우리는 잠을 감사합니다. 도움이 기술적 조언 및 amoebal 공 배양 및 amoebal 농축에 대한 흥미로운 논의 베르나르 라 스콜라. 우리는 또한 우리의 실험실에서 기술을 구현하는 그의 도움을 박사 빈센트 토마스 감사합니다.

1. Amoebal 공 배양 1.1 시료 준비 <ol><li> 환경 샘플 <ol><li> 물 샘플 0.22 ㎛의 공극 크기 막을 통해 물 샘플 (1 L에, 500 ㎖)을 고를. 그런 다음, (페이지의 아메바 식염수 매체 PAS에 막 흔들 염화나트륨 120 ㎎, 망초 4 MG • 7H 2 O, 염화칼슘 4 MG • 2H 2 O, 나 2 HPO 4 142 ㎎, 및 KH 136 밀리그램 증류수 1 L의 2 PO 4). </li><li> 고체 샘플 증류수 또는 PBS에서 활성 슬러지와 같은 흙이나 모래 샘플 및 반 고형 시료와 같은 고체 샘플을 재현 탁하고 0.22 μm의 기공 크기의 세포막을 통해 그들을 필터링합니다. 그런 다음, PAS에 막 흔들. </li><li> 높은 내생 아메바와 원생 동물로 오염 된 샘플 먼저 저속 원심 분리 (180 XG) FO하여 샘플을 침전R 10 분 또는 5 ㎛의 공극 크기 막을 통해 고를. 또한 1.1.1 에서처럼 상등액 (각각 여과 액)을 가공한다. 참고 : 30 분 동안 50 ° C에서 샘플을 가열하거나 산성 또는 염기성 용액 (14) 치료 : 기타 오염 제거 기술은 더 환경 시료의 오염을 제거하는 데 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 임상 샘플 자신의 물리 화학적 특성에 따라 임상 샘플을 처리합니다. 큰 불순물을 제거하는 필터 또는 원심 분리기 액체. 고체 시료를 Resuspend. , 조직을 사용 다운스 homogeneiser 또는 유리 구슬을 사용하여 예를 들어, 그들을 분쇄하고, 세포 내 박테리아를 무료로 세포를 용해하기. </li></ol> 1.2 아메바 준비 <ol><li> 국물 준비 ; proteose 펩톤 100g, 효모 추출물 10g, 망초 • 7H 2의 4.9 g 펩톤, 효모 추출물과 포도당 (PYG를 포함하는 리치 미디어 다음 미디어를 준비합니다O, 구연산 나트륨 5 g의 • 2H 2 O, 철 (NH 4) 0.1 g을 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, KH 2 PO 4, 나 2 HPO 4 1.97 g 1.7 g • 7H 2 O , 포도당 45g, 증류수 5 L에 염화칼슘의 0.295 g) 및 같은 아메바 종 PAS 같은 비 영양 매체. </li><li> Amoebal 문화 <ol><li> PYG 배지 30 ㎖를 포함하는 세포 배양 플라스크에 25 ° C에서 아메바 (아메바 우선적으로 castellanii ATCC 30010 또는 A.의 polyphaga 링컨-AP1)를 재배하고 있습니다. </li><li> 플라스크의 활발한 흔들어 아메바를 수확하고 1,500 X g에서 10 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. PAS 매체로 두 번 펠렛을 씻으십시오. KOVA 슬라이드에 세포를 세어 밀리리터 당 5 × 105 세포의 현탁액을 얻기 위해 볼륨을 조정한다. </li><li> 마이크로 플레이트에 amoebal 현탁액을 전송합니다. 24 승 - 1 12 웰 당 ML을 사용하여엘 플레이트, 48 잘 접시 96 - 웰 플레이트 300 μL 500 μL. 25 ℃에서 최소 2 시간 동안 마이크로 플레이트를 품어 이 잘 침전과 아메바의 부착 각의 바닥에 있습니다. </li></ol></li></ol> 1.3 공 배양 <ol><li> 샘플 접종 <ol><li> 희석 시료 100 μL로 시작하는, 일반적으로 10 배 희석 시리즈, 1.1 또는 1.2에서 샘플의 일련의 희석과 2.3.3에서 판을 접종한다. </li><li> 샘플의 미생물이 잠재적으로 존재하는 amoebal 잔디밭에 침전물에 10 분 동안 1,800 XG에서 마이크로 플레이트를 원심 분리기. 이 아메바에 의한 접촉과 미생물의 식균 작용을 증가시킨다. </li><li> 25 ° C에서 45 분 동안 접시를 품어 신선한 PAS와 미디어를 대체하여 PAS로 3 회 세척한다. bacteri에 따라 (스트렙토 마이신, 페니실린, 겐타 마이신 및 / 또는 반코마이신) 또는 항생제의 첨가없이 PAS 잘 당 1 ㎖를 추가검색됩니다 알 종. </li><li> 아메바의 encystment을 방지하기 위해 가습 분위기에서 32 ° C에서 마이크로 플레이트를 품어. 아메바를 침해하고 용해하는 박테리아의 존재를 감지하는 20X의 목적으로 매일 아니라 각을 준수하십시오. </li><li> 용해의 경우, 약 10 5 아메바 / ㎠의 단층에 공 배양의 100 μl를 접종하여 신선한 아메바의 배양을 수행합니다. 구체적으로 주어진 종의 박테리아를 분리하려면 다음과 세균 (레지오넬라 균 종에 대한 즉 BCYE 한천.)을 위해 설계 특정 한천 매체는 또한 접종. </li><li> 용해의 부재에서, 4-7일 첫 번째 접종 후 공 배양의 100 μl를 타고 24 웰 플레이트에 900 μL의 신선한 amoebal 문화를 접종. 아메바의 빠른 용해가 박테리아의 확산이 관찰되는 경우, 바이러스가 존재할 수 있습니다. 이 경우, 0.22 μm의에 뜨는을 필터링하고 신선한 아메바 감염 필터링 된 서스펜션을 사용합니다. </li></올&gt; </li></ol> 1.4 세균의 분리 및 특성 <ol><li> 세균의 염색 마이크로 플레이트 24도에서 유리 커버 슬립에 직접 공 배양을 수행합니다. 매체를 제거하고 염색 또는 면역을 수행합니다. <ol><li> 수정 Romanowsky 염색 <ol><li> coverslip에 건조 보자. 커버 슬립에게 정착 용액 (2 ㎎ / L 빠른 그린 메탄올)에서 다섯 번 담가. </li><li> 염색 용액에 coverslip에 다섯 번 담가 I (1.22 g / L 에오신 G 인산염 완충액 pH를 6.6) </li><li> 마지막으로, 염색 액 II (인산염 완충액 pH가 6.6에서 1.1 g / L의 티아)에 coverslip에 5 배를 체험. </li><li> 증류수로 샘플을 씻어. 건조하자 현미경으로 관찰한다. </li></ol></li><li> Ziehl-Neelsen 염색 <ol><li> coverslip에 건조 보자. Ziehl의 푹신와 샘플을 커버. 증기가 나올 때까지 불꽃 염료를 가열한다. </li><li> 적어도 5 분 동안 상온에서 차가운및 증류수로 씻어. 2 분 이소프로판올 3 % 염산 용액에 샘플을 커버하고 증류수로 씻어. </li><li> 메틸렌 블루 30 초 동안 덮고 증류수로 씻어. 건조하자 현미경 (22)에 의해 관찰합니다. </li></ol></li><li> Gimenez 염색 <ol><li> 100 10 % 기본 푹신 ㎖ (100 ㎖의 95 % 에탄올에 기본 푹신 10 g)을 250 ㎖의 4 % 수성 페놀 및 증류수 650 ㎖를 혼합하여 기본 푹신 주식 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 48 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> coverslip에 불꽃을 전달하여 건조 및 고정 할 수 있습니다. 2 분 동안 (10 ㎖의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH를 7.45로 염기성 푹신 스톡 용액 4 ㎖) 갓 여과 염기성 푹신 가진 샘플을 커버. </li><li> 물 샘플을 헹구고 10 초 동안 말라카이트 그린 (증류수 0.8 %)에서 배양한다. 물로 다시 씻어 ​​말라카이트 그린 염색을 반복합니다. 물로 세척한다. coverslip에 말리면, M그것을 ount 및 현미경 (23)에 의해 관찰합니다. </li></ol></li><li> 면역 형광 <ol><li> 10 분 동안 4 %에서 5 분 동안 또는 파라 포름 알데히드와 메탄올에 배양하여 커버 슬립을 수정. </li><li> PBS로 3 회 세척하고 실온에서 (PBS 0.1 % 사포닌을 5 % BSA)를 차단 솔루션에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 관심의 미생물에 대해 제기 항체를 포함하는 솔루션을 차단에 1 시간 동안의 coverslip을 품어. </li><li> PBS에 다시 세 번 세척하고 일차 항체에 대한 감독 및 형광에 연결된 보조 항체로 1 시간 동안 배양한다. PBS로 3 회 세척, 커버 슬립을 탑재하고 형광 현미경으로 관찰한다. </li></ol></li></ol></li><li> PCR에 의한 DNA 검출 amoebal 공 배양의 100 ~ 200 μL에서 DNA를 추출합니다. 이러한 마이코 박테리아 (24)와 같은 관심 종의 16S rRNA 유전자 또는 특정 프라이머를 대상으로 보편적 인 프라이머와 미생물을 검출, 레지오넬라 균 25 Chlamydiales 26의 멤버. </li></ol> 2. Amoebal 심화 2.1. 샘플 준비 텍싱하여 PAS 고체 및 반고체 샘플을 Resuspend. 10 분 동안 저속 (180 XG)에서 현탁액을 원심 분리기. 이 펠릿에있는 자유 생활 아메바의 농축 수 있습니다. 상등액 amoebal 공 배양과 amoebal 농축 21 펠릿을 위해 사용될 수있다. 2.2. 중간 준비 <ol><li> PAS 100 ㎖에 한천 1.5 g을 추가하고 121 ℃에서 중간 15 분 압력솥 페트리 접시에 따뜻한 매체를 붓고 실온에서 응고 수 있습니다. </li><li> 37 ℃에서 하룻밤 LB 또는 티오 글리콜 산 국물에 대장균 (ATCC 25922)을 성장 PBS로 두 번 박테리아를 씻어 PAS 매체에서 그들을 재현 탁. PAS에 10 배 희석하고 PAS 한천 플레이트에이 희석 2 ~ 3 ㎖의 확산 및 건조 할 수 있습니다. </li></ol> 판의 한쪽면에 샘플의 드롭 (또는 필터 매)를 추가하고 접시의 중앙 라인을 형성하는 페트리 접시 위에 흐르게. 2.4. Amoebal 성장과 amoebal 배양 <ol><li> 매일 페트리 접시를 관찰합니다. amoebal 이주 전면이 검출되는 경우, 이주 전면 한천의 작은 조각을 잘라내어 E.의 잔디 덮여 신선한 NNA 페트리 접시에 접종 대장균. </li><li> 관련 amoebal 균주의 순수 배양을 위하여, 시료의 순도에 따라 reinoculation 여러 번 반복. </li></ol> 2.5. 아메바와 박테리아 특성 <ol><li> 세포를 긁고 PAS에서 그들을 재현 탁. </li><li> DNA를 추출하여 PCR 및 시퀀싱 (박테리아 16S rRNA를 증폭, RESP. 18S rRNA의 아메바 및 시퀀싱, 예를 들어)로 아메바 및 / 또는 세균 endosymbionts의 신원을 확인합니다. </li> &lt;리&gt; 신선한 아메바 접종 및 샘플의 가능성이 존재하는 박테리아를 검출하는 amoebal 공 배양을 수행하는 PAS 이러한 긁어 세포를 사용합니다. </li></ol>

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Dis. 9, 815-821 (2003).</li><li>Collingro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+an+environmental+Chlamydia+strain+from+activated+sludge+by+co-cultivation+with+Acanthamoeba+sp.">Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp.</a> Microbiology. 151, 301-309 (2005).</li><li>Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrella+lausannensis,+a+new+star+in+the+Chlamydiales+order.">Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order.</a> Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).</li><li>La Scola, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+giant+virus+in+amoebae.">A giant virus in amoebae.</a> Science. 299, 2033 (2003).</li><li>Boyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Marseillevirus+highlights+the+role+of+amoebae+as+a+melting+pot+in+emergence+of+chimeric+microorganisms.">Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).</li><li>Thomas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lausannevirus,+a+giant+amoebal+virus+encoding+histone+doublets.">Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets.</a> Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).</li><li>Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+infection+of+a+technician+by+mimivirus.">Laboratory infection of a technician by mimivirus.</a> Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).</li><li>Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parachlamydia+acanthamoebae,+an+emerging+agent+of+pneumonia.">Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia.</a> Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).</li><li>Lamoth, F., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amoebal+pathogens+as+emerging+causal+agents+of+pneumonia.">Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia.</a> FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).</li><li>Lienard, J. G., Ashbolt, K., Sen, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+6.">Ch. 6.</a> Environmental microbiology, current technology and water applications. , 143-162 (2011).</li><li>Boughalmi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+isolation+of+giant+viruses+of+the+Mimiviridae+and+Marseilleviridae+families+in+the+Tunisian+environment.">High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment.</a> Environ. Microbiol. , (2012).</li><li>Ovrutsky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooccurrence+of+Free-Living+Amoebae+and+Nontuberculous+Mycobacteria+in+Hospital+Water+Networks,+and+Preferential+Growth+of+Mycobacterium+avium+in+Acanthamoeba+lenticulata.">Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Amoebal 공 배양 및 amoebal 농축 많은 새로운 세균과 amoebal 종의 분리를 허용 효율적인 방법이다. 이러한 방법으로 얻어진 결과는 아메바와 환경의 아메바 저항 박테리아 모두의 유비쿼터스 존재를 확인하고, 가장 흥미로운 같은 염소 및 오존 처리 등의 화학적 처리에 의해 제어되는 것으로 간주되는 인공 물 네트워크에서. Amoebal 공 배양 및 amoebal 농축은 분리 및 배양이 잠재적으로 병원성 미생물을 ?...

분자 진단의 도래하기 전에, 환경 틈새 시장 또는 임상 샘플에 존재하는 미생물은 종종 주로 배양 접시에있는 한천에, 다른 선택 배지에 그들을 양성으로 검출되었다. 세균성 식민지와 그들의 신진 대사 활동의 표현형은 종 수준에서 세균의 분류를 허용했다. 다시 물은 또한 검출의 민감도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 그러나 두 기술의 모든 미디어에 천천히 여부 성장 박테리아의 복구를 허용하지 않습니다. 이 분자 접근 방식이 널리 오늘날 사용되는 이유입니다. 그럼에도 불구하고, DNA의 검출은 세균의 생존에 대한 단서를 제공하지 않습니다. 또한, 반하여 문화, 분자 접근은 더욱 특성화 될 수있는 변형을 초래하지 않습니다. 성장 고체 미디어 또는 그 필요 세포에 제대로 성장 병원체를 공부하는 것은 복잡하다. 이들의 대부분은 박테리아가 까다로운 INTR은 &quot;어려운 성장 전망&quot;무 세포 박테리아, 종종 발견하고 레지오넬라 뉴모 필라의 경우와 같이 큰 발생 다음과 같은 특징. 이 박테리아는 미국 재향 군인회의 대회 기간 동안 발생한 발발 다음과 같은 특징이되었다. 많은 182과 같은 사람은 감염 29 인해 심각한 폐렴 1,2에 사망했다. 그것은 나중에 아메바는 자연이 박테리아의 호스트와 호텔 에어컨 시스템과 물 네트워크에서 자신의 존재가 소위 군단의 병사의 질병 3의 발발의 원점이라고 있다고 설명했다. 아메바는 전 세계적으로 존재하고 토양, 공기, 물, (4 검토) 지원자의 코 점막에서 분리되었다. 이러한 &quot;자유 생활&quot;아메바는 일반적으로 환경에서 자율적으로 분할되지만 가끔 관대 한 호스트 5에 침입 할 수 있습니다. HY으로 식균 작용 및 후속 리소좀 소화를 통해 다양한 미생물에 아메바 공급drolases 6. 많은 통성 또는 의무 세포 내 박테리아가 소화에 저항하기 때문에 감염 예 레지오넬라 균, 클라미디아 관련 세균이나 진균 등 아메바에 나누어 (7 검토하고 8) 할 수 있습니다. 자유 생활 아메바 가능성이 아직 발견되지 않은 세포 내 박테리아의 중요한 잠재적 인 저수지를 나타냅니다. 이 로잔에있는 다른 그룹은 다양한 환경 시료 9-15에서 여러 가지 새로운 의무를 세포 내 미생물을 분리 할 수 amoebal 공 배양 및 amoebal 농축이라는 두 가지 주요 기술을 구현하기 위해 그룹을 이끌었다. 아메바 세균에 방목 전문 식세포 때문에, 식균 작용에 저항하고있는 원생 생물 안에 성장할 수 박테리아는 인간의 식세포 집락과 인간을 향한 병원성 수 있습니다. 이는 부분적으로 이러한 Waddlia 초와 같은 일부 클라미디아 관련 박테리아에 대한 입증되었다ndrophila. W. chondrophila은 아메바에서뿐만 아니라, 포유류의 상피 세포, 대 식세포, 물고기 세포주 16-18로 여러 종류의 세포에서뿐만 아니라 증가 할 수 있습니다. amoebal 공 배양는 크게 다른 세균 종 (21) 오염 의자 등의 임상 샘플 19, 20, 세포 내 박테리아를 검출 관련이 나타납니다. 무균 미디어 아메바의 (b)는 성장과 대장균 박테리아 잔디 및 (c) 선정 및 특성, 여기에서 우리는 환경이나 임상 시료의 () 처리를 포함, amoebal 공 배양 및 amoebal 농축의 주요 단계를 설명 세포 내 박테리아의.

<table><tbody><tr><td>Glucose monohydrate</td><td>Merck, Darmstadt, Germany</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m pore size membrane</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>SCVPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>proteose peptone</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>yeast extract</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flasks</td><td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>Kova slide</td><td>Hycor, Indianapolis, IN</td><td>87144</td><td></td></tr><tr><td>cell culture microplates</td><td>Corning Inc, Corning, NY</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>Diff-Quik staining kit</td><td>Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany</td><td>130832</td><td></td></tr><tr><td>Ziehl fuchsin</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>21820</td><td></td></tr><tr><td>basic fuchsin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>857843</td><td></td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>P1037</td><td>Corrosive and mutagenic</td></tr><tr><td>malachite green oxalate</td><td>Fluka, St-Louis, MI</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde 16% solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma, St-Louis, MI</td><td>84510</td><td></td></tr></tbody></table>

discovery of new intracellular pathogens by amoebal coculture and amoebal enrichment approaches

이러한 레지오넬라 균, 결핵균과 클라미디아 같은 생물로 세포 내 병원균은 종종 전혀 보통 박테리아를 배양하는 데 사용되는 선택적 미디어에 저조한 여부 성장하기 때문에 분리하기가 어렵습니다. 이러한 이유로, 이러한 병원체의 대부분은 단지 최근에 발견되거나 중요한 발병을 다음 하였다. 이 병원균은 종종 호스트 세포의 역할과 박테리아의 생존과 성장을 할 수 아메바와 관련이있다. amoebal 공 배양 및 amoebal 농축 : 우리는 임상 및 환경 샘플에서 세포 내 병원균의 분리 및 특성이 존재 수있는 두 가지 기술의 데모를 제공하기 위해 여기를하려고합니다. Amoebal 공 배양 샘플에 존재하는 세포 내 세균에 의해 감염 용해 할 수있는 amoebal 잔디에 조사 된 샘플을 접종하여 세포 내 박테리아의 복구를 할 수 있습니다. Amoebal 농축은 임상 적 또는 환경 샘플에서 아메바의 복구가 존재 할 수 있습니다. 일또한이 아메바에 특히 성장의 새로운 세포 내 박테리아의 새로운 amoebal 종의 발견으로 이어질 수있다. 함께,이 두 가지 기술은 아메바에서 성장할 수 새로운 세포 내 박테리아를 발견하는 데 도움이됩니다. 때문에 아메바 감염 및 식균 작용에 저항 할 수있는 능력으로,이 세포 내 박테리아는 또한 대 식세포에 의해 포식 작용을 피할 수 있으며, 따라서 더 높은 진핵 생물에 대한 병원성.

amoebal 공 배양과 amoebal 농축을 사용하여, 환경 및 / 또는 병원성 세균의 전체 범위는 (표 1)를 발견 하였다. Amoebal 공 배양은 환경 시료, 물 처리 플랜트, 물 분배 시스템을 분석하는 단체와 다른 사람들에 의해 사용되었다. 미생물의 넓은 범위는이 기술로 분리 할 수​​ 있습니다. amoebal 공 배양하여 분리하는 가장 일반적인 박테리아가 물 처리 공장에서 물 네트워...

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Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Amoebal 공 배양 선택적 같은 아메바 및 대 식세포와 같은 식세포에 저항 할 수 세포 내 병원체를 성장 자기편 아메바를 사용하여 세포 배양 시스템이다. 그것은 따라서 새로운 감염원을 발견 할 수있는 중요한 도구를 나타냅니다. Amoebal 농축 새로운 amoebal 종과 특정 세포 내 박테리아의 발견을 할 수 있습니다.

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

discovery-new-intracellular-pathogens-amoebal-coculture-amoebal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.4K 조회수.  University Hospital Center and University of Lausanne.  Amoebal 공 배양 선택적 같은 아메바 및 대 식세포와 같은 식세포에 저항 할 수 세포 내 병원체를 성장 자기편 아메바를 사용하여 세포 배양 시스템이다. 그것은 따라서 새로운 감염원을 발견 할 수있는 중요한 도구를 나타냅니다. Amoebal 농축 새로운 amoebal 종과 특정 세포 내 박테리아의 발견을 할 수 있습니다. 

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Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires' pneumonia, gains a pathogenic advantage over in vitro cultured bacteria when first harvested from protozoan cells prior to infection of mammalian macrophages. This suggests that important virulence factors may not be properly expressed in vitro. We have developed a tractable system for priming L. pneumophila through its natural protozoan host Acanthamoeba castellanii prior to mammalian cell infection. The contribution of any virulence factor can be examined by comparing intracellular growth of a mutant strain to wild-type bacteria after protozoan priming. GFP-expressing wild-type and mutant L. pneumophila strains are used to infect protozoan monolayers in a priming step and allowed to reach late stages of intracellular growth. Fluorescent bacteria are then harvested from these infected cells and normalized by spectrophotometry to generate comparable numbers of bacteria for a subsequent infection into mammalian macrophages. For quantification, live bacteria are monitored after infection using fluorescence microscopy, flow cytometry, and by colony plating. This technique highlights and relies on the contribution of host cell-dependent gene expression by mimicking the environment that would be encountered in a natural acquisition route. This approach can be modified to accommodate any bacterium that uses an intermediary host as a means for gaining a pathogenic advantage.

This technique provides a method to harvest, normalize and quantify intracellular growth of bacterial pathogens that are pre-cultivated in natural protozoan host cells prior to infections of mammalian cells. This method can be modified to accommodate a wide variety of host cells for the priming stage as well as target cell types.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

연구

면역학 및 감염병학

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

사용 환경 샘플에서 새로운 Faustoviruses의 분리에 대한 신속한 전략<em&gt; Vermamoeba의 vermiformis</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

생화학

High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require several additional experimental steps prior to readout, such as cell lysis, colony forming unit determination, or reagent addition. When performing thousands of assays, for example, during high-throughput screening, the downstream effort required for these types of assays is considerable. Therefore, to facilitate high-throughput antimicrobial discovery, we developed a real-time assay to simultaneously identify inhibitors of intracellular bacterial growth and assess eukaryotic cell cytotoxicity. Specifically, real-time intracellular bacterial growth detection was enabled by marking bacterial screening strains with either a bacterial lux operon (1st generation assay) or fluorescent protein reporters (2nd generation, orthogonal assay). A non-toxic, cell membrane-impermeant, nucleic acid-binding dye was also added during initial infection of macrophages. These dyes are excluded from viable cells. However, non-viable host cells lose membrane integrity permitting entry and fluorescent labeling of nuclear DNA (deoxyribonucleic acid). Notably, DNA binding is associated with a large increase in fluorescent quantum yield that provides a solution-based readout of host cell death. We have used this combined assay to perform a high-throughput screen in microplate format, and to assess intracellular growth and cytotoxicity by microscopy. Notably, antimicrobials may demonstrate synergy in which the combined effect of two or more antimicrobials when applied together is greater than when applied separately. Testing for in vitro synergy against intracellular pathogens is normally a prodigious task as combinatorial permutations of antibiotics at different concentrations must be assessed. However, we found that our real-time assay combined with automated, digital dispensing technology permitted facile synergy testing. Using these approaches, we were able to systematically survey action of a large number of antimicrobials alone and in combination against the intracellular pathogen, Legionella pneumophila.

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

높은 처리량, 실시간, 세포 내 항균 활동의 이중 판독 테스트 및 진핵 세포의 세포 독성

Traditional measures of intracellular antimicrobial activity and eukaryotic cell cytotoxicity rely on endpoint assays. Such endpoint assays require ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

아메바를 사용 하 여 빠른 이미지 기반 세균 독성 분석 결과

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

생체공학

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

식 세포에서 세포내 복제에 대 한의 진 균 abscessus 독성 마커의 식별

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

미생물 상호 작용의 조사를 위한 높은 처리량 공동 문화 애세서

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Amoebal 공 배양 및 Amoebal 심화 접근에 의한 새로운 세포 내 병원균의 발견

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