이 작품은에 의해 부분적으로 지원 (1) 국방부의 유방암 연구 프로그램 (미국 육군 의학 연구 수집 활동) #이 LAL에 W81XVVH-10-1-0781가 및 VE 상을, (2) 수잔 G. 코멘 재단 보조금 IR122224446는 LAL 및 VE합니다. 병리학 지원 및 조직의 매출 동시는 친절 이노 바 페어팩스 병리학 교실 박사 하산 Nayer 박사 Geetha A. 메네 제스, 박사 찰스 Bechert에 의해 제공되었다. 환자 동의 및 샘플 조달은 전문적 이노 바 페어팩스 병원 임상 연구 코디네이터 홀리 Gallimore, 헤더 Huryk, 그리고 에밀 카마르에 의해 인도되었다.

인간의 유방 조직은 국방부, 조지 메이슨 대학 (George Mason University), 그리고 이노 바 헬스 시스템 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인 된 프로토콜에 따라, 동의서로, 연구 대상으로 환자로부터 수집되었다. 1. 성장 인자와 항생제와 영양 리치 미디어를 준비 <ol><li> 인슐린의 원액, 표피 성장 인자 (EGF), 황산 스트렙토 마이신 및 젠타 마이신 설페이트를 준비한다. <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 멸균 여과 물에서 인슐린을 재생성. 멸균 10 ㎖의 일회용 주사기에 1 시약 등급의 물을 기음은 10 ml의. 주사기에 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰 필터를 연결합니다. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 멸균 여과 물을 분배. </li><li> 인슐린의 100 mg을 유리 병에 무균 여과 물 10ml를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 얼음에 인슐린 병을 유지합니다. 인슐린 스톡 SOLU 450 μl를 분배-20 ° C에서 라벨, 멸균의 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 기. 인슐린 원액 바이알에 만기일까지 안정하다. </li><li> 표피 성장 인자 (EGF)의 주식 솔루션을 준비 : 500 μg의 EGF (주 1 ㎍ / μL)에 500 μL를 멸균 물을 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 얼음에 EGF의 병을 유지합니다. <ol><li> EGF의 작업 원액을 준비 : 900 μL 영양 배지 (일 주식 / μL 0.1 μg의 예정)에 주식 EGF 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. -80 ° C에서 EGF 근무하는 표시, 멸균 마이크로 원심 튜브에 솔루션 및 저장의 50 μl를 분배. 참고 : EGF 원액 (1 ㎍ / μL)는 -80 ° C에서 1 년 동안 안정적이다; 원액 (0.1 ㎍ / μL)를 작업하는 -80 ° C에서 2 개월 동안 안정하다. </li></ol></li><li> 분석 저울에 스트렙토 마이신 황산염 40 mg의 무게가 나간다. 스트렙토 마이신 황산염 INT 배치OA 멸균 15 ML 원뿔 튜브. 영양 배지 4 ML을 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 이 솔루션은 약간 분홍색이어야한다. 4 ° C에서 보관은 빛으로부터 보호. 스트렙토 마이신 설페이트 용액을 7 일간 안정하다. </li><li> 분석 저울에 겐타 마이신 황산염 20 mg의 무게. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 황산 젠타 마이신을 놓습니다. 영양 배지 2 ㎖를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 이 솔루션은 노란색이어야한다. 4 ° C에서 보관은 빛으로부터 보호. 황산 젠타 마이신 용액을 7 일간 안정하다. </li></ol></li><li> (20 (. 100 ㎍ / ml의 최종 진한), (. 10 ㎍ / ml의 최종 진한), (. 10 NG / ml의 최종 진한) 스트렙토 마이신 황산 인슐린을 인간 재조합 EGF와 보충 영양 배지의 두 개의 200 ml의 배치를 준비하고 겐타 마이신 황산염 ㎍ / ml의 최종 농.). <ol><li> 0.2 μm의 폴리 에테르 설폰 필터 플라스크가 장착 된 진공 필터 플라스크에 250 ml의 수신 병에 200ml의 영양 배지를 추가합니다. 추가 20# 181; L 근무하는 EGF, 200 μL 스톡 인슐린, 2 ml의 주식 스트렙토 마이신 황산염, 및 영양 배지의 200 ml의 400 μL 재고 겐타 마이신 황산염. 진공 필터 플라스크를 연결합니다. 매체를 필터링합니다. 필터를 취소하고 &quot;영양이 풍부한 매체&quot;로 플라스크 레이블. 최대 14 일 동안 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 조직 수집 및 매출 동시 <ol><li> 운영 제품군에서, 유방 조직을 조달 한 후 멸균 기술을 유지한다. 살균 트레이에 유방 조직을 배치하고 멸균 플라스틱 포장 트레이 커버. <ol><li> 당신의 기관이 필요에 따라 방사선 / 병리학에 해당 트레이에있는 조직을 운반. 트레이를 열지 마십시오. 전송 시간은 기관 내에서 다릅니다. 조직은 최대 45 분 후 절제에 대한 RT에서이 덮여 트레​​이에 실행 가능한 남아있을 수 있습니다. 그러나, 영양이 풍부한 매체로 조직의 신속한 처리 이후 organoid 문화에 대한 최적의 조건을 제공합니다. </li></ol></li><li> 총 조직 절개는 유방 조직 내에서 DCIS의 영역을 식별하기 : 조직 불임을 유지하기 위해 조직의 박리시 멸균 장갑, 블레이드, 메스, 조직 마킹 염료, 식초를 사용합니다. <ol><li> 70 % 에탄올 1 % 표백제와 작업 영역을 청소합니다. 멸균 장갑을 열고 작업 표면에 장갑 래퍼를 배치합니다. 장갑 래퍼 얼굴 위로의 멸균 내부를 놓습니다. 멸균 장갑을 착용 할 것. <ol><li> 70 % 에탄올로 시료 용기의 표면을 청소. 조직 표본 용기의 플라스틱 포장을 제거하고 장갑 래퍼에 시편을 배치합니다. </li></ol></li><li> 조직 표시 염료로 두면 스쳐 면봉을 찍어. 조직 표면에 걸쳐 면봉 압연하여 조직의 표면에 염료를 적용. 참고 : 각 병리 부서는 표준화 된 염료 색상 / 조직 방향 프로토콜을 가지고있다. 조직은 환자에서의 위치와 관련하여 조직의 방향을 염료로 표시됩니다. 염료 도말되거나조직에 그렸다. 조직을 통해 염료를 부어하지 마십시오. 염료를 붓는 염료 따라서 절제의 방향을 혼란 조직 틈새로 / 실행 똑 될 수 있습니다. 조직 배향 외과에 해부학과 병리학) 조직 표본을 설명하고, b) 종양 관련 절제면의 위치를​​ 결정을 제공한다. </li><li> 멸균 거즈 패드에 증류 식초 (5 % 아세트산)을 붓는다. 식초를 적신 거즈로 염색 된 조직을 오 점. 거즈를 폐기하십시오. 식초는 염료 마킹 조직을 고정하는 데 사용됩니다. </li><li> 약 5 mm 두께의 수직 조각으로 유방 조직을 잘라. 조직 (그림 2)을 통해 모든 방법을 절단하지 마십시오. / 관찰 석회화의 영역에 대한 조직을 촉진하다. 자신의 특성 회사가 DCIS 병변을 확인, 붉은에 둘러싸인 모습 창백한 (때문에 칼슘의 spicules에) 껄끄 러운 느낌을 고무 테두리. NOTE : 일부 경우에, 여드름 (여드름 같은) 영역 일 수있다큰 직경 DCIS 병변에서 괴사 물질을 나타내는 흰색 점으로 볼. </li><li> 유방 조직 주변의 작은 금액을 포함, DCIS / 석회화 유방 조직의 영역을 잘라. 단계 1에서 제조 한 영양이 풍부한 배지 20-30 ml를 함유하는 멸균 50 ㎖ 튜브에 유방 조직을 놓는다. <ol><li> 조심스럽게 튜브를 수회 반전시켜 조직 및 매체를 섞는다. 매체를 취소하고 새로운 배지를 추가합니다. 단열 용기 내로 조직 및 배지를 함유하는 튜브를 삽입하고 조직 배양 실험실로 수송 조직. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 조직 문화 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서 작업, 조직 및 멸균 페트리 접시에 영양 배지의 작은 금액을 붓는다. 멸균 메스가 절단 및 섬유 조직을 폐기 사용. 조각 (organoids)로 유방 조직 약 3mm 2 (그림 1C-D)를 잘라. 조직을 절단하려고 있도록 각 기관OID 주변 기질과 적어도 하나의 뚜렷한 덕트 세그먼트가 포함되어 있습니다. </li><li> 조직 배양 플라스크의 뚜껑을 엽니 다. 멸균 핀셋이나 집게를 사용하여 플라스크에 organoids를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다. 페트리 접시를 폐기하십시오. </li><li> 조직 배양 플라스크에 11 ㎖의 무 혈청 배지 영양이 풍부한 (단계 1에서 제조)를 첨가. 플라스크를 닫고 organoids 중간 균등 플라스크 표면 (그림 1E-F)에 분산되도록 플라스크 소용돌이 친다. </li><li> 2 일 동안 가습 5.0 %의 CO 2 분위기하에 37 ° C에서 플라스크를 인큐베이션. 이 시간 동안 플라스크를 이동하지 마십시오. </li><li> 2 일 후 배양에서 잠재적 인 세균 / 곰팡이 오염을 확인하기 위해 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 플라스크의 갑작스런 날카로운 움직임, 또는 소용돌이를 피하십시오. 거꾸로 현미경 무대에서 플라스크를 놓습니다. <ol><li> 박테리아, 효모, 및 / 또는 곰팡이에 대한 매체를 관찰합니다. 어떠한 오염이 관찰되지 않는 경우, 추가 동안 인큐베이터로 플라스크를 반환itional 일. 오염이 언급되는 경우, 적당한 용기에 플라스크 내용물을 폐기. </li></ol></li><li> 3 일 후 배양에서 신선한 매체와 조정 배지를 교체합니다. <ol><li> 20 ~ 30 분 동안 37 ° C에서 멸균 튜브에 배지 11 ml에 놓습니다. 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크를 제거합니다. organoids을 방해하지 않고, 제거하고 멸균 혈청 피펫을 사용하여 플라스크에 매체를 폐기합니다. </li><li> 새로운 멸균 혈청 피펫을 사용하여 미리 예열 신선한 배지 11 ml에 추가합니다. 아주 조심스럽게 플라스크의 표면을 가로 질러 매체를 배포하는 플라스크를 회전. </li><li> 가습 5.0 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li></ol></li></ol> 설립 Organoid / 상피 세포 콜로니 4. 유지 보수 <ol><li> 매 2 주마다 새로운 배지를 준비하고 조직 배양 플라스크에 일주일에 3 번 미디어를 교체합니다. <ol><li> 37 멸균 용기에 배지 11 ml에 배치20 ~ 30 분 동안 C를 °. 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 멸균 혈청 피펫을 사용하여 제거하고 organoids을 방해하지 않도록주의, 플라스크에서 조정 배지를 폐기합니다. </li><li> 새로운 멸균 혈청 피펫을 사용하여 미리 예열 신선한 배지 11 ml에 추가합니다. 아주 조심스럽게 플라스크의 표면을 가로 질러 매체를 배포하는 플라스크를 회전. 가습 5.0 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li></ol></li><li> 10 후 - 문화에서 14 일, 부착하지 않은 문화 플라스크에서 조직의 조각을 제거합니다. <ol><li> 이종 이식 이식 주기적으로 수확 세포 및 / 또는 새로운 배양 플라스크에 전파 플라스크에서 organoids, 또는 표현형 및 / 또는 분자 분석. </li><li> 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크를 제거합니다. 70 % 에탄올로 플라스크 스프레이. 70 % 에탄올을 분무 된 깨끗한 종이 타월로 플라스크에 여분의 에탄올을 닦아. </li><li> Organoid 전파 : &lt;OL&gt; <li> 플라스크의 뚜껑을 열고 생물 안전 캐비닛의 뚜껑면이 위로를 놓습니다. 현미경 시각화에서 organoid (들)을 수확 할을 찾습니다. 픽업하기 위해 organoid을 멸균 핀셋이나 집게를 사용합니다. </li><li> 새로운 문화 플라스크에 organoid을 전파하기 위해, 새로운 플라스크에 organoid을 배치합니다. 11 ml의 신선하고 따뜻한 매체를 추가합니다. 3.6.3 - 단계 3.3에 설명 된대로 가습 된 5 % CO 2 분위기에서, 37 ° C에서 품어. 조직 배양에서의 세포 배양 배지는 일주일에 3 회 교체 플라스크. </li></ol></li><li> 세포를 수확 : <ol><li> 직접 현미경 vixualization에서 부드럽게 긁어 및 기음 세포와 mammospheres은 멸균 일회용 피펫 팁 1,000 μL 피펫을 사용하여. 세포와 주변 매체를 대기음. 멸균 마이크로 원심 튜브에 세포 / 매체 분배. </li></ol></li><li> 5 초 동안 12,100 XG에서 미니 원심 분리기에 간단히 세포를 스핀. 제거하고 매체를 폐기합니다. &lt;OL&gt; <li> DNA 분석을 위해 즉시 -80 ° C에서 장기간 저장하여, 매체 (10 μL)의 소량으로, 드라이 아이스에서 세포 펠렛을 동결. </li><li> 단백질체 분석을 위해, 질량 분석법 또는 웨스턴 블 롯팅 / 역상 단백질 마이크로 어레이를위한 2X SDS 트리스 - 글리신 완충액 8 M 우레아 10 μL에 용균. 또한, 면역 조직 화학 분석을위한 세포 얼룩을 만들기 위해 cytocentrifuge에서 셀을 회전. </li></ol></li><li> 플라스크에서 세포를 채취 한 후, 제거하고 나머지 매체를 폐기합니다. 따뜻한, 신선한 영양이 풍부한 매체의 11 ML을 추가합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C로 플라스크를 인큐베이션. </li></ol></li></ol>

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본원에 기재된 배양 시스템은 기본 및 병진 연구 연구에 사는 예비 침습적 유방 종양 세포를 생성하는 새로운 모델을 구성한다. 과거에는, 전 악성 유방암의 진행은 일반적으로 세 가지 방법으로 연구되어왔다. 첫 번째 방법은 병리 조직 학적 및 microdissected 냉동 또는 고정 인간의 표본 12-14의 유전자 분석이다. 두 번째 방법은 인간 프리 침습성 유방암 병소 (15)와 유사한 것으로 생...

유방 덕트 및 폐포 (현장에서 유관 암)의 범위 내에서 상피 세포의 증식은 침윤성 및 소엽 유방암에 대한 의무적 인 전구체로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 침윤성 암으로의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 집단 역학은 제대로 이해된다. 사전 침윤성 유방암 세포, 또는 임의의 미리 침습적 종양에서 사용 생존 메커니즘을 해명하기 죽이고, 심지어 사전 침습적 종양 1 방지용 치료 전략을 밝힐 수있다. 그러나, 기능적으로 공부 인간의 사전 침입 병변에 대한 간단한 저가의 방법이 결여되어있다. 형질 전환 된 세포주의 생체 외 단층 배양 확립 된 실험에있어서, 이러한 불멸화 세포주의 표현형과 유전자형이지만 일차 인간 종양 세포 (2)의 분자 상태를 요점을 되풀이하지 못한다. 또한, 심지어 비 - 발암 MCF-10A 세포주 어느 RECApitulates 3-D 유선 아키텍처는 적절하게 기능 표현형과 개별 환자의 사전 침습 유방 병변 3,4의 분자 특성을 표현하기 위해 실패합니다. 침공 할 수있는 줄기 같은 종양 세포가 현장 (DCIS) 세포 인구의 유관 암에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 (그림 1) (5) 수집 및 수술시 무균 인간의 유방 조직을 배양하기위한 방법론을 개발했다. 우리의 생체 가슴 organoid 문화 시스템은 분리하고 신선한 인간의 유방 유관 암 조직 6-8에서 mammosphere 형성 세포를 전파하기위한, 효소 조직 중단, 기저막 추출물 매트릭스, 또는 섬유 아세포 고갈에 의존하지 않습니다. 우리의 새로운 시스템은 셀 스트리밍 / 이주 (5)의 원리에 기초한다. 식별 유방 덕트 및 주변 기질 무 혈청 영양 배지 (단지 예 최소 체적에 빠져들배지에 노출 덕트의 절단면과, 가스 교환을 최대화하지만 플라스크 (도 1E-F)의 구체적인 배향하는) 덕트 단편을 덮도록, 계속하지. 이 문화 시스템은 세포가자가 기질과 문화 플라스크 위에 덕트에서 그리고 /로 마이그레이션 할 수 있습니다. 단지 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 항생제로 보충 영양 배지는 organoid에서 냄새가 나는데 혼합 세포 집단의 성장을 지원합니다. 조직 배양 플라스크를 멸균 습한 환경을 유지하면서, organoids 및 / 또는 세포 전체 플라스크 또는 이웃 organoids 중단없이 수확 할 수 있도록 분리형 재 밀봉 가능한 뚜껑을 갖는다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:187px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:365px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Ethanol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">A405-P</td>
			<td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 M&#937;-cm water, sterile filtered</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10cc plastic disposable syringe, sterile</td>
			<td style="width:187px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">305482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.2&#181;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">194-2520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>14-959-49B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50ml polypropylene conical tubes, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>05-539-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.5ml low retention microcentrifuge tubes,sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">02-681-331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11330-032</td>
			<td>with L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin, human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11376497001</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">GF144</td>
			<td>100&#181;g/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptomycin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S1567</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin sulfate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G19114</td>
			<td>10mg/ml stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filtration flask and filter top, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>0.22&#181;m PES membrane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>4489</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10ml sterile, disposable pipettes</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">4488</td>
			<td>paper-plastic wrapped</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:353px;">Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td>
			<td style="width:187px;">CDI</td>
			<td style="width:119px;">MD2000</td>
			<td style="width:365px;">after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cotton tipped applicators, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>23-400-115</td>
			<td>single use only</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Gauze pads, 10x10cm, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">2187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td>
			<td style="width:187px;">Samco</td>
			<td>202-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;">Vinegar, white distilled</td>
			<td style="width:187px;">household use</td>
			<td></td>
			<td style="width:365px;">5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">#10 scalpels, sterile, disposable&#160;</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>31-200-32&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">petri dish, sterile</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">TPP 115cm2 flask, with removable lid</td>
			<td style="width:187px;">MidSci</td>
			<td style="width:119px;">90652</td>
			<td>screw cap with filter</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:353px;">CO2 incubator</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td>13-998-074</td>
			<td>5% CO2, 37 oC, humidified chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">inverted light microscope</td>
			<td style="width:187px;">Olypmus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">8M urea</td>
			<td style="width:187px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP169-500</td>
			<td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">2X SDS tris-glycine buffer</td>
			<td style="width:187px;">Life Technologies</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Cytocentrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Thermo Scientific</td>
			<td>A78300003</td>
			<td>optional, for preparing cell smears</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

동일계 (DCIS)의 유방 유관 암종, 정의에 의해, 아교질 기저막을 위반하지 않고, 유방 덕트의 범위 내에서 종양의 상피 세포의 증식이다. DCIS는 침습적 유방암에 비 의무적 인 전구체이지만, 침습적 암의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 인구는 완전히 알려져 있지 않다. 침공 할 수있는 전구 세포가 DCIS 세포 인구 내에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 조직의 효소 중단하지 않고, 수술시 무균 인간의 유방 조직을 수집 및 배양 방법을 개발했다. 유관 분야를 포함하는 무균 유방 조직은 일상 병리 검사 다음과 같은 수술 적 절제 유방 조직에서 수확된다. DCIS 함유 조직은 조직 배양 실험실 풍부한 영양소, 항생제 - 함유, 무 혈청 배지에 넣고, 반송된다. 유방 조직은 더 dissecte입니다d는 석회화 된 영역을 분리한다. 다중 유방 조직 조각 (organoids)는 가습 CO 2 인큐베이터에서 이동식 뚜껑과 함께 배양 플라스크에서 무 혈청 배지의 최소 부피에 배치된다. 14 일 - 상피 세포와 섬유 아세포 세포 인구 10 후 organoid에서 등장. 자연에 형성 상피 세포 단층 주변 Mammospheres. 특정 세포 집단은 인접 셀에 영향을주지 않고 플라스크에서 직접 수확 할 수 있습니다. 우리의 비 효소 조직 배양 시스템은 안정적으로 신선한 인간 DCIS 병변에서 세포 유전 학적 이상, 침습성 전구 세포를 보여준다.

현장 조직에 멸균 유방 유관 암 조달 및 배양을위한 워크 플로우 유방 조직 불임은 전형적인 병원 병리학 워크 플로우의 작은 변화 (그림 1)를 통해 세포 배양 실험실로 수술실에서 유지됩니다. 조직은 조직을 무균 상태로 유지하면서 방사선 평가를 허용 플라스틱 필름 커버 멸균 용기에 운반된다. 유방 유방 종양 절제술 또는 유방 절제술 샘플의 총 조직 처?...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  George Mason University.  손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids>는 6 개월 가능한 남아있다. 

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Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of dome shaped cell structures referred to as mammospheres 1. The HC11 cell line has been employed as a model system for the study of regulation of mammary lactogenic differentiation both in vitro and in vivo 2. The HC11 cells differentiate and synthesize milk proteins in response to treatment with lactogenic hormones. Following the growth of HC11 mouse mammary epithelial cells to confluence, lactogenic differentiation was induced by the addition of a combination of lactogenic hormones including dexamethasone, insulin, and prolactin, referred to as DIP. The HC11 cells induced to differentiate were photographed at times up to 120 hours post induction of differentiation and the number of mammospheres that appeared in each culture was enumerated. The size of the individual mammospheres correlates with the degree of differentiation and this is depicted in the images of the differentiating cells.

HC11 lactogenic differentiation can be characterized by the formation of domed structures referred to as mammospheres. The structures can be enumerated by phase contrast microscopy to aid in quantifying lactogenic differentiation.

마우스 내유 상피 세포는 Lactogenic 차별 동안 Mammospheres를 형성

A phenotypic measure commonly used to determine the degree of lactogenic differentiation in mouse mammary epithelial cell cultures is the formation of ...

연구

생물학

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate (pHPL) as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for mesenchymal stromal cells (MSCs), fibroblasts and endothelial colony-forming cells with platelets activated by thrombin3-5 or lysed by freeze/thaw cycles6-14 before the platelet releasate is added to the cell culture medium. The trophic effect of platelet derived growth factors has already been tested in several trials for tissue engineering and regenerative therapy.1,15-17 Varying efficiency is considered to be at least in part due to individually divergent concentrations of growth factors18,19 and a current lack of standardized protocols for platelet preparation.15,16 This protocol presents a practicable procedure to generate a pool of human platelet lysate (pHPL) derived from routinely produced platelet rich plasma (PRP) of forty to fifty single blood donations. By several freeze/thaw cycles the platelet membranes are damaged and growth factors are efficiently released into the plasma. Finally, the platelet fragments are removed by centrifugation to avoid extensive aggregate formation and deplete potential antigens. The implementation of pHPL into standard culture protocols represents a promising tool for further development of cell therapeutics propagated in an animal protein-free system.

Preparation of Pooled Human Platelet Lysate pHPL as an Efficient Supplement for Animal Serum-Free Human Stem Cell Cultures

Human platelet lysate is a rich source of growth factors and a potent supplement in cell culture. This protocol presents the process of preparing a large pool of human platelet lysate by starting from platelet rich plasma, performing several freeze-thaw cycles and depleting the platelet fragments.

동물 세럼 - 무료 인간 줄기 세포 배양을위한 효율적인 보충으로 풀링 인간 혈소판 Lysate (pHPL)의 준비

Platelet derived growth factors have been shown to stimulate cell proliferation efficiently in vivo1,2 and in vitro. This effect has been reported for ...

Electrospinning Fibrous Polymer Scaffolds for Tissue Engineering and Cell Culture

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address the requirements (e.g., mechanics and vascularity) of more intricate organs and tissues. Electrospinning is a popular technique to create fibrous scaffolds that mimic the architecture and size scale of the native extracellular matrix. These fibrous scaffolds are also useful as cell culture substrates since the fibers can be used to direct cellular behavior, including stem cell differentiation (see extensive reviews by Mauck et al. and Sill et al. for more information). In this article, we describe the general process of electrospinning polymers and as an example, electrospin a reactive hyaluronic acid capable of crosslinking with light exposure (see Ifkovits et al. for a review on photocrosslinkable materials). We also introduce further processing capabilities such as photopatterning and multi-polymer scaffold formation. Photopatterning can be used to create scaffolds with channels and multi-scale porosity to increase cellular infiltration and tissue distribution. Multi-polymer scaffolds are useful to better tune the properties (mechanics and degradation) of a scaffold, including tailored porosity for cellular infiltration. Furthermore, these techniques can be extended to include a wide array of polymers and reactive macromers to create complex scaffolds that provide the cues necessary for the development of successful tissue engineered constructs.

The process of electrospinning polymers for tissue engineering and cell culture is addressed in this article. Specifically, the electrospinning of photoreactive macromers with additional processing capabilities of photopatterning and multi-polymer electrospinning is described.

조직 공학 및 세포 배양을위한 섬유 고분자의 공사장 공중 발판을 Electrospinning

As the field of tissue engineering evolves, there is a tremendous demand to produce more suitable materials and processing techniques in order to address ...

Long-term Culture of Human Breast Cancer Specimens and Their Analysis Using Optical Projection Tomography

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later distally, is a major factor in patient prognosis. Experimental systems of breast cancer rely on cell lines usually derived from primary tumours or pleural effusions. Two major obstacles hinder this research: (i) some known sub-types of breast cancers (notably poor prognosis luminal B tumours) are not represented within current line collections; (ii) the influence of the tumour microenvironment is not usually taken into account.
We demonstrate a technique to culture primary breast cancer specimens of all sub-types. This is achieved by using three-dimensional (3D) culture system in which small pieces of tumour are embedded in soft rat collagen I cushions. Within 2-3 weeks, the tumour cells spread into the collagen and form various structures similar to those observed in human tumours1. Viable adipocytes, epithelial cells and fibroblasts within the original core were evident on histology. Malignant epithelial cells with squamoid morphology were demonstrated invading into the surrounding collagen. Nuclear pleomorphism was evident within these cells, along with mitotic figures and apoptotic bodies.
We have employed Optical Projection Tomography (OPT), a 3D imaging technology, in order to quantify the extent of tumour spread in culture. We have used OPT to measure the bulk volume of the tumour culture, a parameter routinely measured during the neo-adjuvant treatment of breast cancer patients to assess response to drug therapy. 
Here, we present an opportunity to culture human breast tumours without sub-type bias and quantify the spread of those ex vivo. This method could be used in the future to quantify drug sensitivity in original tumour. This may provide a more predictive model than currently used cell lines.

We have developed a collagen-based in vitro assay which promotes proliferation and invasion from samples of all breast cancer subtypes. Optical Projection Tomography, a three dimensional microscopy technique was utilised to visualise and quantify tumour expansion. This assay may be used to quantify drug response of individual tumour samples.

광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

Breast cancer is a leading cause of mortality in the Western world. It is well established that the spread of breast cancer, first locally and later ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca and, in particular, of the granulosa cell layer profoundly change their morphological, physiological, and molecular characteristics and form the progesterone-producing corpus luteum that is responsible for maintaining pregnancy. Cell culture models are essential tools to study the underlying regulatory mechanisms involved in the folliculo-luteal transformation. The presented protocol focuses on the isolation procedure and cryopreservation of bovine GC from small- to medium-sized follicles (&#60; 6 mm). With this technique, a nearly pure population of GC can be obtained. The cryopreservation procedure greatly facilitates time management of the cell culture work independent of a direct primary tissue (ovaries) supply. This protocol describes a serum-free cell culture model that mimics the estradiol-active status of bovine GC. Important conditions that are essential for a successful steroid-active cell culture are discussed throughout the protocol. It is demonstrated that increasing the plating density of the cells induces a specific response as indicated by an altered gene expression profile and hormone production. Furthermore, this model provides a basis for further studies on GC differentiation and other applications.

A long-term culture model of bovine granulosa cells under serum-free conditions is described. This model allows researchers to study the effects of diverse factors and conditions as different plating densities on the characteristics of estrogen-producing bovine granulosa cells.

기본 소 Granulosa 에스트로겐 생산의 조직 문화 모델 세포

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

Tissue Collection of Bats for -Omics Analyses and Primary Cell Culture

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of these methods to non-model organisms. A series of protocols to optimize tissue collection from bats has been developed for a series of high-throughput sequencing approaches. Outlined here are protocols for the capture of bats, desired demographics to be collected for each bat, and optimized methods to minimize stress on a bat during tissue collection. Specifically outlined are methods for collecting and treating tissue to obtain (i) DNA for high molecular weight genomic analyses, (ii) RNA for tissue-specific transcriptomes, and (iii) proteins for proteomic-level analyses. Lastly, also outlined is a method to avoid lethal sampling by creating viable primary cell cultures from wing clips. A central motivation of these methods is to maximize the amount of potential molecular and morphological data for each bat and suggest optimal ways to preserve tissues so they retain their value as new methods develop in the future. This standardization has become particularly important as initiatives to sequence chromosome-level, error-free genomes of species across the world have emerged, in which multiple scientific parties are spearheading the sequencing of different taxonomic groups. The protocols outlined herein define the ideal tissue collection and tissue preservation methods for Bat1K, the consortium that is sequencing the genomes of every species of bat.

This is a protocol for the optimal tissue preparation for genomic, transcriptomic, and proteomic analyses of bats caught in the wild. It includes protocols for bat capture and dissection, tissue preservation, and cell culturing of bat tissue.

-Omics 분석 및 1 차 적인 세포 배양을 위한 박쥐의 조직 수집

As high-throughput sequencing technologies advance, standardized methods for high quality tissue acquisition and preservation allow for the extension of ...

Mucociliary Epithelial Organoids from Xenopus Embryonic Cells: Generation, Culture and High-Resolution Live Imaging

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated clearance. Many clinically relevant defects in the mucociliary epithelium are inferred as they occur deep within the body. Here, we introduce a tractable 3D model for mucociliary epithelium generated from multipotent progenitors that were microsurgically isolated from Xenopus laevis embryos. The mucociliary epithelial organoids are covered with newly generated epithelium from deep ectoderm cells and later decorated with distinct patterned multiciliated cells, secretory cells, and mucus-producing goblet cells that are indistinguishable from the native epidermis within 24 h. The full sequences of dynamic cell transitions from mesenchymal to epithelial that emerge on the apical surface of organoids can be tracked by high-resolution live imaging. These in vitro cultured, self-organizing mucociliary epithelial organoids offer distinct advantages in studying the biology of mucociliary epithelium with high-efficiency in generation, defined culture conditions, control over number and size, and direct access for live imaging during the regeneration of the differentiated epithelium.

We describe a simple protocol to develop mucociliary epithelial organoids from deep ectoderm cells isolated from Xenopus laevis embryos. The multipotent progenitors regenerate epithelial goblet cell precursors and allow live tracking of the initiation and progression of the cell transitions on the surface of organoids.

제노푸스 배아 세포에서 점동 상피 오르가노이드: 생성, 배양 및 고해상도 라이브 이미징

Mucociliary epithelium provides the first line of defense by removing foreign particles through the action of mucus production and cilia-mediated ...

Bovine Ovarian Cortex Tissue Culture

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors from somatic cells and cumulus cell-oocyte communication. Little is known about the ovarian microenvironment and how the cytokines and steroids produced in the surrounding milieu affect follicle progression or arrest. In vitro culture of ovarian cortex enables follicles to develop in a normalized environment that remains supported by adjacent stroma. Our objective was to determine the effect of nutritional Stair-Step diet on the ovarian microenvironment (follicle development, steroid, and cytokine production) through in vitro culture of bovine ovarian cortex. To accomplish this, ovarian cortical pieces were removed from heifers undergoing two different nutritionally developed schemes prior to puberty: Control (traditional nutrition development) and Stair-Step (feeding and restriction during development) that were cut into approximately 0.5-1 mm3 pieces. These pieces were subsequently passed through a series of washes and positioned on a tissue culture insert that is set into a well containing Waymouth&#39;s culture medium. Ovarian cortex was cultured for 7 days with daily culture media changes. Histological sectioning was performed to determine follicle stage changes before and after the culture to determine effects of nutrition and impact of culture without additional treatment. Cortex culture medium was pooled over days to measure steroids, steroid metabolites, and cytokines. There were tendencies for increased steroid hormones in ovarian microenvironment that allowed for follicle progression in the Stair-Step versus Control ovarian cortex cultures. The ovarian cortex culture technique allows for a better understanding of the ovarian microenvironment, and how alterations in endocrine secretion may affect follicle progression and growth from both in vivo and in vitro treatments. This culture method may also prove beneficial for testing potential therapeutics that may improve follicle progression in women to promote fertility.

In vitro culture of bovine ovarian cortex and the effect of nutritional Stair-step diet on ovarian microenvironment is presented. Ovarian cortex pieces were cultured for seven days and steroids, cytokines, and follicle stages were evaluated. The Stair-Step diet treatment had increased steroidogenesis resulting in follicle progression in culture.

소 난소 피질 조직 배양

Follicle development from the primordial to antral stage is a dynamic process within the ovarian cortex, which includes endocrine and paracrine factors ...