이 분석은 플라즈마 막 생물학 분야의 주요 질문을 해결하고 얼마나 효율적으로 손상된 세포가 플라즈마 막을 재밀봉 할 수 있는지 확립하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 고처리량 용량에서 플라즈마 멤브레인 재밀봉의 효율성을 측정하고 플라즈마 멤브레인 재밀봉을 중재하는 특정 단백질 및 해당 경로를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 먼저 성장 중간 현탁액의 밀리리터 당 5번째 HeLa 세포에 20밀리리터를 멸균 파이펫 분지에 추가하고 10 밀리리터 세로지컬 파이펫을 사용하여 세포를 철저히 혼합합니다.
다음으로, 멀티채널 마이크로파이프를 사용하여 96웰의 평평한 투명한 바닥, 블랙 폴리스티렌 조직 배양판에서 트리플리케이트에서 잘 100 마이크로리터의 세포를 시드한다. 동질적인 세포 분포는 모든 실험 조건 간의 비교가 동등한 세포 수를 필요로 하기 때문에 성공적인 실험의 핵심이라는 것을 기억하십시오. 가습된 세포 배양 배양인인 배양기에서 섭씨 37도 및 CO2 5%에서 24시간 후, 플레이트 판독기를 섭씨 37도로 예열하고 광학 구성을 단색으로 조정하고, 형광에 대한 판독 모드, 및 판독형을 운동으로 설정하였다.
파장 설정에서 9나노미터 발산과 15나노미터 방출 대역을 선택합니다. 오오드리움을 이용한 아세약의 경우, 각각 535나노미터 및 617나노미터로 발산 및 방출 파장을 설정한다. 플레이트 유형에서 플레이트 형식에 대해 96웰을 선택하고 검정벽 클리어 하단 플레이트에 해당하는 사전 설정 플레이트 구성을 선택합니다.
읽기 영역 아래에서 운동 분석 전반에 걸쳐 분석될 우물을 강조표시합니다. PMT 및 광학 에서 읽기 당 깜박임을 6으로 미리 설정하고 아래에서 읽을 수있는 상자를 선택합니다. 타이밍에 따라 총 런타임에 30분 0초를 입력하여 30분 운동 분석서를 입력하고 간격에 대해 0시간 5분 0초를 입력합니다.
설정 정보에서 지정된 설정을 확인하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 읽기를 클릭하여 운동 실행을 시작합니다. 설정 모드 내에서 이미징 매개 변수를 설정하려면 광학 구성에 대한 MiniMax, 읽기 모드 이미징 및 읽기 유형에 대한 끝점을 설정합니다. 파장 하에서, 실험 흥분 및 방출 파장에 대응하는 전송된 빛 및 적절한 형광 상자를 선택합니다.
플레이트 유형과 읽기 영역을 방금 시연한 대로 설정하고 웰 영역 설정 아래에 이미지를 이미지할 웰 내의 사이트 수를 설정합니다. GFP의 이미지 수집 설정에서 이미지를 이미지당 노출 시간 당 20밀리초로 전체 이미지를 잘 이미지하도록 장치를 설정합니다. 전송된 빛의 경우 8밀리초 노출 시간으로 각 웰의 중심의 단일 이미지를 획득합니다.
프로피듐 요오드의 경우 20밀리초 노출 시간으로 각 우물의 중앙에 단일 이미지를 획득하십시오. 그런 다음 설정 정보의 설정을 확인하고 확인을 클릭하고 이미징을 시작하려면 읽기를 클릭합니다. 수리 허용 조건에 대한 고처리량 형광 계 분석기를 설정하려면, 200 마이크로리터로 세포를 두 번 씻어 37도 M1 배지의 마이크로리터를 잘 세척하고 두 번째 세척후 30 마이크로 모라 프로피듐 요오디드로 보충 된 신선한 37도 M1 배지의 마이크로 리터 를 추가하십시오.
수리 제한 조건의 경우, 37도 의 마이크로 리터 200 마이크로 리터로 세포를 한 번 세척하여 잘 5 밀리모어 EGTA로 보충한 다음 M2 배지의 200 마이크로 리터만 으로 한 번 세척하십시오. 두 번째 세척을 폐기한 후, 100 마이크로리터를 추가하여 37도 의 신선한 섭씨 M2 배지를 잘 30 마이크로몰라 프로피듐 요오드로 보충합니다. 그런 다음 방금 시연된 대로 전송된 빛, GFP 및 PI 아래에서 플레이트를 이미지합니다.
플레이트가 이미지화되는 동안, 얼음에 96 잘 둥근 바닥 폴리 프로필렌 마이크로 플레이트를 배치하고 단지 이전 플레이트에 대해 입증 된 것처럼 플레이트를 구성. 수리 허용 조건의 경우, 잘 당 60 마이크로 몰라 프로디듐 요오드로 보충 얼음 차가운 M1 매체의 100 마이크로 리터를 추가하고 잘 당 4X 리스테리오리신 O 또는 없이 얼음 차가운 M1의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 수리 제한 조건의 경우, 잘 당 60 마이크로 몰라 프로디듐 요오드로 보충 얼음 차가운 M2 배지 의 100 마이크로 리터를 추가하고 잘 당 4X 리스테리오리신 O 또는 없이 얼음 차가운 M2의 100 마이크로 리터를 추가합니다.
플레이트 1개가 얼음과 플레이트 2에 있을 때 운동 분석이 시작되기 약 5분 전에 얼음에 대한 적절한 실험 농도로 리스테리오리신 O를 준비하는 것이 필수적이다. 첫 번째 플레이트가 이미징이 완료되면 즉시 접시를 얼음 위에 알루미늄 호일 시트로 옮기습니다. 5분 후, 제1 냉각판에 해당하는 양상수로 두 번째 플레이트의 각 우물에서 100마이크로리터를 옮기고, 독소의 적절한 분포를 위해 혼합하지 않고 부피를 배출하기 전에 각각의 용액의 반월상연상 아래에 파이펫 팁을 삽입한다.
독소가 1분 동안 숙주 셀에 결합하고 분광성계 모드를 사용하여 운동 후 분석법에 대한 플레이트 판독기로 즉시 이전할 수 있도록 합니다. 운동 분석의 끝에서, 즉시 사전 운동 이미징에 대해 입증 된 바와 같이 플레이트 이미지의 운동 후 이미징을 취득. 핵 형광에 기초하여 세포 수를 결정하기 위해, 마이크로 플레이트 셀 열거 소프트웨어에서 설정하에, 재분석 을 선택하고, 이미지 분석 설정에서, 개체를 찾기위한 파장으로 541을 사용하여 이산 개체 분석을 선택합니다.
찾기 개체 옵션 내에서 이미지 찾기 방법에 대한 그리기를 사용하고 핵을 선택하고 적용을 클릭한 다음 확인을 클릭하고 읽기를 클릭하여 셀 계산 알고리즘을 시작합니다. GFP 발현은 리스테리오리신 O 처리의 존재 또는 부재에서 프로피듐 요오드 강도 측정을 방해하지 않는다. 프로피듐 요오드의 발현은 전운동 분석에 비해 운동 후 이미징 분석에서 HeLA H2B-GFP 세포에서 GFP 형광 강도의 증가에 의해 입증된 바와 같이 GFP 형광을 통해 출혈할 수 있다.
중요한 그러나, 이러한 크로스오버는 GFP 형광의 증가에 영향을 받지 않는 핵의 열거에 관여하는 세분화 과정이 영향을 받지 않기 때문에 세포 계수에 영향을 미치지 않는다. listeriolysin O의 부재에서, 플라즈마 막 무결성은 세포외 칼슘의 존재 또는 부재에서 일정한 남아, 칼슘 보충 매체의 존재에 리스테리오리신 O 치료는 프로피듐 요오드 형광 강도의 꾸준한 증가를 초래하는 동안. 그러나 세포외 칼슘이 없는 경우, 장재밀봉의 부재를 반영하여 프로피듐 요오드 형광이 상당히 가파르게 증가합니다.
대안적으로, 카보시아닌 핵산 결합염은 먼 빨간색의 형광을 함유하여 프로피듐 요오드로 대체되어 GFP와의 스펙트럼 중첩을 최소화할 수 있다. 또한, 먼 적색 염료에 대한 더 큰 흥분 계수는 소음 비율에 더 높은 신호와 수리 허용 및 수리 제한 조건 사이의 더 나은 해상도를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안, 실험의 날에 시약 준비의 모든 당신을 준비하기 때문에, 실험의 하루 전에 튜브의 모든 라벨을 하는 것이 좋습니다.
이 절차에 따라, 이미지 세포측정과 같은 다른 방법은 모공 형성 독소가 모든 세포를 균일하게 손상시키거나 일부 세포가 다른 세포보다 더 민감하게 손상되는 등의 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 다른 세포 모형의 수리 효율성에 공공 크기의 효력을 탐구하기 위하여 전염병 및 혈장 막 복구의 필드에 있는 연구원을 위한 도로를 포장했습니다.
