우리는 우수한 기술 지원을 모니카 Tarnowska, 코르넬리아 알브레히트, 그리고 에바 Skoczylas에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 SNF Sinergia 부여 CRSI33-125073 PP에 의해 투자되었다.

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저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

디자이너 클레아 제 중심의 게놈 편집 방법은 크게 각각의 게놈 (10, 12)의 목표 수정에 순종하는 종의 범위를 확장했다. 생쥐에서 유전자 표적으로 ES 세포에서 두 년 이상을위한 표준 기술이다; 쥐의 ES 세포의 일부가 최근 성공 하였지만 그러나, 마우스 이외의 종에서 ES 세포에 적응하기 어려운 입증되었다. 심지어 EUCOMM, KOMP, 또는 ZFN 및 TALEN는 높은 정밀도와이 될 수 있습니다 수정의 스펙트럼에 대한 유연성을 제공하여 NorCOMM 3 게놈 편집과 같은 컨소시엄에 의해 제공 &quot;기성&quot;유전자 타겟 마우스 ES 세포 클론의 가용성 마우스 게놈에 도입했다. 클레아 제 - 매개 변이를 들고 설립자 동물은 항상 ES 세포의 배반포 주사에서 발생하는 키메라의 경우에는 해당되지 않습니다 높은 세균 줄 능력 4-6,20,21 될 것으로 보인다. 따라서, DES의 특정 경우의 미세 주입에igner의 클레아는 ​​표적으로 한 게놈 수정을 새로운 마우스 선 훨씬 빠르게 생성 될 수 있습니다. ZFN 및 TALEN의 주사로 녹아웃 마우스의 성공적인 세대는 주입 된 핵산 분해 효소 쌍의 활동에 따라 크게 좌우됩니다. TALENs 유기체의 수의 유전자의 넓은 범위를 대상으로 높은 성공률을 보여왔다; 그러나, 최근의 연구는 TALEN 바인딩 시토신 메틸화 (30, 31)에 민감한 것이 좋습니다. 따라서, 새로 생성 된 핵산 분해 효소 쌍, 예를 들어 TALENs이 pCAG-T7 벡터에 클로닝 등 NIH-3T3 또는 신경과 같은 마우스 세포주에 일시적으로 형질 전환 할 수 있습니다 다소 마우스 배아의 염색질 상태를 모방-2A. 여기서, 뉴 클레아 제 활성은 종래의 mRNA 합성과 마이크로 인젝션에 제 5 절에 설명 된 T7 효소 분석 또는 PCR 생성물의 제한 다이제스트를 사용하여 추정 될 수있다. 우리는 점에서 관심의 게놈 영역의 염기 서열을 추천합니다세포주 및 마이크로 인젝션 실험에 사용 된 마우스 균주를 필자. 마우스의 수정란에서 다른 TALEN 또는 ZFN 쌍은 서로 다른 mRNA의 농도에서 최적으로 작동하기 때문에 미세 주입 핵산 분해 효소의 mRNA의 최적의 작업 농도는 실험적으로 결정해야 할 수 있습니다. 너무 높은이 배아 치사 될 수있는 반면 뉴 클레아 쌍에 따라, 너무 낮은 농도는없는 분열을 초래할 것입니다. 클레아 쌍에 따라, 우리는 2 NG / μL, 200 ㎍ / UL의 높은 최저 총 mRNA의 농도를 사용하여 성공을 거두었습니다. 이러한 효과는 세포 배양 및 배아의 생존과 목표 궤적의 변형 속도가 모두 경험적으로 결정해야합니다에 대한 핵산 분해 효소의 농도 최적의 실험에서 예측하기 어렵다. 고 활성 ZFN 또는 TALEN는 미세 주입 배아의 한 세포 단계를 넘어 자신의 표적 서열을 절단하기 때문에 돌연변이 유발의 복잡한 패턴을 일으킬 수 있습니다설립자의 D 모자이. 우리와 다른 사람 (4)는 하나의 창시자 (그림 5C)에 세 개 이상의 서로 다른 돌연변이 대립 유전자를 관찰했다. 이 시조에서 새로운 마우스 라인을 설정할 때 따라서, 자식은 신중하게 소화 분석은 정의되지 않은 돌연변이가 존재하는 경우에만 있다는 증거를 제공하기 때문에 유리한 돌연변이의 존재에 대한 염기 서열 검사를해야한다. 비판 중 하나는 자주 ZFN 및 TALEN 시스템에 대해 표명이 클레아도 대상 사이트와 유사하다 게놈에 다른 곳에서 현재 시퀀스를 쪼개기의 할 수있는 가능성이있다. 이러한 오프 대상 효과는 homodimeric의 FokI 도메인을 사용하여 초기 세대 시약으로 관찰되었으며, 이종 구조는 오프 대상 효과 25을 완화하도록 설계되었습니다. 잠재적 오프 - 타겟 위치는 (32, 33)에 실리 다소 예측과 PCR 및 시퀀싱에 의해 스크리닝 할 수있다. 분명한 장점 O오히려 F 세포주보다 마우스를 생성하고 ZFNs TALENs를 사용하여 선택 야생형 균주 몇개 backcrosses를 수행하여 원하는 게놈 수식에 링크 해제 대상 돌연변이를 제거 할 가능성이있다. 창시자 마우스의 다수 클레아 타겟 궤적 생성 및 실리코 오프 - 타겟 예측 PCR 제품의 차세대 깊은 시퀀싱 분석 유전자좌는 PCR 생성물의 분해 분석에 대안 정량적 판독을 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 설명하는 보조 생식 기술은 이러한 C57BL/6J 또는 B6D2F1 같은 미세 주입 실험에 사용되는 표준 마우스 종자에 최적화되어 있습니다. 이러한 이계 교배 균주 등 다양한 기원의 마우스는 원칙적으로 게놈 편집 방법에 사용할 수있는 특정 연구 질문에 대한 더 적합한 유전 배경을 제공 할 수 있습니다. 이러한 과배란 같은 보조 생식 기술의 성능은 predi이 될 수 있습니다변종 34-36의 번호를 cted하지만 클레아 미세 주입을위한 배아의 충분한 수를 얻기 위해 비표준 변종에 대한 최적화가 필요할 수 있습니다. ZFN 및 TALEN 게다가, 이러한 RNA 유도 CRISPR/Cas9 시스템 9,37,38 새로운 디자이너 클레아 지금 게놈 편집 응용 프로그램에 도입되었습니다. 미세 주입하고 여기에 설명 설립자 동물의 분석을위한 모든 방법은 CRISPR/Cas9 게놈 편집의 미래 모드에 적용 할 수있다.

마우스는 유전자 변형 동물 모델을 생성하기위한 지금까지 가장 인기있는 플랫폼이다. 마우스 배아 1-3의 유전 공학에 대한 다양한 도구 상자는 최근 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFN)와 같은 디자이너 클레아 제에 따라 게놈 편집 방법에 의해 4-6, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALEN)를 7,8 확장되었습니다 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 9. ZFN하고, 각각 FokI 효소 10-12에 결합된다 (각각 징크 핑거 단백질의 배열과 반복 변수를 디 - 잔기 (RVDS))이 맞춤 설계 단백질 기반의 DNA-결합 도메인 쌍으로서 TALEN 기능. 반대로, Cas9 매개 DNA 절단의 특이성은 (또한 하나의 키메라 RNA 분자라고 가이드 RNA에 결합 할 수 있습니다 crRNA 및 tracrRNA) CRISPR RNA를을 transactivating에서 제공하는 복잡 한 행동 (11)CRISPR 단백질. RVDS의 정의 된 순서와 TALENs 빠르게 13-17 선택할 수있는 조립 전략 다수의 개별 실험자에 의해 구성 될 수있다. CRISPR/Cas9 그러나 가이드 RNA-DNA의 특이성은 아직 완전히 18, 19가 해결되지 바인딩, 디자이너 클레아의 더 적은 노동 집약적 인 발전을 약속합니다. 사용자 정의 ZFNs의 생성은 지금까지 전문 대학 실험실과 같은 Sangamo Biosciences에와 시그마 CompoZr 서비스로 상용 공급 업체로 제한하고있다. 일반적으로 디자이너 클레아와 편집 게놈 이후에 합류 동종 끝 (NHEJ) 또는 상동 재조합 (HR) DNA 수리 기계 (10, 12)을 유치 정의 게놈 유전자 좌에서, 이중 가닥 휴식 (DSB)를 소개하는 것을 목표로하고있다. DSB의 NHEJ - 중재 수리는 종종 수리의 사이트에 근접 삽입과 삭제의 도입 발생합니다. 따라서 NHEJ 수리 C는 유전자의 단백질 - 코딩 서열 4,7,9 내에 프레임 쉬프트 돌연변이를 도입함으로써 표적 유전자의 기능을 노크 위해 이용 될 수있다. 대안 적으로, 또는 추가로 정의 된 유전 정보의 보충은 가방 클레아 함께 DNA 공여체를 제공함으로써 달성 될 수있다. DNA 기증자 따라서 HR에 의해 DSB 복구를위한 템플릿으로 봉사 대상 궤적 상 동성 지역으로 측면에 조사 설계 DNA 서열을 포함한다. 플라스미드 5,6,20 및 단일 가닥 올리고 뉴클레오타이드 8,9,21 모두 성공적으로 기증자로 사용되었습니다. NHEJ-또는 이용 HR-매개 게놈 편집 둘다 전체적인 유전자 구조를 방해하지 않고, 염기 배열에서의 작은 변화를 생성하기위한 이러한 전략이 특히 적합하게 마우스 배아의 게놈에 선별 마커의 도입을 필요로한다. 이 프로토콜에서 우리의 게놈 편집을위한 모든 필수 절차에 대해 설명합니다TALENs를 사용하여 마우스 배아. 이들은 TALEN 대상 사이트 22의 1) 식별을 포함, 골든 게이트 복제 (13)에 의해 TALENs 2) 건설, TALEN의 mRNA, 수정 된 마우스 난자, 배아 전송을 위해 5) 수술 절차에 TALEN의 mRNA 4) 미세 주입 3) 체외 합성 , 6) 설립자 동물 TALEN 유발 돌연변이의 분석. 우리는 TALEN mRNA의 미세 주입 및 NHEJ에 의한 삽입 / 삭제에 설립자의 심사에 초점을 맞 춥니 다. 이 목적을 위해 우리는 플라스미드로 마우스 배아에 미세 주입을위한 TALEN의 mRNA의 생체 합성에 형질 때 포유 동물 세포 모두에서 발현을 허용 관능 TALEN 구조를 생성 한. 이러한 구조는 이종이 FokI 융합 잘린 이야기 백본 (23)는 포유 동물 세포에서 최적의 게놈 편집 (24, 25)를 도메인을 포함한다. 이 프로토콜은 다른 디자이너 클레아의 미세 주입 또는 디자이너 클레아의 결합 주사를 채택 할 수있다기증자 구조 (DNA 기증자의 디자인 Wefers 등. (26, 27)에 의해 우수한 기술 문서에 기술되어있다). 윤리 정책 모든 동물 실험은 광저우 취리히 주립 동물 병원의 지침과 규정에 따라 수행되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="524">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">BsaI</td>
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		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Esp3I</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0451</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T4 Ligase</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0202S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Spectinomycin</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S0692-1ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">X-Gal</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">B4252</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">IPTG</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I6758</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Plasmid-Safe nuclease</td>
			<td style="width:111px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">E3101K</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAGEN Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12143</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:111px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM1345</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NucAway Spin Columns</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM10070</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNaseZAP</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">R2020-250ML</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">NorthernMax Formaldyde Load Dye</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM8552</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">RNA Millennium Markers</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM7150</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">10x TBE buffer</td>
			<td style="width:111px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">B52</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">T7 endonuclease</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0302S or L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">pGEM-T EasyVector System I</td>
			<td style="width:111px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A3600</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td style="width:111px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">S-7563</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">pregnant mare&#39;s serum gonadotrophin (PMSG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G4877</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">human chorionic gonadotropin (hCG)</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">CG5</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M2 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7167</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">M16 embryo culture medium</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7292</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Mineral oil, embryo tested</td>
			<td style="width:111px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M8410</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Ketamine</td>
			<td style="width:111px;">CentraVet</td>
			<td style="width:119px;">Ket 201</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Xylazine</td>
			<td style="width:111px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">46995</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Equipment/Tools</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Inverted microscope with Nomarski DIC optics (for example Nikon Eclipse TE200)</td>
			<td style="width:111px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Micromanipulator units (for example Narishige, NT88NF)</td>
			<td style="width:111px;">&#160;Narishige</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo holding capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;">B100-75-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Embryo injection capillaries</td>
			<td style="width:111px;">Narishige</td>
			<td style="width:119px;">GD-1</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">Capillary puller (for example Sutter P97)</td>
			<td style="width:111px;">Sutter instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Microforge (for example Narishige MF-900)</td>
			<td style="width:111px;">Narishige&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Walton skin scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14077-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical scissors</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">14041-10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Surgical probe</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">10140-03</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clip system (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12031-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Reflex wound clips (9mm)</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">12032-09</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dumont fine forceps 5</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11254-20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria curvrd forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11370-31</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Moria fine forceps</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">11399-80</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:295px;">Dietrich bulldog clamp</td>
			<td style="width:111px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">18038-45</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Animals</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">C57BL/6J mice</td>
			<td style="width:111px;">Jackson labs</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:295px;">CD-1 mice</td>
			<td style="width:111px;">Charles river</td>
			<td style="width:119px;">strain code 000664</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse genome engineering using designer nucleases

사이트 별 게놈 수정 (녹아웃, 노크에있는)를 운반하는 형질 전환 마우스는 복잡한 생물학적 시스템을 해부뿐만 아니라 인간의 질병을 모델링 및 치료 전략을 테스트하기 위해 매우 중요합니다. 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 대한 CRISPR 관련 (CAS) 9 시스템 사이트로 디자이너 클레아의 사용에서 최근의 진보 특정 게놈 공학은 배아 줄기 (ES) 세포 기술에 의존 할 필요없이 거의 모든 실험 종 급속한 표적 유전자 변형을 수행 할 수있는 가능성을 연다. 게놈 편집 실험은 일반적으로 조사 정의 게놈 현장에 핵산 분해 효소의 활동을 직접 지정 DNA 결합 도메인의 구성에 따라 관심의 유전자 내에서 디자이너 클레아 대상 사이트의 식별로 시작합니다. 가방 클레아 플라스미드 체외에 &lt;/ EM&gt; 수정 된 마우스 난자의 미세 주입에의 mRNA를 생성하는 전사. 여기, 우리는 수정 된 마우스의 난자에 TALEN mRNA를 직접 분사 대상이 게놈 수정을 달성하기위한 프로토콜을 제공합니다.

우리는 포유 동물 세포에서 TALENs의 표현뿐만 아니라 T7 파지 프로모터 (그림 1C)에서 체외 mRNA의 합성을 허용 Cermak 등. (13)에 의해 발표 된 골든 GateTALEN 어셈블리와 호환 대상 플라스미드를 건설했다. 이 플라스미드 FokI 동종이 량체에 대해 오프 대상 영향을 줄이기 위해 FokI는 25,29를 이종 첫 번째 세대에 비해 분열 활동을 강화하는 것으로 나타났다 이종이 FokI 도메인 (ELD 또는 KKR 돌연변이)를 수행한다. 골든 게이트 조립 반응 # 1과 # 2는 일반적으로 매우 효율적이며, 모든 흰색 식민지, 식민지 PCR로 분석 할 때, 복제 RVDS (그림 1B와 1D)의 특정 번호에 대한 예상 패턴을 보여줍니다. 체외 합성의 mRNA의 젤 분석 (그림 2) 분석의 모든 샘플에 대한 거의 또는 전혀 얼룩으로 하나의 구별 밴드를 공개한다. 성공적인 폴리아 데 닐화를 나타내는 샘플 L1/R1 및 L2/R2, L3/R3, 사이에 명확한 크기의 변화가 있어야합니다. 설립자 동물은 효소를 사용하여 하나 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화에 이어 유전자형 PCR (도 3) 또는 제한 다이제스트를 사용 NHEJ 유도 돌연변이 대립 유전자에 대해 스크리닝 할 수 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 클리브 야생형 서열 (도 4)이. T7 엔도 뉴 클레아 제 분석은 상관없이 주입 클레아 쌍의 스페이서 영역 내의 특정 게놈 서열의 돌연변이 모든 종류에 적용될 수있다; 그러나 heteroduplex PCR 제품에서 DNA 가닥 사이에만 불일치를 검출한다. 따라서, 설립자가 동일한 두 변이 대립 유전자를 운반하는 드문 경우에, PCR 제품은 T7 소화 패턴을 보여주지 않을 것입니다. 특정 제한 부위가 NHEJ 의해 제거 될 클레아 스페이서 영역 내에 위치 할 때 그러한 구별은 항상 그러나 가능삽입 / 삭제 (그림 5) 유도. 여기에, 소화되지 않은 밴드는 돌연변이의 존재를 표시하고 모든 소화 제품의 부재는 강하게 (그림 (b)에 별표로 표시) 대상 유전자의 두 대립 유전자의 돌연변이를 운반하는 창업자을 제안합니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig1.jpg" width="600" /> 그림 1. pFUS 벡터에 RVD 배열의 이종이 pCAG-T7-대상 벡터에 TALEN RVDS의 골든 게이트 복제.) 조립. 다음 예는 각각의 이야기 배열은 각각 15 RVDS 17 RVDS를 포함와 TALEN 쌍에 대해 표시됩니다 (이상 21 RVDS보다 이야기 배열에 세 pFUS-RVDS 어셈블리가 표시되지 요구된다). 화살표는 pFUS 특정 식민지 PCR 반응. B) PCR 제품에 대한 프라이머를 나타냅니다올바른 pFUS의 어셈블리에서 증폭 일반적으로) 밴드가 복제 된 모든 RVDS (10 RVDS 용 등 약 1.1 KB) 및 적법 RVD 배열의 반복 특성으로 작은 덜 눈에 띄는 밴드의 &quot;사다리&quot;. C의 결합 길이에 대응 보여 최종 조립 pFUS-RVD 배열과 각각 FokIELD 및 FokIKKR 변형과 이종이 TALEN 발현 벡터에 마지막 반복 (PLR)를 포함하는 플라스미드. (N과 C로 주석) TALEN 백본 T7 파지 프로모터에 허용하는 동안 CAG (CMV 초기 증강 요소 / 닭 베타 - 액틴) 프로모터가 형질 전환 된 포유류 세포에서 높은 발현 수준을 보장 밀러 등. (23)에 의해 발표 된 아키텍처와 유사 체외 mRNA의 합성 (클레아 제 STOP 코돈의 하류 벡터의 선형화를위한 SacI에 사용). D) C에서 화살표로 표시된 프라이머를 이용하여 콜로니 PCR)가 제대로 조립 TALENs을 식별 할 수 있습니다. 전체 lengt에&quot;사다리 효과&quot;성공적으로 어셈블리의 강력한 지표를 나타낸다 H PCR 제품은 종종 덜 눈에 띄는입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig1highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig2.jpg" width="300" /> 그림 2. . 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 시험 관내 합성 핵산 분해 효소의 mRNA의 품질 관리가 ZFN의의 mRNA는 예로 표시됩니다 (L, ZFN을 왼쪽, R, 우측 ZFN). 샘플 전에 폴리아 데 닐화에 mRNA를 보여 L1/R1, mRNA와 L3/R3 폴리아 데 닐화 샘플 L2/R2 쇼 정제 폴리아 데 닐화의 mRNA를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig2highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img<html> 콘텐츠 폭 FO = &quot;6 인치&quot;: SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3highres.jpg&quot;SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50930/50930fig3.jpg&quot;폭 = &quot;600&quot;FO 고도는 = &quot;그림 3&quot; /&gt; 그림 3. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이를 들고 설립자 동물의 식별에 사용 T7 효소 분석의 예. A) TALEN 쌍이 마우스 프리온 단백질 유전자 (PRNP의 코딩 영역 내에서 절단하도록 설계되었다 TALEN 표적 서열)은 요청에 따라 제공 될 수있다. PCR 생성물을 PCR 생성물이 연속적으로 형성 및 T7 엔도 뉴 클레아 제 소화를 heteroduplex 행 하였다 상류 110 BP 위치한 정방향 프라이머 (F) 및 역방향 프라이머 (R) TALEN 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 이용하여 생성된다. C) 하나의 설립자의 대상으로 게놈 영역 내에서 TALEN에 의한 돌연변이 유발은 소화 (250)의 제품 및 110 bps의 전체 길이 PCR 제품의 존재에 의해 드러났습니다.50930/50930fig3highres.jpg &quot;대상 =&quot;_blank &quot;&gt; 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50930/50930fig4.jpg" width="600" /> 그림 4. 대상 현장의 핵산 분해 효소에 의한 돌연변이 마우스 Rosa26 궤적 29 대상 인트론 (1)의 내부를 XbaI 제한 사이트. ZFN의 특정을 들고 설립자 동물의 식별에 사용되는 PCR 제품의 제한 다이제스트의 예.) 설립자는 사용하여 PCR 유전형에 의해 상영되었다 앞으로 프라이머 (F)는 500 상류 BP와 역방향 프라이머 (R) 절단 부위. B의 하류 250 BP)를 XbaI과 PCR 제품의 소화가 별표로 표시 양방향 대립 유전자 돌연변이 생쥐 ()를 나타내는 소화 패턴을 보여, 모노 위치 - 대립 유전자의 돌연변이 (소화 소화되지 않은 밴드, 예를 들어 동물 2)잠재적 인 양 대립 유전자 변형 생쥐의 중량 및 마우스 (완전 소화, 예를 들어 동물 21). C) 연속 3 (동물 24) 별개의 삽입 / 삭제에 나타납니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50930/50930fig4highres.jpg" target="_blank">더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 프라이머의 이름 </td><td> &#39;3&#39;시퀀스 5 </td></tr><tr><td> pCR8_F1 </td><td> ttgatgcctggcagttccct </td></tr><tr><td> pCR8_R1 </td><td> cgaaccgaacaggcttatgt </td></tr><tr><td> TAL_F1 </td><td> ttggcgtcggcaaacagtgg </td></tr><tr><td> TAL_R2 </td><td> ggcgacgaggtggtcgttgg </td></tr><tr><td> TAL_Seq_5-1 </td><td> catcgcgcaatgcactgac </td></tr></tbody></table> 표 1. 골든 게이트 TALEN 어셈블리 내에서 식민지의 PCR 및 시퀀싱에 사용되는 프라이머 시퀀스프로토콜입니다. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 플라스미드 / 컬렉션 </td><td> 기부자 </td><td> Addgene ID </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 골든 게이트 TALEN 및 TAL 이펙터 키트 2.0 </td><td> Voytas 실험실 </td><td> 1000000024 </td><td> 골든 게이트 TALEN의 조립에 필요한 모든 플라스미드를 포함 </td></tr><tr><td> pCAG-T7-TALEN -KKR/ELD 대상 벡터 </td><td> Pelczar 실험실 </td><td> 40131, 40132 </td><td> 부가 기능에 대한 포유 동물 세포의 체외 mRNA의 합성 TALEN 식에 대한 플라스미드 </td></tr></tbody></table> 표 2. 골든 게이트 TALEN 조립에 필요한 플라스미드 플라스미드 컬렉션 Addgene (에서 얻을 수 있습니다 <a href="http://www.addgene.org">www.addgene.org</a> ). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 온라인으로자원 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> http://tale-nt.cac.cornell.edu </td><td> TALEN의 디자인; TALEN 오프 대상 예측 </td></tr><tr><td> http://zifit.partners.org/ZiFiT/ </td><td> TALEN, OPEN ZFN, 코다 ZFN, CRISPR/Cas9의 디자인 </td></tr><tr><td> http://www.genome-engineering.org </td><td> TALEN, CRISPR/Cas9의 디자인; CRISPR/Cas9 오프 대상 예측 </td></tr><tr><td> http://baolab.bme.gatech.edu/Research/BioinformaticTools/assembleTALSequences.html </td><td> TALEN의 조립 순서의 결과를 확인하는 시퀀스 </td></tr><tr><td> http://pgfe.umassmed.edu/ZFPmo dularsearchV2.html </td><td> 모듈 조립 ZFN 설계 </td></tr><tr><td> www.genomecenter.ucdavis.edu/s egallab / segallabsoftware </td><td> 모듈 조립 ZFN 설계 </td></tr></tbody></table> 표 3. ZFN, TALEN 및 CRISPR/Cas9 설계를위한 온라인 리소스. </strong&gt;

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Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다.

디자이너 클레아 제를 사용하여 마우스 게놈 엔지니어링

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

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Research

JoVE Journal

Biology

28.6K 조회수.  University of Zurich.  아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 및 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs)와 같은 디자이너 클레아는 ​​동종 최종 합류 (NHEJ)과 상동 재조합 (HR) 경로 모두를 트리거하여 마우스의 착상 전 배아의 게놈을 수정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 진보는 정확한 유전자 변형 생쥐의 신속한 생성을 가능하게한다. 

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

성인 Zebrafish에서 내이 (内耳) 감각 상피 조직의 총과 파인 해부 ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

연구

생물학

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

공학 세포 투과 단백질

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both prokaryotic and eukaryotic cells lead to translational regulation which is a major cellular mechanism of stress response. Familiar examples are the stringent response in E. coli and the Gcn2 stress response pathway in yeast ([2-6]). Recent work in E. coli and S. cerevisiae have shown that tRNA charging patterns are highly dynamic and depends on the type of stress experienced by cells [1, 6, 7]. The highly dynamic, variable nature of tRNA charging makes it essential to determine changes in tRNA charging levels at the genomic scale, in order to fully elucidate cellular response to environmental variations. In this review we present a method for simultaneously measuring the relative charging levels of all tRNAs in S. cerevisiae . While the protocol presented here is for yeast, this protocol has been successfully applied for determining relative charging levels in a wide variety of organisms including E. coli and human cell cultures[7, 8].

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

We describe a method for microarray analysis to determine relative aminoacylation levels of all tRNAs from S. cerivisiae.

Microarrays을 사용하여 tRNA의 Aminoacylation (충전) 레벨의 게놈 - 와이드 분석

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

이소형 특정 유전자 목표를 식별 칩을 사용하여 게놈 차원의 분석

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide cDNA library cloned into the 3'UTR downstream from the dual-selection fusion protein, thymidine kinase-zeocin (TKzeo). The first round of selection is for stable transformants, followed with introduction of a miRNA of interest, and finally, selecting for cDNAs containing the miRNA's target. Selected cDNAs are identified by sequencing (see Figure 1-3 for Target ID Library Workflow and details).
To ensure broad coverage of the human transcriptome, Target ID Library cDNAs were generated via oligo-dT priming using a pool of total RNA prepared from multiple human tissues and cell lines. Resulting cDNA range from 0.5 to 4 kb, with an average size of 1.2 kb, and were cloned into the p3&#900;TKzeo dual-selection plasmid (see Figure 4 for plasmid map). The gene targets represented in the library can be found on the Sigma-Aldrich webpage. Results from Illumina sequencing (Table 3), show that the library includes 16,922 of the 21,518 unique genes in UCSC RefGene (79%), or 14,000 genes with 10 or more reads (66%).

The Target ID Library is a plasmid-based, genome-wide collection of cloned cDNA used to identify miRNA targets. Here we demonstrate its use and application.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

CompoZr 맞춤 아연 손가락 Nucleases와 게놈 편집 (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs. Towards this end, much recent work has focused on identifying candidate genes for the evolution of traits in a variety of species. However, until recently it has been challenging to functionally validate interesting candidate genes. Recently developed tools for genetic engineering make it possible to manipulate specific genes in a wide range of organisms. Application of this technology in evolutionarily relevant organisms will allow for unprecedented insight into the role of candidate genes in evolution. Astyanax mexicanus (A. mexicanus) is a species of fish with both surface-dwelling and cave-dwelling forms. Multiple independent lines of cave-dwelling forms have evolved from ancestral surface fish, which are interfertile with one another and with surface fish, allowing elucidation of the genetic basis of cave traits. A. mexicanus has been used for a number of evolutionary studies, including linkage analysis to identify candidate genes responsible for a number of traits. Thus, A. mexicanus is an ideal system for the application of genome editing to test the role of candidate genes. Here we report a method for using transcription activator-like effector nucleases (TALENs) to mutate genes in surface A. mexicanus. Genome editing using TALENs in A. mexicanus has been utilized to generate mutations in pigmentation genes. This technique can also be utilized to evaluate the role of candidate genes for a number of other traits that have evolved in cave forms of A. mexicanus.

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases TALENs

Gene-targeting mutagenesis is now possible in a wide range of organisms using genome editing techniques. Here, we demonstrate a protocol for targeted gene mutagenesis using transcription activator like effector nucleases (TALENs) in Astyanax mexicanus, a species of fish that includes surface fish and cavefish.

의 게놈 편집<em&gt; 아 스티 아낙 스의 mexicanus</em&gt; 사용 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALENs)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...