우리의 프로토콜은 실험적인 신생아 패혈증 모형에 있는 세균성 보급 및 부담 추적을 실시간으로 허용하고, 병원체 부담과 질병의 그밖 마커를 상관시키는 기능을 허용합니다. 이 프로토콜은 개별 신생아 마우스에 있는 패혈증을 세로로 분석하는 것을 허용하고, 실시간으로 감염 역학 및 세균성 보급을 관찰하고 비교할 기회를 제공합니다. 신생아 패혈증에 대한 내정간섭의 전임상 시험은 박테리아의 호스트 통제의 효력의 감시를 허용하는 이 방법으로 수행될 수 있습니다.
생체 안전 수준 2 캐비닛 내에서 연령 일치 새끼를 고용량 또는 저용량 쓰레기 그룹에 배치하여 시작합니다. 산후 3 또는 4 일에 접종 전에 모든 새끼의 무게를 기록하십시오. PBS 또는 생체 안전 캐비닛에 높은 또는 저용량 E.coli 럭스 접종을 가진 인슐린 주사기를 로드하고 얼음에로드 된 주사기를 배치합니다.
신생아를 생물 안전 캐비닛 내의 깨끗한 표면에 주입하고 강아지를 덜어 두는 것처럼 목의 목덜미에서 피부를 올립니다. 바늘을 피부와 근육 사이에 만든 공간에서 피부 바로 아래에 서 두세요. 바늘이 피부 밑에서 느낄 수 있을 때, 역류를 방지하기 위해 피부의 꼬집어 넣은 부분을 동시에 방출하는 동안 무분비제의 50 마이크로리터를 주입한 다음 천천히 바늘을 제거하고 주의하십시오.
모든 새끼가 같은 방식으로 주입되었을 때 새끼를 댐으로 돌려보습니다. 주사 직후와 그 후 적절한 실험 시점에서, E.coli 럭스 감염된 신생아 마우스와 댐을 가진 케이지를 생물 안전 수준 2 라미나르 플로우 후드에 넣고 마이크로 CT 컴퓨터에서 소프트웨어를 엽니다. 시스템을 초기화하고 스테이지 온도가 섭씨 37도에서 잠기고 CCD 온도가 음수 섭씨 90도에서 잠글 때까지 기다린 후, 최대 4개의 마취된 새끼를 이미징 챔버의 이미징 박스에 놓습니다.
이미징 챔버 도어를 닫고 발광 이미징 옵션을 선택합니다. 열린 필터를 선택하고 다음필터를 설정하고 여기 필터를 차단하고 방출 필터를 엽니다. 500, 520, 560, 580, 600 및 620 나노미터를 선택합니다.
그런 다음 새끼를 마취 복구 할 때까지 모니터링하여 댐으로 케이지로 되돌리기 전에 이미지를 이미지합니다. 적절한 실험 적 종점에서, 생물 안전 캐비닛에서, 오염을 방지하고 오른쪽에 동물을 배치하기 위해 70 %에탄올로 안락사 신천을 douse. 집게를 사용하여 복부와 후면 왼쪽 다리 사이의 피부를 파악하고 미세 팁 수술 가위를 사용하여 피부 절개를 합니다.
그런 다음 전체 비장이 노출 될 때까지 동물의 뒤쪽으로 절개를 계속합니다. 집게와 가위를 사용하여 복부에서 비장을 제거하고 다운스트림 응용 프로그램에 적합한 솔루션에 배치합니다. 폐를 얻기 위해 가슴의 피부를 완전히 벗겨 내고 가위를 수직으로 잡고 흉골 의 바닥에 들어가 갈비뼈케이지가 분할 될 때까지 위쪽으로 자른다.
집게를 사용하여 좌우 폐를 개별적으로 잡고 흉부 구멍에서 폐를 제거하십시오. 가위로 폐 조직에서 심장을 제거합니다. 그런 다음 폐를 다운스트림 적용에 적합한 용액에 배치합니다.
체외 세균 성 살인 분석기를 수행하려면 감염되지 않은 비장을 멸균 60 mm 페트리 접시 내에 40 마이크로 미터 나일론 스트레이너에 넣고 10 %의 태아 소 혈청으로 보충된 PBS의 5 밀리리터를 함유하고 멸균 3 밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 조직을 단일 세포 현탁액으로 분해합니다. 세포를 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리로 수집합니다. 3~4개의 비장당 적혈구 리시스 완충제 의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
실온에서 5 분 후, PBS에서 비장을 세척하고 계산을위한 소 혈청 알부민과 2 밀리몰러 EDTA로 보충 PBS의 250 마이크로 리터에서 펠릿을 다시 중단. 다음으로, 제조업체의 프로토콜에 따라 적절한 면역자기 구슬로 Ly6 B2 양성 세포를 분리하고, 농축된 Ly6 B2 양성 세포를 100마이크로리터당 5개의 세포로 100마이크로리터당 흑백 96웰 플레이트에서 분리한다. 세균성 접종을 웰당 100 마이크로리터의 최종 부피로 원하는 복합체로 준비하고 세포 배양 인큐베이터에서 1시간 배양을 위해 세균성 접종또는 배지 100마이크로리터를 단독으로 첨가한다.
인큐베이션이 끝나면, 배지를 젠타마이신 밀리리터당 100마이크로그램으로 보충한 200마이크로리터의 미생물을 교체하여 남은 세포외 균을 제거하고 세포를 세포 배양 배양 인큐베이터로 2시간 더 되돌려 보도록 한다. 배양의 끝에서 각 실험 시점에서, 다음 판독까지 세포 배양 배양 배양판의 각 우물에서 발광을 측정하기 위해 플레이트 판독기를 사용합니다. 대부분의 동물은 감염 후 24 시간에서 혈액에 있는 박테리아의 상부를 전시하는 동안, 몇몇 새끼는 혈액에 있는 낮거나 탐지할 수 없는 박테리아가, 이 시점에서 감염의 간격을 건의합니다.
또한, 신생아 Ly6 B2 양성 비장 세포는 세포외 박테리아및 후속 젠타마이신 처리의 제거 전에 1 시간 동안 생물 발광 E.coli에 감염된 세균성 클리어런스를 나타내는 시간이 지남에 따라 감소하는 3 시간에서 높은 수준의 발광을 나타냈다. 발광 균의 살아있는 동물 화상 진찰은 감염 후 10 및 24 시간에 시간이 지남에 따라 신생아 새끼에 있는 박테리아 보급 그리고 성장의 증가를 추가확인합니다. 마이크로 CT와 함께 인트라바이탈 이미징은 뇌, 폐 및 기타 말초 조직 내의 감염 포시 식별을 용이하게 합니다.
몇몇 고도로 감염된 마우스의 폐는 발광 세균 신호에 공동 국소화한 선동적인 통합과 일치하는 불투명한 지구를 보여줍니다. 추정된 선동적인 exudate의 이 지구는 감염되지 않은 통제 폐에서 관찰되지 않습니다. 대조군에 비해 염증성 사이토카인 발현의 현저한 증가는 또한 폐포 벽의 주목할 만한 두껍게, 증가된 폐포 출혈 및 이 동물에 있는 선동적인 침투와 상관관계인 낮고 높은 접종 단 둘 다에서 관찰됩니다.
기억해야 할 가장 중요한 것은 주사를 수행 할 때 적절한 기술을 실행하고 마취를 투여 할 때 신생아에게 엄격한주의를 기울이는 것입니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 반응을 향상시키기 위한 내정간섭 및 호스트 지시한 치료를 공부하기 위하여 실시간으로 신생아 패혈증을 시각화할 수 있습니다.
