저자는 박사 켄트 실리,이 기능의 사용에 대한 사우스 플로리다 대학의 약 발견과 혁신을위한 센터 (CDDI) 프로테오믹스 핵심 시설의 이사 감사합니다. 이 작품은 BHAS에 NIH / NIDCD 보조금 R01 DC004295에 의해 지원되었다

윤리 정책 건강의 국립 연구소의 지침에 따라 명시된 마우스 조직을 사용하여 실험은 사우스 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 3931R, 3482R)에 의해 승인되었다. 1. 단백질 추출 <ol><li> C. ° -80 16 30 일 이전 (P30) CBA / J 마우스 및 저장소에서 인공 감각 상피를 분리 </li><li> 실험 당일, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 500 μL와 조직을 세척 하였다. 1,000 XG에 3 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 총 3 회 세척을 반복합니다. </li><li> 에 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 120 mM의 NaCl을, 50 mM의 불화 나트륨, 5 mM의 EDTA, 500 ㎍ / ㎖의 AEBSF, 10 ㎍ / ㎖의 류 펩틴, 100 μg을 / 포함 용해 버퍼 100 μL에서 얼음에 30 초 동안 초음파 처리 조직 소닉 dismembrator (; 써모 피셔 모델 100)를 사용하여 펩 스타틴 ㎖, 2 ㎍ / ㎖의 아프로 티닌, 0.5 ㎍ / ㎖의 microcystin. 얼음 시원한 해물각 초음파 사이에 1 분. 배의 총 초음파 처리. </li><li> 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거합니다. 얼음에 30 초 동안 초음파 처리에 의해 용해 완충액 50 μL에 펠렛을 추출합니다. 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기. 60 분 동안 4 ° C에서 28,600 XG에 해물과 원심 분리기를 모두 결합합니다. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거하고 펠릿에 0.1 % ASB-14를 포함하는 20 ㎕의 용해 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 1 분, 4 ℃에서 60 분 동안 배양 </li><li> 60 분 동안 4 ° C에서 냉각 한 후, 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 가열한다. 10 분 동안 25 ° C에서 16,000 XG에서 원심 분리에 따릅니다. 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 5 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 현탁액을 원심 분리기와 소화에 뜨는을 유지합니다. </li></ol> 2. FASP를 사용하여 전체 해물 더블 트립 틱 단백질 소화 <ol><li> 30 μ 추가4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)를 포함하는 인공 단백질 추출물,의 (400μg의 ≤) L 나누어지는, 100 MM 트리스 - 염산, 직접 30K 스핀 필터의 pH 7.6와 0.1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)과 8의 200 μL와 혼합 트리스 - 염산에있는 M의 요소. 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석. </li><li> 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 요소 용액에 10 배 요오도 아세트 아미드 (IAA)의 10 μl를 추가합니다. 10 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 어두운 실온 (RT)에서 20 분 동안 스핀 필터를 배양한다. </li><li> 15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에서 농축에 8 M 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 50 mM의 중탄산 암모늄 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기 (ABC) 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다. </li><li> 1:100에서 트립신의 0.4 ㎍ / ㎕의 추가 (W / W) 효소에단백질 비율이 37 ℃에서 하룻밤 (O / N)를 배양 </li><li> 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 장치와 원심 분리기를 필터링하는 50 mM의 ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 % 포름산 (FA)로 산성화. </li><li> 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다. </li><li> 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후 </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가하여 다이제스트 번째부터 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 %에 FA로 산성화. </li><li> 샘플을 표준으로 BSA를 사용하여 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다. </li></ol> 3. FASP를 사용하여 전체 해물 엔도의 lysC 및 트립 틱 단백질 소화 <ol><li> 직접 30K 스핀 필터 4 % SDS, 100 MM 트리스 - 염산, pH를 7.6 및 0.1 M DTT를 포함하는 인공 단백질 추출물의 30 μL 나누어지는 (400μg의 ≤)를 추가하고 트리스 - 염산 8 M 요소의 200 μL와 혼합 . 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석. </li><li> 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 우레아 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 스핀 필터를 부화 후 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 8 M의 요소 졸 100 μl를 추가합니다15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 집중의 ution. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다. </li><li> 1:50 (W / W) 효소로 단백질의 비율로 엔도의 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다 </li><li> 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 %에 FA로 산성화. </li><li> 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다. </li><li> 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척에 트립신의 0.4 ㎍ / μl를 추가 한 후 1:100 효소 - 투 - 프로TEIN 비율과 37 ℃에서 O / N을 품다 </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가함으로써 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 % FA로 산성화. </li><li> 샘플은 표준으로 BSA를 가진 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다. </li></ol> 4. 스핀의 열을 사용하여 탈염 펩티드 <ol><li> 1 분 1,100 XG에서 아세토 니트릴 (ACN) 및 원심 분리기 500 μl를 추가하여 C 18 MacroSpin 열을 활성화합니다. 원심 분리 후 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 1 분 1,100 XG에서 0.1 % FA 원심 분리기 500 μL에 열을 평형. 흐름을 통해 폐기하고이 단계 1X를 반복합니다. </li><li> 펩티드의 500 μL를 추가 열을 소화1 분 1,100 XG에 D 원심 분리기. 샘플 부피는 500 μL보다 큰 경우,이 단계를 반복한다. </li><li> 1 분 1,100 XG에서 500 0.1 % FA ㎕의 원심 분리기와 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 1 분 1,100 XG에 열 및 원심 분리기 90:10 ACN - 투 - 물 비율을 250 μl를 추가합니다. 탈염 펩타이드를 포함하는 용출액을 수집하고 새로운 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 진공 원심 분리기의 탈염 펩타이드 샘플을 건조 완전히 샘플 건조시키는 마십시오. </li></ol> 5. 이온 교환 크로마토 그래피 <ol><li> 펩티드를 분리하는 200 X 2.1 mm, 5 μm의의 SCX 칼럼 (Polysulfoethyl A)에 소화 된 단백질 시료의 50 ~ 100 μg을 주입한다. </li><li> 250 μL / 분의 유속으로 50 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 솔벤트는 5 MM의 암모늄 포름산, 25 % 아세토 니트릴의 pH 3.0 및 75 %의 DDH 2 O입니다 용매 B는 500 MM의 암모늄 포름산, 산도입니다6.0 25 %의 ACN 75 %의 DDH 2 O. </li><li> 280 nm에서 펩티드 분수를 모니터링하고 일부 컬렉터를 사용하여 2 분 간격으로 분수를 수집합니다. </li><li> 염 제거를 지원하기 위해 5 % FA를 포함 DDH 2 O의 50 % 아세토 니트릴 500 μL에서 진공 농축기와에 resuspend 드라이 분수. </li><li> -80 ° C에서 Redry 분수 및 저장 나노 LC-MS/MS 분석을 위해 사용할 준비가 될 때까지. </li></ol> 6. 아세톤 강수량 이전 GELFrEE 분리에 인공 단백질 상층 액을 탈염해야합니다. 아세톤 침전 단백질을 탈염 및 농축 할 수있다. <ol><li> 인공 상층 액에 얼음처럼 차가운 아세톤의 세 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 와동 -20 ° CO / N. 부화 </li><li> 4 ° C에서 15 분 동안 15,000 XG에서 샘플 혼합물을 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다. </li><li> 4에서 5 분 동안 14,000 XG에서 냉장 아세톤 및 원심 분리기와 단백질 펠릿의 3 배를 세척° C. </li><li> 펠렛을 건조시킨 18 MΩ 물 112 μL에 용해. </li><li> 마이크로 비색 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 7. 달팽이 감각 상피의 GELFrEE 분별 <ol><li> 5 배 샘플 버퍼 30 μl를 추가 (0.25 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % (W / V) SDS, 50 % 글리세롤, 0.5 % (W / V) 브롬 페놀 블루) 18 MΩ 112 μL에 현탁 탈염 단백질 물. </li><li> 단백질 이황화 결합을 줄이기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 8 개월 DTT ㎕의 열을 추가합니다. 가열 한 후 실온으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 양극 저수지에 버퍼를 실행하는 8 ㎖, 수집 챔버를 샘플 버퍼를 실행 150 μL 및 음극 저수지에 버퍼를 실행 6 ㎖를 추가합니다. </li><li> 피펫을 사용하여 샘​​플 로딩 챔버로 유입 된 수있는 버퍼를 제거합니다. </li><li> 인공 단백질 혼합물의 하중 150 μL (≤ 1 ㎎)을, 샘플 로딩 챔버로 8 % TR을 사용3.5-150 kDa의의 질량 범위 카트리지 - 아세테이트이다. </li><li> 실행을 시작하는 하부 전극 주변 기기의 뚜껑. </li><li> 악기의 첫 번째 일시 정지시에 음극 저수지에 버퍼를 실행 2 ㎖를 추가하고 실행을 다시 시작합니다. </li><li> 기기의 각 일시 정지 구간에서 피펫을 사용하여 시료 채취 실에서 샘플을 수집하고 갓 표시된 마이크로 튜브에 추가합니다. 버퍼를 실행 150 μL로 수집 챔버의 2 배를 씻어 버린다. </li><li> 시료 채취 실에 신선한 실행 버퍼 150 μl를 추가하고 실행을 다시 시작합니다. 150 μL / 분획의 총 부피에서 2.6 시간의 기간 동안 단백질 분획을 수집한다. </li></ol> 8. GELFrEE 분수의 1 차원 젤 전기 1D 겔 전기 영동 전에 효소 소화와 MS 분석에 GELFrEE 분획으로부터 결과를 시각화 할 수있다. GELFrEE 단백질 분획 4-15% 트리스 - 염산 겔상에서 분리 될 수있다. </p&gt; <ol><li> (샘플 버퍼에 350 mM의 DTT) 샘플 희석 버퍼의 5 μl를 각 GELFrEE 분율의 5 μL 나누어지는 혼합. </li><li> 3 분 동안 95 ° C에서 샘플을 가열한다. </li><li> 실온으로 냉각 샘플. </li><li> 개인 겔 레인과 마지막되지 않는 차선의 분자량 표준의 부하 5 μL의 각 GELFrEE 분율의 부하 10 μL. </li><li> 염료 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 1.5 시간 동안 125 V에서 젤을 실행하거나. </li><li> 조심스럽게 젤을 제거하고 단백질 분리를 시각화하는 실버 스테인 플러스와 얼룩. </li></ol> 9. FASP 사용 GELFrEE 분획의 단백질 소화 변성 FASP 절차 GELFrEE 분획 세제 제거 및 분해하는 데 사용된다. <ol><li> 8 M 트리스 - 염산의 요소와 25 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 200 μL와 혼합, 직접 30K 필터 장치에 각각의 부분을 추가합니다. </li><li> 요소 용액 200 μL로 농축 물을 희석12 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 각 필터 유닛, 1 분 동안 소용돌이에 집중하는 요소 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가하고, 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다. </li><li> 15 분 동안 14,000 XG에 필터 유닛 및 원심 분리기에서 농축에 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다. </li><li> 필터 유닛에 1:50 (W / W) 효소에 단백질 비율로하여 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다 </li><li> 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 각 스핀 필터에서의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 trifluoroac으로 산성화ETIC 산 (TFA). </li><li> 8 M 요소의 40 μL와 스핀 필터를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다. </li><li> 스핀 필터는 50 mM의 ABC 용액 100 ㎕ 씩 3 배 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후 </li><li> 10 분 동안 14,000 XG에 50 mM의 ABC 솔루션 및 원심 분리기의 40 μl를 추가하여 각각의 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 용출한다. 이 단계의 1X를 반복합니다. </li><li> 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에 각 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 함유하는 여액을 전송하고 TFA로 산성화. </li><li> 진공 농축기에서 모두 소화 건조. </li></ol> 10. LC-MS/MS의 샘플 준비 <ol><li> 재구성 건조의 lysC 및 트립 틱 펩타이드는 0.1 % FA와 소용돌이 20 ㎕에 분수를 소화. </li><li> 10 20,000 XG에 원심 분리기 샘플분하고 새로운 샘플의 유리 병에 시료의 최고 95 %를 제거합니다. </li><li> 염 및 오염 물질을 제거하고 75 μm의 × 10cm의 C 18 컬럼 크로마토 그래피 분리를 수행하기 위해 100 μm의 X 25mm 샘플 트랩에 펩타이드 분획의 5 μl를 주입한다. </li><li> 200 NL / 분의 유속으로 100 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 용매는 95 % ddH2O 0.1 % FA를 함유 5 % 아세토 니트릴이다. 용매 B는 80 % ACN 0.1 % FA를 포함하는 20 % ddH2O입니다. </li><li> 각 MS는 고해상도 질량 분석기에 스캔 열 텐덤 질량 스펙트럼을 수집한다. LTQ Orbitrap 질량 분석기는이 실험에 사용 하였다. </li></ol> 11. 단백질 확인 <ol><li> 포워드 포함 UniProt의 마우스 데이터베이스를 사용하여 단백질을 확인하고 단백질 서열 및 일반 오염 물질을 역. 마스코트의 검색 엔진 MaxQuant 소프트웨어는 단백질 데이터베이스를 검색하는 데 사용됩니다. </li><li> 사용할 수있는 검색 매개 변수를 포함, 고정 modific시스테인의 carbamidomethyl의 ATION는 메티오닌 산화 변수 수정, 단백질의 N-말단 아세틸 화, 2의 최대 분열을 놓쳤다. 식별을 위해 고려해야 할 최소 펩타이드 길이는 6 아미노산이다. ± 13 ppm으로 1.2 다 (질량 오류가 질량 분석기가 사용되는에 따라 달라집니다)의 조각 대량 관용의 펩티드 질량 농도의 오류를 입력합니다. </li><li> MaxQuant 소프트웨어에서, 펩타이드 및 단백질 식별을위한 1 %의 거짓 발견 속도 (FDR)를 사용합니다. 단백질 식별은 유사한 펩티드 %의 단백질 서열에 따르면, 펩티드 서열의 개수와 함께 나열된다. </li></ol>

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Otolaryngol. 8, 305-328 (2007).</li><li>Horvatovich, P., Hoekman, B., Govorukhina, N., Bischoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidimensional+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+in+analysing+complex+proteomics+samples.">Multidimensional chromatography coupled to mass spectrometry in analysing complex proteomics samples.</a> J. Sep. Sci. 33, 1421-1437 (2010).</li><li>Ye, M. L., Jiang, X. G., Feng, S., Tian, R. J., Zou, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+chromatographic+techniques+and+methods+in+shotgun+proteome+analysis.">Advances in chromatographic techniques and methods in shotgun proteome analysis.</a> Trends Anal. Chem. 26, 80-84 (2007).</li><li>Wu, C. C., MacCoss, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shotgun+proteomics:+Tools+for+the+analysis+of+complex+biological+systems.">Shotgun proteomics: Tools for the analysis of complex biological systems.</a> Curr. Opin. Mol. Ther. 4, 242-250 (2002).</li><li>Bora, A., Anderson, C., Bachani, M., Nath, A., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Two-Dimensional+Separation+of+Intact+Proteins+for+Bottom-Up+Tandem+Mass+Spectrometry+of+the+Human+CSF+Proteome.">Robust Two-Dimensional Separation of Intact Proteins for Bottom-Up Tandem Mass Spectrometry of the Human CSF Proteome.</a> J. Proteome Res. 11, 3143-3149 (2012).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry:+Bottom-up+or+top-down.">Mass spectrometry: Bottom-up or top-down.</a> Science. 314, 65-66 (2006).</li><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422, 198-207 (2003).</li><li>Reid, G. E., McLuckey, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top+down'+protein+characterization+via+tandem+mass+spectrometry.">Top down' protein characterization via tandem mass spectrometry.</a> J. Mass. Spectrom. 37, 663-675 (2002).</li><li>Han, X., Aslanian, A., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+for+proteomics.">Mass spectrometry for proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 483-490 (2008).</li><li>Thalmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inner+ear+proteomics:+A+fad+or+hear+to+stay.">Inner ear proteomics: A fad or hear to stay.</a> Brain Res. 1091, 103-112 (2006).</li><li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney.">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, (2007).</li><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis.">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li><li>Wisniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+ultrafiltration+units+for+proteomic+and+N-glycoproteomic+analysis+by+the+filter-aided+sample+preparation+method.">Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method.</a> Anal. Biochem. 410, 307-309 (2011).</li><li>Darville, L. N., Sokolowski, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+Proteomic+Analysis+of+Mouse+Cochlear+Sensory+Epithelium+by+Mass+Spectrometry.">In-depth Proteomic Analysis of Mouse Cochlear Sensory Epithelium by Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 12 (8), 3620-3630 (2013).</li><li>Vizcaino, J. A., Cote, R. G., Csordas, A., Dianes, J. A., Fabregat, A., Foster, J. M., Griss, J., Alpi, E., Birim, M., Contell, J., O'Kelly, G., Schoenegger, A., Ovelleiro, D., Perez-Riverol, Y., Reisinger, F., Rios, D., Wang, R., Hermjakob, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PRoteomics+IDEntifications+(PRIDE)+database+and+associated+tools:+status+in+2013.">The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013.</a> Nucleic Acids Res. 41, 1063-1069 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

<html> 인공 감각 상피 세포에서 단백질 식별을 극대화하는 핵심 단계는 다음과 같습니다 소화 여러 endoproteinases의 1) 사용, 여러 분리 기술의 2) 사용 및 고해상도 질량 분석기의 3) 이용. 여러 효소의 적용은 펩티드의 수를 증가시키고, 단백질 서열 커버리지를 향상 따라서 인공 조직으로부터 확인 된 단백질의 수를 향상시킬 수있다. 트립신, 가장 일반적으로 사용되는 단백질 분해 효소는 MS의 이온?...

단백질 체학은 단백질 발현, 기능, 수정 및 상호 작용 1을 분석하여 복잡한 생물학적 시스템의 연구이다. 여러 가지 방법 항체 마이크로 어레이 2, 이차원 전기 영동 3-5 및 DIGE 6 등의 내이 (内耳)의 프로테옴 분석에 이용되어왔다. 그러나, 단백질의 단지 제한된 수의 확인 된 및 내이 11,12에서 식별 10,000 이상의 유전자 발현 서열 태그 (EST를)에 비해 2,7-10을 특징으로, MS는 가장 일반적으로 사용되는 기술이다 포괄적 단백질 특성 분석을위한 단백질 체학에서. 같은 달팽이관과 같은 복잡한 단백질체 시료의 분석, 도전하실 수 있습니다. 그러나, MS와 여러 분리 기술의 조합으로 인해 증가 된 동적 농도 범위 및 최대 용량 (13)에, 펩티드 및 단백질의 더 큰 개수의 식별을 가능하게한다. 다차원 chromatograPHY는 상이한 흡착 메카니즘의 사용을 허용하여 매우 복잡한 단백질 혼합물을 감소시킨다. 두 일반적으로 사용되는 MS 프로테옴 분석 방법, 산탄 총과 상향식 (bottom-up) 단백질 체학이 있습니다. 샷건 프로테오믹스에서 그대로 단백질의 혼합물 효소 소화 강한 양이온 교환 크로마토 그래피 역상 액체 크로마토 그래피 (RPLC) 14, 15 다음에 (SCX)와 다차원 크로마토 그래피를 이용하여 분리된다. 분리 된 펩티드는 탠덤 MS의 대상 및 데이터베이스 (15)를 찾고 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 단백질 수천 번의 분석으로 식별 될 수 있고, 기술은 막 단백질에 더 적합하다는 것이다. 상향식 접근법에서, 단백질 혼합물은 보통 하나 또는 이차원 전기 영동으로 분리하고, 각각의 단백질 밴드 또는 스폿은 대개 여러 펩티드의 결과, 트립신과 같은 효소로 잘라 소화. 그러나, 또 다른 최근의LY는 상향식 (bottom-up) 단백질 체학에 사용, 전기 접근 방식을 개발, GELFrEE입니다. 이 기술은 액상 단백질 샘플을 fractionates 전에 분석하기가 덜 복잡합니다. 이 기술은, 재현성 높은 단백질 복구를 제공하고, 복합 단백질 시료 (16)에서 높은 풍부한 단백질의 분포를 감소시킨다. 분리 된 단백질로부터 생성 된 펩티드, 데이터베이스는 17-19을 검색하기위한 태그 서열을 생성하기 위해, 펩티드 질량 지문 또는 탠덤 MS (MS / MS)를 사용하여, MS에 의해 분석된다. 상향식 접근법을 사용의 주요 이점 중 일부는 고해상도 분리 및 단백질의 광범위한 커버리지를 획득 할 수있는 능력이다. 상향식 (bottom-up) 단백질 체학은 단백질 체학 (20)에서 가장 널리 사용되는 기술이다, 따라서, 여러 생물 정보학 도구를 사용할 수 있습니다. 또한, 단백질은 소화 전에 복잡한 혼합물에서 분리 될 수 있으므로, 식별 큰 기회가있다. 주요 과제 중 하나프로테오믹스 분석 내이 (内耳)를 사용하여 작은 크기, 제한된 접근성, 세포 유형의 다양성 (21)이다. 또, 이온 채널, 전송기 및 수용체로서의 기능을 구별 키 단백질은, (22)을 분리하기 어려울 수 멤브레인 단백질이다. 따라서, 필터 원조 샘플 준비 (FASP)은 단백질 추출을 위해 제한됩니다 조직의 단백체 분석에 유리하고 막 (23)을 용해하기 위해 세제를 필요로하는. 이러한 필터링은 막과 용해성 단백질의 MS 분석 및 저 분자량 오염물 23,24로부터 펩티드를 분리 할 수있는 능력을 허용한다. 본 프로토콜은 합하고 수용성 및 멤브레인 단백질 모두를 분석하여 인공 와우 감각 상피에서 단백질 ID의 수를 최대화하기 위해 수정되고 일반적으로 사용 프로테오믹스 방법을 설명한다. 우리는 FASP 멀티 소화와 샷건 프로테오믹스를 사용하여 설명합니다이온, 이온 교환 크로마토 그래피, 고해상 MS 및 데이터 분석. 또, GELFrEE, FASP 멀티 소화 고해상도 MS, 데이터 분석 상향식 프로테오믹스 설명한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="749">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:264px;">8% Tris-acetate cartridge&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Protein Discovery</td>
			<td style="width:133px;">42103</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetonitrile</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>015-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AEBSF</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>101500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium formate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC16861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aprotinin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>616370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ASB-14&#160;</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>182750-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">C18 column&#160;</td>
			<td>New Objective</td>
			<td>A25112</td>
			<td>75 &#956;m &#215; 10 cm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DC Protein Assay</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>500-0116</td>
			<td>Microplate Assay Protocol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Endoproteinase Lys-C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FASP Protein Digestion Kit</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>44250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Formic acid&#160;</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>94318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GELFrEE Fractionation System</td>
			<td>Protein Discovery</td>
			<td>42001</td>
			<td>GELFrEE 8100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Leupeptin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>108975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MacroSpin Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>SMM SS18V</td>
			<td>Silica C18</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcystin</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>475815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pepstatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polysulfoethyl A Column</td>
			<td>The Nest Group</td>
			<td>202SE0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonic Dismembrator&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-338-53</td>
			<td>Model 100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6567</td>
			<td>Proteomics Grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bottom-up and shotgun proteomics to identify a comprehensive cochlear proteome

단백질 체학은 복잡한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 방법입니다. 인공 감각 상피 세포는 말초 및 중추 신경 시스템에 의해 처리 전기 화학 에너지로 소리의 기계적 에너지를 형질 도입 수용체가 포함되어 있습니다. 여러 프로테오믹스 기술은 두 가지 차원의 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE), 항체 마이크로 어레이 및 질량 분석 (MS)와 같은 인공 내이 (内耳)를 연구하기 위해 개발되었다. MS는 단백질 체학에서 가장 포괄적이고 다양한 도구와 분리 방법과 함께 생체 시료에 대한 심층적 인 프로테옴을 제공 할 수 있습니다. MS와 결합 분리 방법은, 단백질 시료를 농축 저분자 및 소수성 단백질을 검출하고 프로테옴 동적 범위를 감소시킴으로써 낮은 풍부한 단백질을 식별 할 능력이있다. 다른 소화 전략은 펩티드 및 단백질 바로 전체 용해질 또는 분획 된 단백질 용 해물을 적용 할 수있다시퀀스 범위. 강한 양이온 교환 (SCX), 역상 (RP) 및 겔 용출 액체 분획 포착 전기 영동 (GELFrEE) 등 다른 분리 기술의 이용은 단백질 식별 전에 MS 분석으로 샘플의 복잡성을 줄이기 위해 적용될 수있다.

인공 감각 상피의 가장 포괄적 인 프로테옴를 얻으려면 빠른 조직 절개 전에 단백질 추출 및 샘플 준비에 필요합니다. 두 프로테옴 기법, 산탄 및 상향식 프로테오믹스를 사용할 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이 샷건 프로테오믹스를위한 샘플을 준비하기 위해 FASP 분해 절차가 사용되었다. FASP 방법은 단백질의 농도, 세제의 제거, 여러 효소를 사용하여 단백질의 소화를 할 수 있습니...

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Bottom-up and Shotgun Proteomics to Identify a Comprehensive Cochlear Proteome

막 단백질을 분리하고 식별하기 어렵 기 때문에 인공 감각 상피 세포의 프로테옴 분석 인해 작은 크기와에 도전하실 수 있습니다. 막과 용해성 단백질 모두 고해상도 질량 분석법과 함께 체류 분취 방법 및 분리 기술을 조합하여 식별 될 수있다.

종합 달팽이 프로테옴을 확인하는 상향식 (bottom-up)과 샷건 단백질 체학 (Proteomics)

Proteomics is a commonly used approach that can provide insights into complex biological systems. The cochlear sensory epithelium contains receptors that ...

bottom-up-shotgun-proteomics-to-identify-comprehensive-cochlear

Research

JoVE Journal

Biology

18.6K 조회수.  University of South Florida.  막 단백질을 분리하고 식별하기 어렵 기 때문에 인공 감각 상피 세포의 프로테옴 분석 인해 작은 크기와에 도전하실 수 있습니다. 막과 용해성 단백질 모두 고해상도 질량 분석법과 함께 체류 분취 방법 및 분리 기술을 조합하여 식별 될 수있다. 

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

태반에서 조혈 줄기 세포의 분리 및 분석

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

연구

생물학

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys loop, the glutamate-gated and the P2X receptor channels2. In each case binding of transmitter leads to the opening of a pore through which ions flow down their electrochemical gradients. Many ligand-gated channels are also permeable to calcium ions3, 4, which have downstream signaling roles5 (e.g. gene regulation) that may exceed the duration of channel opening. Thus ligand-gated channels can signal over broad time scales ranging from a few milliseconds to days. Given these important roles it is necessary to understand how ligand-gated ion channels themselves are regulated by proteins, and how these proteins may tune signaling. Recent studies suggest that many, if not all, channels may be part of protein signaling complexes6. In this article we explain how to identify the proteins that bind to the C-terminal aspects of the P2X2 receptor cytosolic domain.
P2X receptors are ATP-gated cation channels and consist of seven subunits (P2X1-P2X7). P2X receptors are widely expressed in the brain, where they mediate excitatory synaptic transmission and presynaptic facilitation of neurotransmitter release7. P2X receptors are found in excitable and non-excitable cells and mediate key roles in neuronal signaling, inflammation and cardiovascular function8. P2X2 receptors are abundant in the nervous system9 and are the focus of this study. Each P2X subunit is thought to possess two membrane spanning segments (TM1 &amp; TM2) separated by an extracellular region7 and intracellular N and C termini (Fig 1a)7. P2X subunits10 (P2X1-P2X7) show 30-50% sequence homology at the amino acid level11. P2X receptors contain only three subunits, which is the simplest stoichiometry among ionotropic receptors. The P2X2 C-terminus consists of 120 amino acids (Fig 1b) and contains several protein docking consensus sites, supporting the hypothesis that P2X2 receptor may be part of signaling complexes. However, although several functions have been attributed to the C-terminus of P2X2 receptors9 no study has described the molecular partners that couple to the intracellular side of this protein via the full length C-terminus. In this methods paper we describe a proteomic approach to identify the proteins which interact with the full length C-terminus of P2X2 receptors.

We describe a simple protocol to identify brain proteins that bind to the full length C terminus of ATP-gated P2X2 receptors. The extension and systematic application of this approach to all P2X receptors is expected to lead to a better understanding of P2X receptor signaling.

P2X2 리간드 - 게이 티드 양이온 채널과 상호 작용하는 단백질을 확인하는 Proteomics

Ligand-gated ion channels underlie synaptic communication in the nervous system1. In mammals there are three families of ligand-gated channels: the cys ...

PAR-CliP - A Method to Identify Transcriptome-wide the Binding Sites of RNA Binding Proteins

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18

RNA transcripts are subject to extensive posttranscriptional regulation that is mediated by a multitude of trans-acting RNA-binding proteins (RBPs). Here we present a generalizable method to identify precisely and on a transcriptome-wide scale the RNA binding sites of RBPs.

PAR - 클립 - RNA 단백질의 바인딩 Transcriptome 전체 바인딩 사이트를 식별하는 방법

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.

펩타이드 면역 친 화성 농축을 사용하여 단백질의 양을 정함은 질량 분광법과 함께

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in ...

Orthogonal Protein Purification Facilitated by a Small Bispecific Affinity Tag

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a demand for general methods that do not require target protein specific optimization1 . To achieve this, purification tags that genetically can be fused to the gene of interest are commonly used2 . The most widely used affinity handle is the hexa-histidine tag, which is suitable for purification under both native and denaturing conditions3 . The metabolic burden for producing the tag is low, but it does not provide as high specificity as competing affinity chromatography based strategies1,2.
Here, a bispecific purification tag with two different binding sites on a 46 amino acid, small protein domain has been developed. The albumin-binding domain is derived from Streptococcal protein G and has a strong inherent affinity to human serum albumin (HSA). Eleven surface-exposed amino acids, not involved in albumin-binding4 , were genetically randomized to produce a combinatorial library. The protein library with the novel randomly arranged binding surface (Figure 1) was expressed on phage particles to facilitate selection of binders by phage display technology. Through several rounds of biopanning against a dimeric Z-domain derived from Staphylococcal protein A5, a small, bispecific molecule with affinity for both HSA and the novel target was identified6 .
The novel protein domain, referred to as ABDz1, was evaluated as a purification tag for a selection of target proteins with different molecular weight, solubility and isoelectric point. Three target proteins were expressed in Escherishia coli with the novel tag fused to their N-termini and thereafter affinity purified. Initial purification on either a column with immobilized HSA or Z-domain resulted in relatively pure products. Two-step affinity purification with the bispecific tag resulted in substantial improvement of protein purity. Chromatographic media with the Z-domain immobilized, for example MabSelect SuRe, are readily available for purification of antibodies and HSA can easily be chemically coupled to media to provide the second matrix.
This method is especially advantageous when there is a high demand on purity of the recovered target protein. The bifunctionality of the tag allows two different chromatographic steps to be used while the metabolic burden on the expression host is limited due to the small size of the tag. It provides a competitive alternative to so called combinatorial tagging where multiple tags are used in combination1,7.

A novel and highly efficient two-step affinity chromatography protocol has been developed and is described in detail. The method is based on a small purification tag with two inherent affinities and is applicable to a wide range of target proteins with different properties.

작은 Bispecific 선호도 태그에 의해 용이 직교 단백질 정제

Due to the high costs associated with purification of recombinant proteins the protocols need to be rationalized. For high-throughput efforts there is a ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

에 Postembryonic Phenotypes을 식별하기 위해 RNAi 심사 C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

Many organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated that the majority of the transcriptome is localized to a nonrandom position in cells and embryos. One approach to identify localized mRNAs is to biochemically purify a cellular structure of interest and to identify all associated transcripts. Using recently developed high-throughput sequencing technologies it is now straightforward to identify all RNAs associated with a subcellular structure. To facilitate transcript identification it is necessary to work with an organism with a fully sequenced genome. One attractive system for the biochemical purification of subcellular structures are egg extracts produced from the frog Xenopus laevis. However, X. laevis currently does not have a fully sequenced genome, which hampers transcript identification. In this article we describe a method to produce egg extracts from a related frog, X. tropicalis, that has a fully sequenced genome. We provide details for microtubule polymerization, purification and transcript isolation. While this article describes a specific method for identification of microtubule-associated transcripts, we believe that it will be easily applied to other subcellular structures and will provide a powerful method for identification of localized RNAs.

Production of Xenopus tropicalis Egg Extracts to Identify Microtubule-associated RNAs

We describe the collection of unfertilized Xenopus tropicalis eggs and production of a meiosis II-arrested egg extract. This egg extract can be used to purify microtubules and microtubule-associated RNAs.

생산<em&gt; Xenopus의 tropicalis</em&gt; 달걀은 미세 소관 관련 RNA를 식별하기 위해 추출

Many  organisms localize mRNAs to specific subcellular destinations to spatially and  temporally control gene expression. Recent studies have demonstrated ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

푸리에에 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 이미징 매트릭스 디 트라 놀은 이온 사이클로트론 공명 질량 분석기를 변환

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.