세포내를 복제하는 미생물 병원균은 결국 감염된 세포를 빠져나가야 합니다. 어느, 숙주 병원체 상호 작용의 다른 양상에 비교될 때 상대적으로 과소 평가됩니다. 여기서는 병원균 의 효능을 분석하는 기술을 설명합니다.
우리는 어떻게 상대적으로 간단한 분석이 efflux 효율성을 평가하거나 포스트 efflux 병원체를 특성화하기 위하여 이용될 수 있는지 보여줍니다 특정 병원체 호스트 세포 모형이 운동, 복용량 및 가능한 독서에서 다를 수 있더라도 여기에서 기술된 일반적인 기술은 광범위하게 적용됩니다. 모든 실험 시스템을 설정하는 것과 마찬가지로, 실험 샘플이나 코호트에서 진정한 생물학적 과정이 관찰되도록 명확한 제어가 확립되는 것이 필수적입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 페토리아 게일입니다.
감염 실험으로 시작하려면 파이펫을 사용하여 새로 준비된 Lm 접종소 20 마이크로리터를 우물에 추가하고 접시가 약간 기울어지고 파이펫 팁이 중앙 미디어에 조심스럽게 배치됩니다. 파이펫 끝으로 우물의 벽을 만지지 마십시오. 각 웰의 내용물들을 부드럽게 피펫하여 완전한 혼합을 보장합니다.
우물의 벽에 LM이 퍼지는 것을 피하기 위해 접시를 흔들거나 크게 기울이지 마십시오. 세포 배양 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터5%로 되돌려 보겠습니다. 감염되지 않은 세포에서 조건된 미디어를 희석제로 사용하여 밀리리터 젠타미신 용액당 10 마이크로그램을 준비하십시오.
감염 후 30분 만에 젠타미킨 용액 30마이크로리터를 접시에 넣고 밀리리터당 2점-5마이크로그램의 최종 농도에 도달합니다. 웰의 내용물의 내용을 부드럽게 피펫하여 세포 배양 접시를 인큐베이터에 섞어 반품합니다. 수확하려면 접시를 약간 기울이고 파이펫을 사용하여 전체 미디어를 우물에서 제거합니다.
증류된 멸균 물의 포인트 파이브 밀리리터를 우물에 넣습니다. 30초 후, 생성된 물을 1점-5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 10초 동안 적극적으로 소용돌이를 일으킵니다. 4점-5마이크로리터와 50마이크로리터의 소리터를 증류소, 멸균 수의 450마이크로리터에 추가하여 10배 의 희석제와 100배의 희석물을 준비합니다.
철저한 혼합을 보장하기 위해 잠시 소용돌이. 원래 10배 의 마이크로리터 50개와 희석된 100배의 희석된 샘플을 리조제니 국물 한천 접시에 넣고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. 신흥 LM에 대한 분석하기 위해 접시에서 오버레이 미디어의 10 마이크로 리터를 추출하고 두 개의 5 마이크로 리터 알리 쿼트와 마이크로 원심 분리 튜브로 나눕니다.
DMEM/FCS 5마이크로리터를 하나의 알리쿼트에 추가하고 두 번째 알리쿼트에 밀리리터 젠타미신당 5마이크로리터를 포함하는 DMEM/FCS의 5마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분 간 기다립니다. 각 알리쿼트에 증류살균물 90마이크로리터를 넣고 10초 동안 두 마리를 적극적으로 소용돌이치게 합니다.
그런 다음 LB 한천 플레이트에 50 마이크로리터를 추가하고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. Lm 식민지를 열거하기 전에 이틀 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 보관하십시오. 자동화된 세포 카운터를 사용하여, 제조된 2-6-4점-7세포를 1회 10-밀리리터당 10분의 농도로 조정한다.
6웰 조직 배양 플레이트의 우물에 샘플 1 밀리리터를 추가합니다. 50의 감염의 복합성에 대응하는 준비된 Lm 접종으로 세포를 감염시. 감염 후 1점-5시간 동안, 4%의 PFA의 500 마이크로리터로 채워진 1점-5 밀리리터 마이크로센티어 유역에서 첫 번째 우물 세트에서 미디어를 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
세포 내 Lm을 수집하려면 각 우물에 증류된 멸균 수1 밀리리터를 추가하십시오. 60초 후, 생성된 물을 4%의 PFA 500 마이크로리터가 있는 1점-5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 튜브를 10초 동안 활발하게 소용돌이치며 얼음 위에 놓습니다.
남아있는 우물의 경우, 미디어를 제거하고 세포 외 Lm을 죽일 밀리리터 젠타미신 당 5 마이크로 그램DMEM / FCS의 1 밀리 리터로 교체.즉시 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 30분 후, 미디어를 제거하고 젠타미신없이 DMEM /FCS로 교체하십시오. 또 다른 2 시간 및 4 시간 후, 튜브에 두 번째와 세 번째 시간 포인트에 대한 lysates에서 미디어를 수집하고 차가운 얼음에 배치합니다.
원심 분리기 튜브는 7 분 동안 10, 000 배 G에서. 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 제거하십시오. 4%의 PFA 50 마이크로리터와 15마이크로리터의 페할로이드를 튜브에 넣고 혼합하여 각 펠릿을 중단합니다.
어둠 속에서 튜브를 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 각 튜브에 FACS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 원심분리기에서 7분 동안 10, 000배 G로 튜브를 회전시합니다.
펠릿을 방해하지 않고 상류체를 제거합니다. 즉시 사용, 각 펠릿을 일시 중단 400 FAX 버퍼의 마이크로 리터. 이후 분석을 위해 저장하는 경우, 200 마이크로리터의 FAX 버퍼와 4%의 PFA의 200 마이크로리터를 튜브에 넣고 혼합하여 중단합니다.
항생제 젠타미신과의 짧은 치료에서 감염 조건을 사용하여 비내화 Lm을 제거하고, 야생형 Lm의 제로포인트-1-5%는 배양 된 대식세포와 1점-5시간 의 공동 배양 후에 회수된다. 후속 공동 인큐베이션에서, 독점적으로 세포 내 증식을 나타내는 실행 가능한 Lm의 복구에 있는 4배 및 7점-5배 증가가 있었습니다. 비교 프로파일은 초기 감염 시 초반성 prfA를 소유하는 Lm 균주에 대해 관찰되었지만 3~6개의 HPI 사이에는 관찰되지 않았다.
PrfA가 Lm 균주에서 삭제되었을 때, 장기간의 공동 배양 후 변형의 회복이 후속감소된다. 겐타미신이 6개의 HPI에서 우물에서 제거될 때, 세포외 Lm은 야생형 및 초유리성 prfA 균주 모두에 대해 1시간 후에 검출될 수 있지만, prfA를 가진 균주에 대해는 삭제되지 않습니다. 감염되지 않은 대식세포와 감염된 대식세포에 겹쳐지는 매체에는 광산염, 박테리아 크기의 미립자 물질이 포함되어 있습니다.
그러나 감염된 대식세포에서 나온 매체만이 크기 게이팅 내에서 GFP 양성 신호를 소유했다. 감염된 대식세포로 는 phalloidin 양성 Lm의 외관에 있는 시간 의존적인 증가가 관찰되었습니다. 48웰 조직 배양 접시에서 대식세포를 도금할 때 세포없이 우물을 남겨 둡니다.
이러한 세포 없는 대조유는 실험 신호가 숙주 세포의 존재에 의존하도록 병원균, 항생제 등의 첨가와 관련하여 세포 함유 우물과 정확히 동일하게 처리된다. 수치 1 및 3에서 나타난 실험과 유사하게 병원체 또는 숙주 인자 및 소분자는 병원균 세포 에 대한 영향에 대해 테스트할 수 있습니다.
