C에서 접시를 말리십시오. 플레이트에 지하 멤브레인 매트릭스를 추가할 때, 용액이 세포 특성을 유지하고 실험 사이에 불필요한 변동을 피하기 위해 균등하게 덮여 있는지 확인하십시오.
냉동 병병을 섭씨 37도의 수조에 배치하여 O9-1 세포를 회수하십시오. 용액이 완전히 액체로 변할 때까지 바이알을 천천히 소용돌이시다. 그 후, 저온 바이알에서 15ml 원심분리기 튜브로 세포 용액을 전달한다.
세포를 다시 일시 중단하기 위해 튜브에 10%FBS를 사용하여 5권의 DMEM을 튜브에 추가합니다. 180 Gs.Then에서 3 분 동안 세포를 원심 분리하고, 펠릿을 방해하지 않도록주의하여 슈퍼 나텐트를 흡인시합니다. 다음, LIF와 BFGF로 보충 조건 된 기초 매체에서 펠 릿을 다시 중단.
6 개의 우물 판에 세포를 시드하고 플레이트를 교반하여 세포를 균등하게 시드합니다. 플레이트를 교반할 때, 플레이트를 소용돌이면 세포가 중앙쪽으로 집중될 수 있으므로 수평 및 수직으로 그렇게 합니다. 그리고 그 세포가 밤새 표준 세포 배양 인큐베이터에서 부착하고 성장하도록 허용합니다.
미디어를 변경하기 전에 셀이 부착되어 있는지 확인합니다. O9-1 세포가 80%에 도달하면 지하 막 매트릭스를 해동하고 이전에 설명한 대로 지하 막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비한다. 그런 다음 멤브레인 매트릭스에 LIF 및 BFGF로 보충된 기저 미디어를 추가합니다.
DPBS 2ml로 우물을 두 번 부드럽게 헹구십시오. 그런 다음, 3분간 섭씨 37도에서 0.05%의 트립신 EDTA 1ml로 세포를 분리한다. 트립신을 동일한 양의 DMEM으로 10%FBS로 중화하여 우물의 전체 표면에 액체를 반복적으로 피펫팅합니다.
그런 다음 세포 용액을 원심분리기 튜브로 이송합니다. 그리고 180 Gs.에서 3 분 동안 원심 분리기는 세포의 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼 나텐트를 흡인합니다. 다음, 부드럽게 LIF와 BFGF로 보충 조건부 기저 미디어를 핍펫하 여 세포 펠 릿을 다시 중단.
이전에 설명된 바와 같이 코팅된 플레이트에 세포를 시드한다. 그런 다음, 세포가 표준 세포 배양 인큐베이터에서 부착하고 성장할 수 있도록 한다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 2X 동결 미디어를 준비합니다.
그런 다음 미디어를 필터링하여 소독합니다. DPBS로 플레이트의 벽을 두 번 헹구고 세포를 잃지 않도록 부드럽게 피하십시오. 다음으로 37°C에서 0.05%의 트립신 EDTA로 세포를 3분간 분리합니다.
10%의 FBS와 DMEM의 동일한 금액으로 트립신을 중화시다. 플레이트의 내용을 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리기를 180 Gs.Then에서 3분간 전송하고, 슈퍼네텐트를 흡수하고 2ml의 PBS를 추가하여 펠릿을 재보냅니다. 세포 용액을 다시 한 번 원심 분리하고 슈퍼나텐트를 흡인시합니다.
필요에 따라 튜브의 기초 매체의 양을 조정하고 동일한 양의 2X 동결 매체를 추가합니다. 다음으로, 표지된 냉동고 바이알로 세포를 옮기. 냉동고 바이알을 뚜껑이 있는 폴리스티렌 박스 안에 놓고 섭씨 80도에서 최소 24시간 동안 느린 냉각 속도를 달성합니다.
O9-1 세포에서 SIRNA 녹다운을 수행하려면 세포를 복구하고 시드합니다. 혈청이 없는 매체의 적절한 볼륨으로 리포솜을 희석시다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 혈청이없는 매체에서 SIRNA를 희석시하십시오.
그 후 제조업체의 지시에 따라 희석된 SIRNA를 희석된 리포솜에 추가합니다. 파이펫팅으로 용액을 섞고 실온에서 5분간 배양합니다. 다음으로, 세포에 SIRNA 지질 복합체의 적절한 양을 추가합니다.
이어서, 표준 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 24시간 동안 배양한다. O9-1 세포는 특정 분화 배양 조건하에서 상이한 세포 유형으로 분화할 수 있다. O9-1 세포를 골다공성으로 분화하려면 텍스트 프로토콜에 따라 골성 분화 매체를 준비하십시오.
마지막으로, 면역 염색에 의해 분화된 골다공성에서 골다공성 마커 골다공증을 검출한다. O9-1 세포를 매끄러운 근육 세포로 분화하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 분화 매체하에서 배양하고, 원활한 근육 액틴 면역 염색에 의한 분화를 평가한다. 이 프로토콜에서, O9-1 세포에서 함수의 Yap 손실을 연구하기 위해 실험을 노크하고 노크 둘 다 수행하였다.
부드러운 근육 세포 분화 조건에서, 대부분의 야생 유형 O9-1 세포는 부드러운 근육 액틴 긍정적 인 부드러운 근육 세포를 초래했다. Yap null 세포 그러나 일반적으로 SMA 양성 부드러운 근육 세포로 분화 하는 데 실패. 이것은 Yap가 매끄러운 근육 세포로 신경 문장 세포의 분화에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다.
이 절차를 시도하는 동안 전체 프로세스 중에 O9-1 세포줄을 부드럽고 조심스럽게 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 기초 막 매트릭스를 제대로 희석하고 사용하고 세포 해리에 0.05 %의 트립신을 사용하십시오. O9-1 세포 배양을 준비하는 동안 미토마이신 c로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행하는 동안 실험실 코트와 장갑을 착용하는 것과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오.
