사만다 Khoury와 파멜라 Ajuyah는 호주 석사 과정을 지원합니다. 우리는 또한 사만다 Khoury 자신의 추가 지원에 대한 번역 상 암 연구 네트워크, 로위 암 연구 센터, 뉴 사우스 웨일즈 대학과 북부 번역 상 암 연구 단위를 인정하고 싶습니다.

참고 : 건강한 환자 또는 암을 가진 환자에서 인간의 혈청 샘플, 로얄 프린스 알프레드 병원 시드니 (프로토콜 번호 X10-0016 및 HREC/10/RPAH/24) 기술 대학에서 승인 된 인간의 윤리 프로토콜에서 동의 얻어졌다 시드니. 혈청 샘플은 다양한 시드니 병원에서 수술 전 환자로부터 수집 및 -80 ° C.에 저장에 넣었다 혈청에서 1. 작은 RNA 격리 전체 RNA는 트라이 RT 시약의 LS 프로토콜의 변형 된 버전을 사용하여 인간 혈청으로부터 제조 하였다. <ol><li> 얼음에 냉동 혈청 샘플을 해동 한 다음 레이블 microcentrifuge 관에 갓 해동 혈청 400 μl를 전송합니다. </li><li> 자유롭게 된 RNase H 2 O 100 μL로 혈청을 희석하고 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 단백질 분해 K을 추가한다. </li><li> 프로 테 K.에 의해 단백질의 소화를 할 수 있도록 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다 </li><li> 티오, 완전한 용해를 보장 트라이 시약 RT LS의 1.5 배의 양 및 4 - 브로 모 아니 솔의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 간단히, 균질 반전 5 초 동안 반복 피펫 팅을 수행하고 표시된 2 ㎖ 무거운 위상 잠금 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 12,000 × g에서 균질 스핀 </li><li> 정중 신선한 DNA LOBIND 튜브로 얻어진 수용액의 적어도 1 ㎖를 가만히 따르다. 유기 계면과는 위상 잠금 튜브의 흰색 겔 아래 포획한다. </li><li> 수용액에 글리코겐의 5.0 μL (5 ㎎ / ㎖) 및 100 % 이소프로판올 500 μl를 추가 반전하여 혼합하고, -20 ℃에서 O / N을 품어 </li><li> 다음 O / N 배양, 4 ° C에서 원심 분리기에서 12,000 × g에서 20 분 동안 원심 분리기 샘플. </li><li> 맑은 상층 액을 버리고 4 ° C에서 원심 분리기에서 16,000 × g에서 2 분간 &quot;플래시&quot;스핀을 수행합니다. </li><li> 조심스럽게 분명 졸을 제거피펫을 사용하여 펠렛을 주변의 ution. </li><li> 10 분 동안 10,000 × g에서 70 %의 에탄올과 원심 분리기 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오. 세척 솔루션을 가만히 따르다 및 세척 단계를 반복합니다. </li></ol> 솔루션에 2. RNA 재 부상 <ol><li> 펠렛이 완전히 용해 보장 된 RNase H 2 O 자유로운 10 μL에 펠렛을 재현 탁. RNA가 완전히 용해되어 있는지 확인하기 위해 샘플을 5 분 동안 55 ° C로 가열 할 수있다. 이 시간 동안 반복 피펫으로 시료를 혼합. 높은 총 RNA 수율의 경우, 동일 환자에서 두 가지 RNA 준비를 풀. </li><li> UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 재현 탁 RNA 정량과 2100 Bioanalyzer를 사용하여 RNA의 품질을 평가합니다. 다운 스트림 응용 프로그램에 사용하기 위해 -80 ° C에서 풀링 된 RNA 샘플을 저장합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Babu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+extraction+efficiency+of+small+RNAs+with+the+Agilent+2100+Bioanalyzer+and+the+Small+RNA+Kit.">Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit.</a> Agilent Application Note. , (2010).</li><li>Tran, N., Hutvagner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+the+regulation+of+the+maturation+of+miRNAs.">Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs.</a> Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).</li><li>Chim, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+characterization+of+placental+microRNAs+in+maternal+plasma.">Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma.</a> Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).</li><li>Lodes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+cancer+with+serum+miRNAs+on+an+oligonucleotide+microarray.">Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+microRNAs+in+serum:+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases.">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li><li>Burgos, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+extracellular+miRNA+in+human+cerebrospinal+fluid+by+next-generation+sequencing.">Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing.</a> RNA. 19, 712-722 (2013).</li><li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction.">Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Anal. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).</li><li>Ichikawa, M., Akiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Combination+of+Extraction+Reagent+and+DNA+Microarray+That+Allows+for+the+Detection+of+Global+MiRNA+Profiles+from+Serum/Plasma.">A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma.</a> Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).</li><li>Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+preparations+from+individual+monogenean+Gyrodactylus+salaris-a+comparison+of+six+commercially+available+totalRNA+extraction+kits.">MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits.</a> BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).</li><li>McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. 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공개 아무것도 없다.

마이크로 RNA의 인구는 혈청에서 발견 된 총 RNA의 약 0.4 ~ 0.5 %를 구성한다. 또한 인간 혈청에서 발견 높은 단백질 함량이있다. RNA를 개선하고 단백질과 페놀 양을 줄이기 위해 우리가 여러 단계의 추가와 함께 기존의 Chomczynski 방식 9을 수정 한 오염. 우리 연구실에서 수행 할 때 전체 RNA는 표준 트라이 시약 RT-LS (분자 연구 센터)를 사용하여 혈청에서 분리 하였다 그러?...

최근, 인간의 질병의 조기 진단을위한 새로운 바이오 마커 발견 성장 밀기가 있었다. 많은 관심 잠재적 마커와 같은 마이크로 RNA 2 (의 miRNA 또는 미르)의 작은 RNA를 사용에 초점을 맞추고있다. 이러한 작은 RNA를가 혈청 및 연구 등의 체액에서 발견되는 그들이 분해에 탄력과 다양한 환경 조건 (3)의 범위에서 안정적 보여 주었다. 이러한 기능, 혈청 또는 순환의 miRNA가 이상적인 바이오 마커 4, 5 감안할. 현재 생체 액에서 작은 RNA의 분리에 대한 두 가지 접근 방법이있다. 두 번째 방법은 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약 7과의 오랜 프로토콜을 사용하면서 첫 번째 방법은, 작은 RNA를 6 바인딩 및 용출 컬럼 기반 기술을 사용한다. 우리는 인간의 혈청에서 작은 RNA를 격리하는 간단한 효과, 열이없는 프로토콜을 개발했습니다. 분리 된 RNA는 즉시 주입니다DNA 올리고 뉴클레오티드의 배열과 RNA의 염기 서열을 포함하여 다운 스트림 애플리케이션에서 ately 사용할. 혈청에서 RNA를 분리하는 페놀 계 방법을 사용할 때 우리는 몇 가지 문제에 직면했기 때문에이 프로토콜이 개발되었다. 전통적인 Chomczynski 방법은 자주 대부분의 상용 공급 업체에서 제공 시약의 범위와 대부분의 실험실에서 사용된다. 그러나 그들의 광범위한 사용을 고려, 엄격한 가이드 라인은 지속적으로 특정 혈액이나 혈청, 체액에서 고품질의 RNA를 생산하기 위해 개발되지 않았습니다. 혈청에서 RNA를 분리와 관련된 일반적인 문제는 낮은 RNA 수율 및 격리, 특히 페놀 동안 사용 된 시약의 오염이 (가) 있습니다. 우리의 접근 방식은 정량 PCR (qPCR에)와 RNA 서열 분석 등의 다운 스트림 분석을위한 고품질의 RNA를 제공하기 위해 이러한 페놀 오염 물질을 제거한다. 우리는 더 miRNA의 배열에서이 RNA를 테스트했습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:852px;" width="851">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Name of the Material/Equipment&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Company&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Catalog Number&#160;</td>
			<td style="width:248px;">Comments/ Description (optional)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Tri-Reagent RT LS</td>
			<td style="width:223px;">Molecular Research Centre, USA</td>
			<td style="width:123px;">TR 118</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:259px;">RNase free H20</td>
			<td style="width:223px;">GIBCO Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10977-023</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Proteinase K&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Finnzymes, Finland</td>
			<td style="width:123px;">EO0491</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Heavy Phaselock Tube</td>
			<td style="width:223px;">5PRIME</td>
			<td>2302830</td>
			<td style="width:248px;">2ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">DNA Lobind tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:123px;">0030 108.078</td>
			<td style="width:248px;">1.5ml capacity</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Glycogen&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen, USA</td>
			<td style="width:123px;">10814-010</td>
			<td style="width:248px;">5mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Isopropanol&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">I9516</td>
			<td style="width:248px;">100%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Refrigerated Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">John Morris</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Nanodrop UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">RNA grade Ethanol</td>
			<td style="width:223px;">Sigma Aldrich, USA</td>
			<td style="width:123px;">E7023</td>
			<td style="width:248px;">70%</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:259px;">Agilent 2100 Bioanalyser</td>
			<td style="width:223px;">Agilent, USA</td>
			<td style="width:123px;">-</td>
			<td style="width:248px;">-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of small noncoding rnas from human serum

RNA와 그 표현의 분석은 많은 실험실에서 일반적인 기능입니다. 중요한 것은 포유 동물 세포에서 발견되는 마이크로 RNA와 같은 작은 RNA를의 등장입니다. 이 작은 RNA를은 성장, 발달 및 죽음과 많은 관심과 같은 중요한 경로를 제어하는​​ 강력한 유전자 규제 체액에서의 표현에 지시 된입니다. 이것은 암 혈청 바이오 마커로서의 가능성 응용 프로그램으로 인간의 질병에서의 조절 장애에 의한 것입니다. 그러나, 혈청에서의 miRNA 발현의 분석은 문제가 될 수있다. 대부분의 경우 혈청의 양을 제한하고, 혈청 작은 RNA를은 0.4 ~ 0.5 % 1을 구성하는 총 RNA의 낮은 금액을 포함합니다. 따라서 혈청에서 품질의 RNA의 충분한 양의 분리는 연구자들에게 중요한 도전 오늘입니다. 이 기술 문서에서는, 우리는 DNA 배열 또는 qPCR의 분석도 충분한 RNA를 얻기 위해 인간의 혈청 400 μl를 사용하는 방법을 보여줍니다.이 방법의 dvantages은 단순하고 고품질의 RNA를 생성 할 수있는 능력이다. 그것은 작은 RNA를 정제에 대한 전문적인 열을 필요로하지 않습니다 및 일반 실험실에있는 일반 시약 및 하드웨어를 사용합니다. 우리의 방법은 동시에 고품질의 RNA를 수득하면서 페놀 오염을 제거하기 위해 위상 잠금 젤을 이용한다. 또한, 상기 분리 단계에서 모든 오염 물질을 제거하는 추가 단계를 소개한다. 이 프로토콜은 혈청에서 최대 100 NG / μL의 총 RNA의 수율을 분리하는데 매우 효과적이지만 다른 생물 조직에 적용 할 수 있습니다.

그림 1은 혈청에서 분리 된 RNA의 일반적인 UV / 비스 스펙트럼을 나타냅니다. 이 프로필에서 우리는 각각 모두 270 ㎚, 230 ㎚에서의 페놀 및 유기 오염 물질을 280 nm에서 단백질의 오염을 지적했다. 잔류 구 아니 디늄 티오 시아 네이트는 260 nm에서 관찰되었다. 오염물을 줄이기 위해 최적화 일련의 단계는 표준 트라이 시약 RT-LS 절차로 만들어졌다. 우리는 총 RNA의 수율을 모두 증가하고 ?...

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Isolation of Small Noncoding RNAs from Human Serum

이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법​​을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다.

인간 혈청에서 작은 비 암호화 RNA를의 분리

The analysis of RNA and its expression is a common feature in many laboratories. Of significance is the emergence of small RNAs like microRNAs, which are ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.0K 조회수.  University of Technology, Sydney.  이 프로토콜은 인간 혈청에서 작은 RNA를 추출하는 방법을 설명합니다. 우리는 DNA 배열에 사용하기 위해 암 혈청에서 마이크로 RNA를 분리하고 또한 singleplex 정량 PCR이 방법​​을 사용했습니다. 프로토콜은 고품질의 RNA를 수득 수정하여 페놀 및 아니 디늄 티오 시아 네이트 시약을 이용한다. 