금융 지원은 NIH 감독의 새로운 혁신 상 (1DP2HL117750)에서 다우드-ICES 교제 QJ과 AWF에, 재생 의학 T32 교육 프로그램 (2T32EB003392)에 NIH 역학에서 JMS에 제공되었다.

포토 리소그래피를 사용하여 마스터 몰드 1. 제작 <ol><li> ECM 단백질 나노 섬유, nanofabrics 및 제조 할 수있는 나노 구조는 첫 번째 (CAD) 소프트웨어를 컴퓨터 지원 설계를 사용하여 설계되었습니다. 이 CAD 파일은 그 다음, 포토 마스크로 전사된다. 포토 마스크의 분류는 특징의 해상도에 의존 할 것이다; 투명도 기반의 포토 마스크와 기능에 대한 충분한은 ~ 10 ㎛까지 크기. 작은 기능은 10 ㎛ 유리 포토 마스크에 크롬이 필요합니다 &lt;. 여기에 제시된 나노 섬유 및 나노 구조의 모든 투명도 기반의 포토 마스크를 이용하여 제조하고, 따라서 두께가 나노 미터 스케일했지만 횡되지 치수 하였다. 참고 : 그것은 (통과 자외선 방지) 포토 마스크의 영역이 어둡게되는 구분하는 것이 중요하고 투명하게되는이 같은 (UV 빛이 통과 할 수 있도록), 포토 레지스트의 종류에 따라 (양 또는 음) 마스터 몰드의 최종 지형을 지시 할 것이다. </li><li> 마스터 몰드의 제조를 시작하기 위해 15 분 동안 150 ° C의 설정, 핫 플레이트에 배치하여 4 &quot;실리콘 웨이퍼를 탈수. </li><li> 스핀 코터의 진공 척에 웨이퍼를 중앙. 웨이퍼의 중간에 SU8 2015 네가티브 포토 레지스트를 붓고 웨이퍼의 3 분의 2가 덮여 때까지 동심원 쏟아져 계속합니다. 참고 : 거품의 형성을 최소화하기 위해 붓는 때 웨이퍼 SU8 가까이의 병을 유지. </li><li> 다음과 같이 스핀 코터 프로그램 : <ul><li> 스프레드주기 : 10 초 동안 100 RPM / 초 가속 500 분당 회전 수. </li><li> 회전주기 : 30 초 동안 100 RPM / 초 가속 4,000 rpm으로. </li></ul> 주 :이 스핀 코팅 레시피 두께 ~ 10 ㎛ 인 포토 레지스트 층을 형성 할 것이다. 방사 속도 또는 SU8 제형을 변경함으로써, 두께가 조정될 수있다. </li><li> 소프트 3 분 동안 95 ° C로 설정 열판에 배치하여 웨이퍼를 굽는다. </li><li> 를 통해 자외선 웨이퍼를 노출140 엠제이 / cm 2의 총 투여 량을위한 포토 마스크. 참고 : SU8은 네가티브 포토 레지스트 그러므로 UV 광이 포토 마스크를 통과 할 수있는 영역은 현상 후에 남아 마스터 주형에 융기 형상이 될 것이다. </li><li> 4 분 동안 95 ° C의 설정 열판에 배치하여 웨이퍼 베이크 노출을 게시합니다. </li><li> 3 분 동안 SU8 개발자에 배치하여 웨이퍼를 개발한다. 3 분 후에, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹군다. 흰색 막을 세정 중에 생성되는 경우, 웨이퍼는 완전히 개발되지 않고 다른 30 ​​초 동안 현상 제에 다시 배치되어야한다. 이소 프로필 알콜로 세척한다. 흰색 필름이 이소 프로필 알코올 세정하는 동안 형성하지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. </li><li> 먼지로부터 보호하기 위해 150mm 페트리 접시에 질소와 장소의 흐름에 웨이퍼를 건조. </li></ol> 2. PDMS 스탬프 만들기 <ol><li> 탄성 중합체 기반을 결합하고있는 에이전트를 경화시켜 PDMS 예비 중합체를 준비10시 1분 w / w 비율. 일반적 기재 및 경화제 8g의 80g는 1cm 두꺼운 층에 마스터 주형을 커버하기에 충분한 PDMS가 있는지 확인하기 위해 사용된다. </li><li> 혼합하고 다음과 같이 설정 구심 믹서를 사용하여 PDMS를 드가 : <ul><li> 혼합 : 2 분 동안 2,000 rpm으로 </li><li> 드가 : 2 분 동안 2,000 rpm으로. </li></ul></li><li> 믹서를 사용할 수없는 경우 10 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 10 분 동안 손으로 PDMS를 섞는다. 기포를 제거하기 위해 30 분간 진공 건조기에 배치하여, 혼합물을 탈기. </li><li> 1cm 두께의 층을 형성하는 매스터 주형 (패터닝 된 실리콘 웨이퍼) 위에 충분한 PDMS의 예비 중합체를 붓는다. 48 시간 동안 4 시간 또는 실내 온도 65 ° C에서 소성하여 PDMS를 치료. </li><li> 일단 치료, 패턴을 포함하는 영역은 PDMS 스탬프를 형성하기 위해 절단 할 수 있습니다. PDMS 스탬프의 뒤편에서 기능면을 구분하기 위해 우표의 뒷면의 모서리 중 하나 밖으로 노치를 잘라. </li></ol> 3. 마이크로 콘택트 홍보ECM 패턴의 inting <ol><li> 1 시간과 65 ° C 오븐에서 건조 후 95 % 에탄올에서 초음파에 의해 청소 지름 25mm 유리 커버 슬립. </li><li> 10 %의 농도 (10 ml 중 V / w, 전형적 1g)에서 1 - 부탄올에 용해시켜 PIPAAm PIPAAm 용액을 준비한다. </li><li> 전체 유리 표면이 피복되도록 PIPAAm 용액의 스핀 코터 피펫 200 μL의 진공 척에 유리 커버 슬립을 가운데. </li><li> 1 분 동안 6,000 rpm에서 커버 슬립을 Spincoat. </li><li> 30 분 질소의 흐름에 따라 다음 건조 50 % 에탄올에서 초음파에 의해 PDMS 스탬프를 청소합니다. 참고 : 건조 및 후속 단계는 ECM 나노 구조가 세포로 사용될 어플리케이션을위한 무균을 유지하는 바이오 캐비닛에서 수행되어야한다. </li><li> 코트는 각 PDMS의 패턴 화 된 표면은 단백질 용액 200 μL, FN 멸균 증류수에 일반적으로 50 μg / ㎖와 스탬프. 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 참고 : 목볼륨을 코팅하면 1.5 cm 2 PDMS 스탬프 용, PDMS 스탬프를 사용 ECM 단백질과 용액 ECM 단백질의 농도의 크기에 따라 조정해야한다. </li><li> 충분히 질소의 흐름에 따라 여분의 단백질과 건조를 제거하기 위해 증류수에 PDMS 스탬프를 씻으십시오. 참고 : 스탬프에 남아있는 모든 물이 커버 슬립에 PIPAAm 코팅의 조기 해산을 트리거하고 적절한 단백질 전송을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 무균 제조를 들어, 폐쇄 배양 접시 안에 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 배치하고 생물 안전 캐비닛에 자외선 노출, 자외선 아래에서 45 분을 사용하여 살균하면됩니다. 불임이 필요하지 않은 경우이 단계를 생략 할 수 있습니다. </li><li> PIPAAm 코팅 coverslip에 접촉 PDMS 스탬프의 기능 측면을 배치하여 미세 접촉 인쇄를 수행합니다. 필요한 경우, 공기 방울을 제거하고 균일 한 접촉을 보장하기 위해 우표의 뒷면에 가볍게 살짝 집게를 사용합니다. </li><li> 5 마일 후N, 커버 슬립에서 PDMS 스탬프를 벗긴다. </li><li> 이 단계에서, 부가적인 ECM 단백질은 더 복잡하고 다 성분 구조를 생성하도록 패터닝 될 수있다. 최대 3 인쇄용이 과정에서 작동하도록 확인 된, 더는 실현 될 수있다. </li></ol> ECM 나노 섬유 및 나노 구조 4. 출시 <ol><li> 35mm 페트리 접시에있는 패턴 PIPAAm 코팅 커버 슬립을 놓고 위상차 현미경을 사용하여 패턴 충실도를 검사합니다. 패턴에 따라, CCD 카메라는 패턴의 기능을 해결해야 할 수도 있습니다. 형광 현미경도 ECM 단백질은 형광 표지되어 제공된 패턴을 검사하는데 사용될 수있다. </li><li> 페트리 접시에 40 ° C의 증류수 3 mL를 넣고 물을 서서히 냉각 할 수 있습니다. </li><li> PIPAAm 층의 용해 및 ECM 단백질 패턴의 방출은 위상차 현미경을 사용하여 모니터링 할 수있다. 애플리케이션은 광 TEC의 사용을 허가하지 않는 경우hniques, 릴리스는 용액의 온도를 측정하여 모니터링 할 수 있습니다. 전형적으로, 물은 ECM 단백질 나노 구조가 릴리스 된 있도록 잘 PIPAAm (32 ℃)의 LCST 이하, 실온으로 냉각된다. </li><li> 출시 후, 나노 섬유, nanofabrics 및 기타 나노 구조는 물에 떠있다. 이를 사용하려면 추가 응용 프로그램들은 조작 할 필요가있다. 정확한 방법은 실험 목적에 따라 달라집니다하고, 다른 표면에 고정화 미세 조작기 시스템으로 이동하거나 하이드로 겔 삽입 등의 단계를 포함 할 수있다. </li></ol>

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

SIA의 방법은 여기에서 모방 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 제시하고 조정할 수있는 크기, 조직 및 구성과 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 설계를 가능하게한다. 세포 생성 ECM과 동일하지는 않지만, SIA는 기계적 변형 21 일 동안 전개 / 가역 접는를 받아야 세포 20을 바인딩 할 수 있습니다 나노 단백질 섬유 (20)로 구성 ECM을 만듭니다. 이것은 생체 내에서 발견 ?...

조직의 세포 외 기질 (ECM)를 부착, 증식, 분화 및 세포 사멸 1-3 포함한 여러 세포 프로세스의 물리적, 화학적 조절에 관여 다기능 단백질로 구성되어있다. ECM은, 합성, 조립 및 세포 조직의 구성 단백질 섬유 조직의 종류와 발달 단계에 따라 달라 독특한 성분, 섬유의 크기, 형상 및 상호 연결된 구조를 가지고있다. 최근 작품은 ECM이 조성과 구조의 측면에서 ECM을 recapitulating하는 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 생체 모방 재료의 개발을 가능하게 할 수 있다고 제안, 설계 조직 4를 형성하는 세포를 안내하는 유익한 단서를 제공 할 수 있음을 보여 주었다. 제조 방법의 수는 조직에 ECM의 측면을 모방 할 중합체 골격을 설계하기 위해 개발되었다. 예를 들어, 전기 방사 및 위상 저전압 회로 차단기ATION 모두 다운 수십 마이크로 미터에서 나노 미터 5-7 수십에 이르는 직경 섬유의 다공성 매트릭스를 형성하는 능력을 증명하고있다. 두 가지 기술은 나노 섬유의 다공성 매트릭스는 발판 (8)에 세포 부착 및 침투를 지원할 수있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 접근 방식을 만들 수 있습니다 가능한 섬유 형상, 방향 및 3D 아키텍처에 제한됩니다. 상 분리가 무작위로 지향 섬유 지지체를 생산하는 반면 전기 방사는 일반적으로 무작위로 지향 또는 매우 정렬 된 하나 섬유 발판을 생산하고 있습니다. 재료에 대한 제한은 연구자 전형적 폴리이어서 세포 부착을 촉진하는 ECM 단백질로 코팅된다 (ε-카프로 락톤) (8) 및 폴리 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (9)와 같은 합성 중합체를 사용하여도있다. 자연 생물 중합체는 또한, 콜라겐 타입 I (10), 젤라틴 (11), 피브리노겐 (12)을 포함하여 사용된다키토산 (13), 실크 (14) 만 네이티브 조직에서 발견되는 단백질의 일부만을 나타낸다. 대부분의 조직은 기존의 방법을 사용하여 나노 섬유를 제조하기가 어렵거나 불가능한 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN), 콜라겐 IV 형과 히알루 론산 등의 ECM 단백질과 다당류의 더 큰 환경을 포함한다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 세포가 조립하고 자신의 주변에서 ECM 단백질 섬유를 구성, 합성 방식을 흉내 낸에 대한 우리의 연구 노력을 집중했다. 특정 fibrillogenesis 프로세스가 상이한 ECM 단백질에 대해 다르​​지만, 일반적 ECM 단백질 분자의 입체 형태 변화가 애매한 자기 조립 사이트를 노출 효소 또는 수용체 매개의 상호 작용에 의해 트리거된다. 여기에서 우리는 더 fibrillogenesis 과정을 이해하는 모델 시스템으로 FN를 사용합니다. 간단히, FN 동종이 량체는 10 타입 II에서 RGD의 아미노산 서열을 통해 세포 표면의 수용체 인테그린에 결합나는 장치를 반복합니다. 일단 바인딩, 인테그린은 actomyosin 수축을 통해 떨어져 이동하고 암호화 된 자기 조립 사이트를 노출하는 FN 이량 체를 전개. 이 FN-FN 결합 부위의 노출은 바로 세포 표면 (15)에 불용성 브릴로 조립하는 FN 이합체 수 있습니다. 세포가없는 시스템에서 작업은 암호화 된 FN-FN 결합 부위가 공기 - 액체 - 고체 인터페이스 17-19에서 변성제 16 또는 표면 장력을 사용하여 전개를 통해 공개 될 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이들 기술에 의해 생성 된 FN 섬유는 특정 섬유 크기 및 형상에 제한되며, 일반적으로 표면에 결합된다. 여기에 우리가 독립 불용성 나노 섬유, nanofabrics (2D 시트) (그림 1 단일 또는 다중 ECM 단백질로 구성된 다른 나노 구조를 만드는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 이러한 한계를 극복 할 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA) (20)를 설명 ). 이 P에서로웠은, ECM 단백질은 용액에서 소형, 구형 형태에서 흡착 부분적 패턴, 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 스탬프 상 (펼쳐진) 변성된다. ECM 단백질은 다음 22 인쇄 미세 접촉을 통해 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에이 상태로 전송됩니다. 40 ° C의 물에 수화 때 PIPAAm 고체 남아 있지만, 32 °의 C로 냉각 할 때 그것은 친수성이되는 낮은 임계 용액 온도 (LCST)를 통과, 물에 팽윤하고 용해 떨어져 조립 ECM 나노 구조를 해제 면. SIA 방법은 나노 미터 스케일의 정밀 치수 제어를 제공한다. 이러한 구성, 섬유 형상 및 구조와 같은 주요 파라미터를 제어함으로써, 생체 내에서 발견 된 ECM의 여러 속성을 요점을 되풀이하고, 조직 공학 및 생명 공학 응용을위한 고급 발판을 개발하는 것이 가능하다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="651">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm</td>
			<td style="width:145px;">Polysciences</td>
			<td style="width:123px;">21458-10</td>
			<td style="width:167px;">40,000 Mw</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone kit (PDMS)</td>
			<td style="width:145px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;">Mix 10 parts base with 1 part curing agent.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Butanol</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354008</td>
			<td style="width:167px;">Human, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Laminin</td>
			<td style="width:145px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:123px;">354239</td>
			<td style="width:167px;">Ultrapure, mouse, 1mg</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Negative Photoresist</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;">SU8-2015</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">SU8 Developer</td>
			<td style="width:145px;">Microchem</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:216px;">Sonicator Branson M3510</td>
			<td style="width:145px;">Branson Ultrasonic Corporation</td>
			<td style="width:123px;">CPN-952-318</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">Thinky ARE-250 Mixer</td>
			<td style="width:145px;">Thinky Corporation</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Spincoater</td>
			<td style="width:145px;">Specialty Coating Systems</td>
			<td style="width:123px;">G3P-8</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Glass cover 25mm diameter, No 1.5</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">12-545-86</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ecm protein nanofibers and nanostructures engineered using surface-initiated assembly

조직의 세포 외 기질 (ECM)의 합성과 밀접 규제 섬유 직경, 조성 및 조직 차원 섬유 성 단백질의 네트워크를 형성하기 위해 세포에 의해 조립된다. 구조적지지를 제공하는 것 외에도, ECM의 물리 화학적 특성은 접착 성, 분화 및 세포 사멸 등 다양한 세포 과정에 중요한 역할을한다. 생체, ECM은 단백질 내에서 암호화 된 자기 조립 (fibrillogenesis) 사이트를 노출시킴으로써 조립할 . 이 과정은 다른 단백질을 다양하지만, 피브로넥틴 (FN) fibrillogenesis 잘 특징입니다 세포 매개 ECM 조립을위한 모델 시스템 역할을합니다. 특히, 세포는 불용성 섬유로 어셈블리에 대한 바인딩 사이트를 펼치고 노출 FN 이량 체 및 actomyosin 생성 수축력을 바인딩하는 세포막에 인테그린 수용체를 사용합니다. 이 수용체 - 중재 과정은 조직 SCA에 세포에서 ECM을 조립하고 구성하는 세포 수레. 여기, 우리는 ECM 단백질을 전개하고 불용성 섬유로 그들을 조립하는 단백질 표면의 상호 작용을 이용하여 세포 매개 매트릭스 어셈블리를 되풀이되었습니다 방법이라면 시작한 어셈블리 (SIA)를 제시한다. 첫째, ECM 단백질들은 부분적으로 (펼치) 변성 및 암호화 된 바인딩 도메인을 노출 소수성 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 표면에 흡착된다. 펼쳐진 단백질은 다음 열 감응성 폴리 (N-이소 프로필) (PIPAAm) 표면에 미세 접촉 인쇄를 통해 잘 정의 된 마이크로 및 나노 패턴을에 전송됩니다. PIPAAm의 열 트리거 용해 최종 조립과 잘 정의 된 지오메트리와 불용성 ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조의 릴리스로 연결됩니다. 복잡한 구조는 미세 접촉 인쇄에 사용되는 PDMS 스탬프에 엔지니어링 정의 된 패턴에 의해 가능하다. FN 이외에, SIA 프로세스는 라미닌, 피브리노겐으로 사용될 수 있고 콜라겐은 I 및 IV는 다 성분 ECM의 나노 구조를 만드는 입력뚜. 따라서, SIA는 생체 내에서 ECM의 구조와 구성을 다시 요약하기 위해 단백질 조성물, 섬유 형상 및 지지체 구조를 정확하게 제어하여 ECM 단백질 계 물질을 설계하는 데 사용될 수있다.

SIA는 섬유 치수를 정확하게 제어 엔지니어링의 ECM 단백질 나노 섬유의 할 수있다. 이 방법을 설명하기 위해 50 × 20 ㎛, 평면 치수 FN 나노 섬유의 배열은 PIPAAm 코팅 커버 슬립 (그림 2A)로 패턴 화 하였다. PIPAAm 표면 (그림 2B)에 패턴 때 그들이 고유의 사전 스트레스를 받고 있었기 때문에 릴리스에 따라, 섬유는 계약. FN 나노 섬유의 분석들은 50.19의 평균 길이가 단 분산 시험...

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ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

The extracellular matrix (ECM) in tissues is synthesized and assembled by cells to form a 3D fibrillar, protein network with tightly regulated fiber ...

ecm-protein-nanofibers-nanostructures-engineered-using-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.4K 조회수.  Carnegie Mellon University.  단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

연구

생체공학

Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological research. Perhaps the most widely used physical force to achieve noninvasive manipulation of small particles has been dielectrophoresis(DEP).1 However, DEP on its own lacks the versatility and precision that are desired when manipulating cells since it is traditionally done with stationary electrodes. Optical tweezers, which utilize a three dimensional electromagnetic field gradient to exert forces on small particles, achieve this desired versatility and precision.2 However, a major drawback of this approach is the high radiation intensity required to achieve the necessary force to trap a particle which can damage biological samples.3 A solution that allows trapping and sorting with lower optical intensities are optoelectronic tweezers (OET) but OET's have limitations with fine manipulation of small particles; being DEP-based technology also puts constraint on the property of the solution.4,5
This video article will describe two methods that decrease the intensity of the radiation needed for optical manipulation of living cells and also describe a method for orientation control. The first method is plasmonic tweezers which use a random gold nanoparticle (AuNP) array as a substrate for the sample as shown in Figure 1. The AuNP array converts the incident photons into localized surface plasmons (LSP) which consist of resonant dipole moments that radiate and generate a patterned radiation field with a large gradient in the cell solution. Initial work on surface plasmon enhanced trapping by Righini et al and our own modeling have shown the fields generated by the plasmonic substrate reduce the initial intensity required by enhancing the gradient field that traps the particle.6,7,8 The plasmonic approach allows for fine orientation control of ellipsoidal particles and cells with low optical intensities because of more efficient optical energy conversion into mechanical energy and a dipole-dependent radiation field. These fields are shown in figure 2 and the low trapping intensities are detailed in figures 4 and 5. The main problems with plasmonic tweezers are that the LSP's generate a considerable amount of heat and the trapping is only two dimensional. This heat generates convective flows and thermophoresis which can be powerful enough to expel submicron particles from the trap.9,10 The second approach that we will describe is utilizing periodic dielectric nanostructures to scatter incident light very efficiently into diffraction modes, as shown in figure 6.11 Ideally, one would make this structure out of a dielectric material to avoid the same heating problems experienced with the plasmonic tweezers but in our approach an aluminum-coated diffraction grating is used as a one-dimensional periodic dielectric nanostructure. Although it is not a semiconductor, it did not experience significant heating and effectively trapped small particles with low trapping intensities, as shown in figure 7. Alignment of particles with the grating substrate conceptually validates the proposition that a 2-D photonic crystal could allow precise rotation of non-spherical micron sized particles.10 The efficiencies of these optical traps are increased due to the enhanced fields produced by the nanostructures described in this paper.

Plasmonic tweezers and photonic crystal nanostructures are shown to produce useful enhancements in the efficiency and orientation control of optically trapping micro- and nano-particles.

향상된 마이크로 및 Nanoparticle 조작에 대한 Plasmonic 및 광자 크리스탈 Nanostructures 활용

A method to manipulate the position and orientation of submicron particles nondestructively would be an incredibly useful tool for basic biological ...

Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently incorporated into film assemblies that serve as adsorption platforms for protein monolayer electrochemistry (PME). PME is utilized as the model system for studying electrochemical properties of redox proteins by confining them to an adsorption platform at a modified electrode, which also serves as a redox partner for electron transfer (ET) reactions. Studies have shown that gold nanoparticle film assemblies of this nature provide for a more homogeneous protein adsorption environment and promote ET without distance dependence compared to the more traditional systems modified with alkanethiol self-assembled monolayers (SAM).1-3 In this paper, MPCs functionalized with hexanethiolate ligands are synthesized using a modified Brust reaction4 and characterized with ultraviolet visible (UV-Vis) spectroscopy, transmission electron microscopy (TEM), and proton (1H) nuclear magnetic resonance (NMR). MPC films are assembled on SAM modified gold electrode interfaces by using a "dip cycle" method of alternating MPC layers and dithiol linking molecules. Film growth at gold electrode is tracked electrochemically by measuring changes to the double layer charging current of the system. Analogous films assembled on silane modified glass slides allow for optical monitoring of film growth and cross-sectional TEM analysis provides an estimated film thickness. During film assembly, manipulation of the MPC ligand protection as well as the interparticle linkage mechanism allow for networked films, that are readily adaptable, to interface with redox protein having different adsorption mechanism. For example, Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) can be adsorbed hydrophobically to dithiol-linked films of hexanethiolate MPCs and cytochrome c (cyt c) can be immobilized electrostatically at a carboxylic acid modified MPC interfacial layer. In this report, we focus on the film protocol for the AZ system exclusively. Investigations involving the adsorption of proteins on MPC modified synthetic platforms could further the understanding of interactions between biomolecules and man-made materials, and consequently aid the development of biosensor schemes, ET modeling systems, and synthetic biocompatible materials.5-8

Alkanethiolate stabilized gold colloids known as monolayer protected clusters (MPCs) are synthesized, characterized, and assembled into thin films as an adsorption interface for protein monolayer electrochemistry of simple redox protein like Pseudomonas aeruginosa azurin (AZ) and cytochrome c (cyt c).

Monolayer의 합성, 조립, 그리고 특성화는 단백질 Monolayer의 전기에 대한 골드 Nanoparticle 필름을 보호

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

미세화 및 3D 미세 혈관의 조립

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

3D 인쇄 가이드 및 반지 스태킹 방법을 사용하여 엔지니어링 혈관 이식의 크기 조정

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 분해 비 계 기반 조직 설계 혈관 개발의 비파괴 모니터링

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

Tissue-Engineered Graft for Circumferential Esophageal Reconstruction in Rats

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant technique with nutritional support. Recently, there have been many attempts at esophageal tissue engineering, but the success rate has been limited due to difficulty in early epithelization in the special environment of peristalsis. Here, we developed an artificial esophagus that can improve the regeneration of the esophageal mucosa and muscle layers through a two-layered tubular scaffold, a mesenchymal stem cell-based bioreactor system, and a bypass feeding technique with modified gastrostomy. The scaffold is made of polyurethane (PU) nanofibers in a cylindrical shape with a three-dimensional (3D) printed polycaprolactone strand wrapped around the outer wall. Prior to transplantation, human-derived mesenchymal stem cells were seeded into the lumen of the scaffold, and bioreactor cultivation was performed to enhance cellular reactivity. We improved the graft survival rate by applying surgical anastomosis and covering the implanted prosthesis with a thyroid gland flap, followed by temporary nonoral gastrostomy feeding. These grafts were able to recapitulate the findings of initial epithelialization and muscle regeneration around the implanted sites, as demonstrated by histological analysis. In addition, increased elastin fibers and neovascularization were observed in the periphery of the graft. Therefore, this model presents a potential new technique for circumferential esophageal reconstruction.

Esophageal reconstruction is a challenging procedure, and development of a tissue-engineered esophagus that enables regeneration of esophageal mucosa and muscle and that can be implanted as an artificial graft is necessary. Here, we present our protocol to generate an artificial esophagus, including scaffold manufacturing, bioreactor cultivation, and various surgical techniques.

쥐의 원주 식도 재건을 위한 조직 공학 이식편

The use of biocompatible materials for circumferential esophageal reconstruction is a technically challenging task in rats and requires an optimal implant ...

Self-Assembly of Gamma-Modified Peptide Nucleic Acids into Complex Nanostructures in Organic Solvent Mixtures

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated media. In this article, we describe detailed protocols that enable the construction of nanofiber architectures in organic solvent mixtures through the self-assembly of uniquely addressable, single-stranded, gamma-modified peptide nucleic acid (&#947;PNA) tiles. Each single-stranded tile (SST) is a 12-base &#947;PNA oligomer composed of two concatenated modular domains of 6 bases each. Each domain can bind to a mutually complimentary domain present on neighboring strands using programmed complementarity to form nanofibers that can grow to microns in length. The SST motif is made of 9 total oligomers to enable the formation of 3-helix nanofibers. In contrast with analogous DNA nanostructures, which form diameter-monodisperse structures, these &#947;PNA systems form nanofibers that bundle along their widths during self-assembly in organic solvent mixtures. Self-assembly protocols described here therefore also include a conventional surfactant, Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), to reduce bundling effects.

This article provides protocols for the design and self-assembly of nanostructures from gamma-modified peptide nucleic acid oligomers in organic solvent mixtures.

감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로

Current strategies in DNA and RNA nanotechnology enable the self-assembly of a variety of nucleic acid nanostructures in aqueous or substantially hydrated ...