이 작품은에 의해 부분적으로 지원 (1) 국방부의 유방암 연구 프로그램 (미국 육군 의학 연구 수집 활동) #이 LAL에 W81XVVH-10-1-0781가 및 VE 상을, (2) 수잔 G. 코멘 재단 보조금 IR122224446는 LAL 및 VE합니다. 병리학 지원 및 조직의 매출 동시는 친절 이노 바 페어팩스 병리학 교실 박사 하산 Nayer 박사 Geetha A. 메네 제스, 박사 찰스 Bechert에 의해 제공되었다. 환자 동의 및 샘플 조달은 전문적 이노 바 페어팩스 병원 임상 연구 코디네이터 홀리 Gallimore, 헤더 Huryk, 그리고 에밀 카마르에 의해 인도되었다.

인간의 유방 조직은 국방부, 조지 메이슨 대학 (George Mason University), 그리고 이노 바 헬스 시스템 심사위원회 (Institutional Review Board)의 승인 된 프로토콜에 따라, 동의서로, 연구 대상으로 환자로부터 수집되었다. 1. 성장 인자와 항생제와 영양 리치 미디어를 준비 <ol><li> 인슐린의 원액, 표피 성장 인자 (EGF), 황산 스트렙토 마이신 및 젠타 마이신 설페이트를 준비한다. <ol><li> 10 ㎎ / ㎖의 최종 농도로 멸균 여과 물에서 인슐린을 재생성. 멸균 10 ㎖의 일회용 주사기에 1 시약 등급의 물을 기음은 10 ml의. 주사기에 0.22 μm의 폴리 에테르 설폰 필터를 연결합니다. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 멸균 여과 물을 분배. </li><li> 인슐린의 100 mg을 유리 병에 무균 여과 물 10ml를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 얼음에 인슐린 병을 유지합니다. 인슐린 스톡 SOLU 450 μl를 분배-20 ° C에서 라벨, 멸균의 microcentrifuge 튜브 및 저장소로 기. 인슐린 원액 바이알에 만기일까지 안정하다. </li><li> 표피 성장 인자 (EGF)의 주식 솔루션을 준비 : 500 μg의 EGF (주 1 ㎍ / μL)에 500 μL를 멸균 물을 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 얼음에 EGF의 병을 유지합니다. <ol><li> EGF의 작업 원액을 준비 : 900 μL 영양 배지 (일 주식 / μL 0.1 μg의 예정)에 주식 EGF 솔루션의 100 μl를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. -80 ° C에서 EGF 근무하는 표시, 멸균 마이크로 원심 튜브에 솔루션 및 저장의 50 μl를 분배. 참고 : EGF 원액 (1 ㎍ / μL)는 -80 ° C에서 1 년 동안 안정적이다; 원액 (0.1 ㎍ / μL)를 작업하는 -80 ° C에서 2 개월 동안 안정하다. </li></ol></li><li> 분석 저울에 스트렙토 마이신 황산염 40 mg의 무게가 나간다. 스트렙토 마이신 황산염 INT 배치OA 멸균 15 ML 원뿔 튜브. 영양 배지 4 ML을 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 이 솔루션은 약간 분홍색이어야한다. 4 ° C에서 보관은 빛으로부터 보호. 스트렙토 마이신 설페이트 용액을 7 일간 안정하다. </li><li> 분석 저울에 겐타 마이신 황산염 20 mg의 무게. 멸균 15 ML 원뿔 튜브에 황산 젠타 마이신을 놓습니다. 영양 배지 2 ㎖를 추가합니다. 볼텍스 믹서 간략 내용을 섞는다. 이 솔루션은 노란색이어야한다. 4 ° C에서 보관은 빛으로부터 보호. 황산 젠타 마이신 용액을 7 일간 안정하다. </li></ol></li><li> (20 (. 100 ㎍ / ml의 최종 진한), (. 10 ㎍ / ml의 최종 진한), (. 10 NG / ml의 최종 진한) 스트렙토 마이신 황산 인슐린을 인간 재조합 EGF와 보충 영양 배지의 두 개의 200 ml의 배치를 준비하고 겐타 마이신 황산염 ㎍ / ml의 최종 농.). <ol><li> 0.2 μm의 폴리 에테르 설폰 필터 플라스크가 장착 된 진공 필터 플라스크에 250 ml의 수신 병에 200ml의 영양 배지를 추가합니다. 추가 20# 181; L 근무하는 EGF, 200 μL 스톡 인슐린, 2 ml의 주식 스트렙토 마이신 황산염, 및 영양 배지의 200 ml의 400 μL 재고 겐타 마이신 황산염. 진공 필터 플라스크를 연결합니다. 매체를 필터링합니다. 필터를 취소하고 &quot;영양이 풍부한 매체&quot;로 플라스크 레이블. 최대 14 일 동안 4 ° C에 보관하십시오. </li></ol></li></ol> 2. 조직 수집 및 매출 동시 <ol><li> 운영 제품군에서, 유방 조직을 조달 한 후 멸균 기술을 유지한다. 살균 트레이에 유방 조직을 배치하고 멸균 플라스틱 포장 트레이 커버. <ol><li> 당신의 기관이 필요에 따라 방사선 / 병리학에 해당 트레이에있는 조직을 운반. 트레이를 열지 마십시오. 전송 시간은 기관 내에서 다릅니다. 조직은 최대 45 분 후 절제에 대한 RT에서이 덮여 트레​​이에 실행 가능한 남아있을 수 있습니다. 그러나, 영양이 풍부한 매체로 조직의 신속한 처리 이후 organoid 문화에 대한 최적의 조건을 제공합니다. </li></ol></li><li> 총 조직 절개는 유방 조직 내에서 DCIS의 영역을 식별하기 : 조직 불임을 유지하기 위해 조직의 박리시 멸균 장갑, 블레이드, 메스, 조직 마킹 염료, 식초를 사용합니다. <ol><li> 70 % 에탄올 1 % 표백제와 작업 영역을 청소합니다. 멸균 장갑을 열고 작업 표면에 장갑 래퍼를 배치합니다. 장갑 래퍼 얼굴 위로의 멸균 내부를 놓습니다. 멸균 장갑을 착용 할 것. <ol><li> 70 % 에탄올로 시료 용기의 표면을 청소. 조직 표본 용기의 플라스틱 포장을 제거하고 장갑 래퍼에 시편을 배치합니다. </li></ol></li><li> 조직 표시 염료로 두면 스쳐 면봉을 찍어. 조직 표면에 걸쳐 면봉 압연하여 조직의 표면에 염료를 적용. 참고 : 각 병리 부서는 표준화 된 염료 색상 / 조직 방향 프로토콜을 가지고있다. 조직은 환자에서의 위치와 관련하여 조직의 방향을 염료로 표시됩니다. 염료 도말되거나조직에 그렸다. 조직을 통해 염료를 부어하지 마십시오. 염료를 붓는 염료 따라서 절제의 방향을 혼란 조직 틈새로 / 실행 똑 될 수 있습니다. 조직 배향 외과에 해부학과 병리학) 조직 표본을 설명하고, b) 종양 관련 절제면의 위치를​​ 결정을 제공한다. </li><li> 멸균 거즈 패드에 증류 식초 (5 % 아세트산)을 붓는다. 식초를 적신 거즈로 염색 된 조직을 오 점. 거즈를 폐기하십시오. 식초는 염료 마킹 조직을 고정하는 데 사용됩니다. </li><li> 약 5 mm 두께의 수직 조각으로 유방 조직을 잘라. 조직 (그림 2)을 통해 모든 방법을 절단하지 마십시오. / 관찰 석회화의 영역에 대한 조직을 촉진하다. 자신의 특성 회사가 DCIS 병변을 확인, 붉은에 둘러싸인 모습 창백한 (때문에 칼슘의 spicules에) 껄끄 러운 느낌을 고무 테두리. NOTE : 일부 경우에, 여드름 (여드름 같은) 영역 일 수있다큰 직경 DCIS 병변에서 괴사 물질을 나타내는 흰색 점으로 볼. </li><li> 유방 조직 주변의 작은 금액을 포함, DCIS / 석회화 유방 조직의 영역을 잘라. 단계 1에서 제조 한 영양이 풍부한 배지 20-30 ml를 함유하는 멸균 50 ㎖ 튜브에 유방 조직을 놓는다. <ol><li> 조심스럽게 튜브를 수회 반전시켜 조직 및 매체를 섞는다. 매체를 취소하고 새로운 배지를 추가합니다. 단열 용기 내로 조직 및 배지를 함유하는 튜브를 삽입하고 조직 배양 실험실로 수송 조직. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 조직 문화 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서 작업, 조직 및 멸균 페트리 접시에 영양 배지의 작은 금액을 붓는다. 멸균 메스가 절단 및 섬유 조직을 폐기 사용. 조각 (organoids)로 유방 조직 약 3mm 2 (그림 1C-D)를 잘라. 조직을 절단하려고 있도록 각 기관OID 주변 기질과 적어도 하나의 뚜렷한 덕트 세그먼트가 포함되어 있습니다. </li><li> 조직 배양 플라스크의 뚜껑을 엽니 다. 멸균 핀셋이나 집게를 사용하여 플라스크에 organoids를 놓습니다. 뚜껑을 닫습니다. 페트리 접시를 폐기하십시오. </li><li> 조직 배양 플라스크에 11 ㎖의 무 혈청 배지 영양이 풍부한 (단계 1에서 제조)를 첨가. 플라스크를 닫고 organoids 중간 균등 플라스크 표면 (그림 1E-F)에 분산되도록 플라스크 소용돌이 친다. </li><li> 2 일 동안 가습 5.0 %의 CO 2 분위기하에 37 ° C에서 플라스크를 인큐베이션. 이 시간 동안 플라스크를 이동하지 마십시오. </li><li> 2 일 후 배양에서 잠재적 인 세균 / 곰팡이 오염을 확인하기 위해 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 플라스크의 갑작스런 날카로운 움직임, 또는 소용돌이를 피하십시오. 거꾸로 현미경 무대에서 플라스크를 놓습니다. <ol><li> 박테리아, 효모, 및 / 또는 곰팡이에 대한 매체를 관찰합니다. 어떠한 오염이 관찰되지 않는 경우, 추가 동안 인큐베이터로 플라스크를 반환itional 일. 오염이 언급되는 경우, 적당한 용기에 플라스크 내용물을 폐기. </li></ol></li><li> 3 일 후 배양에서 신선한 매체와 조정 배지를 교체합니다. <ol><li> 20 ~ 30 분 동안 37 ° C에서 멸균 튜브에 배지 11 ml에 놓습니다. 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크를 제거합니다. organoids을 방해하지 않고, 제거하고 멸균 혈청 피펫을 사용하여 플라스크에 매체를 폐기합니다. </li><li> 새로운 멸균 혈청 피펫을 사용하여 미리 예열 신선한 배지 11 ml에 추가합니다. 아주 조심스럽게 플라스크의 표면을 가로 질러 매체를 배포하는 플라스크를 회전. </li><li> 가습 5.0 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li></ol></li></ol> 설립 Organoid / 상피 세포 콜로니 4. 유지 보수 <ol><li> 매 2 주마다 새로운 배지를 준비하고 조직 배양 플라스크에 일주일에 3 번 미디어를 교체합니다. <ol><li> 37 멸균 용기에 배지 11 ml에 배치20 ~ 30 분 동안 C를 °. 인큐베이터에서 플라스크를 제거합니다. 멸균 혈청 피펫을 사용하여 제거하고 organoids을 방해하지 않도록주의, 플라스크에서 조정 배지를 폐기합니다. </li><li> 새로운 멸균 혈청 피펫을 사용하여 미리 예열 신선한 배지 11 ml에 추가합니다. 아주 조심스럽게 플라스크의 표면을 가로 질러 매체를 배포하는 플라스크를 회전. 가습 5.0 % CO 2 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li></ol></li><li> 10 후 - 문화에서 14 일, 부착하지 않은 문화 플라스크에서 조직의 조각을 제거합니다. <ol><li> 이종 이식 이식 주기적으로 수확 세포 및 / 또는 새로운 배양 플라스크에 전파 플라스크에서 organoids, 또는 표현형 및 / 또는 분자 분석. </li><li> 인큐베이터에서 조직 배양 플라스크를 제거합니다. 70 % 에탄올로 플라스크 스프레이. 70 % 에탄올을 분무 된 깨끗한 종이 타월로 플라스크에 여분의 에탄올을 닦아. </li><li> Organoid 전파 : &lt;OL&gt; <li> 플라스크의 뚜껑을 열고 생물 안전 캐비닛의 뚜껑면이 위로를 놓습니다. 현미경 시각화에서 organoid (들)을 수확 할을 찾습니다. 픽업하기 위해 organoid을 멸균 핀셋이나 집게를 사용합니다. </li><li> 새로운 문화 플라스크에 organoid을 전파하기 위해, 새로운 플라스크에 organoid을 배치합니다. 11 ml의 신선하고 따뜻한 매체를 추가합니다. 3.6.3 - 단계 3.3에 설명 된대로 가습 된 5 % CO 2 분위기에서, 37 ° C에서 품어. 조직 배양에서의 세포 배양 배지는 일주일에 3 회 교체 플라스크. </li></ol></li><li> 세포를 수확 : <ol><li> 직접 현미경 vixualization에서 부드럽게 긁어 및 기음 세포와 mammospheres은 멸균 일회용 피펫 팁 1,000 μL 피펫을 사용하여. 세포와 주변 매체를 대기음. 멸균 마이크로 원심 튜브에 세포 / 매체 분배. </li></ol></li><li> 5 초 동안 12,100 XG에서 미니 원심 분리기에 간단히 세포를 스핀. 제거하고 매체를 폐기합니다. &lt;OL&gt; <li> DNA 분석을 위해 즉시 -80 ° C에서 장기간 저장하여, 매체 (10 μL)의 소량으로, 드라이 아이스에서 세포 펠렛을 동결. </li><li> 단백질체 분석을 위해, 질량 분석법 또는 웨스턴 블 롯팅 / 역상 단백질 마이크로 어레이를위한 2X SDS 트리스 - 글리신 완충액 8 M 우레아 10 μL에 용균. 또한, 면역 조직 화학 분석을위한 세포 얼룩을 만들기 위해 cytocentrifuge에서 셀을 회전. </li></ol></li><li> 플라스크에서 세포를 채취 한 후, 제거하고 나머지 매체를 폐기합니다. 따뜻한, 신선한 영양이 풍부한 매체의 11 ML을 추가합니다. 가습 된 5 % CO 2 분위기에서 37 ° C로 플라스크를 인큐베이션. </li></ol></li></ol>

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본원에 기재된 배양 시스템은 기본 및 병진 연구 연구에 사는 예비 침습적 유방 종양 세포를 생성하는 새로운 모델을 구성한다. 과거에는, 전 악성 유방암의 진행은 일반적으로 세 가지 방법으로 연구되어왔다. 첫 번째 방법은 병리 조직 학적 및 microdissected 냉동 또는 고정 인간의 표본 12-14의 유전자 분석이다. 두 번째 방법은 인간 프리 침습성 유방암 병소 (15)와 유사한 것으로 생...

유방 덕트 및 폐포 (현장에서 유관 암)의 범위 내에서 상피 세포의 증식은 침윤성 및 소엽 유방암에 대한 의무적 인 전구체로 인식되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 침윤성 암으로의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 집단 역학은 제대로 이해된다. 사전 침윤성 유방암 세포, 또는 임의의 미리 침습적 종양에서 사용 생존 메커니즘을 해명하기 죽이고, 심지어 사전 침습적 종양 1 방지용 치료 전략을 밝힐 수있다. 그러나, 기능적으로 공부 인간의 사전 침입 병변에 대한 간단한 저가의 방법이 결여되어있다. 형질 전환 된 세포주의 생체 외 단층 배양 확립 된 실험에있어서, 이러한 불멸화 세포주의 표현형과 유전자형이지만 일차 인간 종양 세포 (2)의 분자 상태를 요점을 되풀이하지 못한다. 또한, 심지어 비 - 발암 MCF-10A 세포주 어느 RECApitulates 3-D 유선 아키텍처는 적절하게 기능 표현형과 개별 환자의 사전 침습 유방 병변 3,4의 분자 특성을 표현하기 위해 실패합니다. 침공 할 수있는 줄기 같은 종양 세포가 현장 (DCIS) 세포 인구의 유관 암에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 (그림 1) (5) 수집 및 수술시 무균 인간의 유방 조직을 배양하기위한 방법론을 개발했다. 우리의 생체 가슴 organoid 문화 시스템은 분리하고 신선한 인간의 유방 유관 암 조직 6-8에서 mammosphere 형성 세포를 전파하기위한, 효소 조직 중단, 기저막 추출물 매트릭스, 또는 섬유 아세포 고갈에 의존하지 않습니다. 우리의 새로운 시스템은 셀 스트리밍 / 이주 (5)의 원리에 기초한다. 식별 유방 덕트 및 주변 기질 무 혈청 영양 배지 (단지 예 최소 체적에 빠져들배지에 노출 덕트의 절단면과, 가스 교환을 최대화하지만 플라스크 (도 1E-F)의 구체적인 배향하는) 덕트 단편을 덮도록, 계속하지. 이 문화 시스템은 세포가자가 기질과 문화 플라스크 위에 덕트에서 그리고 /로 마이그레이션 할 수 있습니다. 단지 표피 성장 인자 (EGF), 인슐린, 항생제로 보충 영양 배지는 organoid에서 냄새가 나는데 혼합 세포 집단의 성장을 지원합니다. 조직 배양 플라스크를 멸균 습한 환경을 유지하면서, organoids 및 / 또는 세포 전체 플라스크 또는 이웃 organoids 중단없이 수확 할 수 있도록 분리형 재 밀봉 가능한 뚜껑을 갖는다.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>A405-P</td><td>prepare a 70% solution in Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>18 M&amp;Omega;-cm water, sterile filtered</td><td></td><td></td><td>sterile filtered, Type 1 reagent grade water</td></tr><tr><td>10 cc plastic disposable syringe, sterile</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m polyethersulfone (PES) syringe filter, sterile</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2520</td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polypropylene conical tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml low retention microcentrifuge tubes, sterile</td><td>Fisher</td><td>02-681-331</td><td></td></tr><tr><td>nutrient medium, DMEM-F12/HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>with L-glutamine</td></tr><tr><td>Insulin, human recombinant</td><td>Roche</td><td>11376497001</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF), human recombinant</td><td>Millipore</td><td>GF144</td><td>100 &amp;micro;g/ml stock</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1567</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G19114</td><td>10 mg/ml stock</td></tr><tr><td>Filtration flask and filter top, sterile</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td>0.22 &amp;micro;m PES membrane</td></tr><tr><td>25 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4489</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>10 ml sterile, disposable pipettes</td><td>Fisher</td><td>4488</td><td>paper-plastic wrapped</td></tr><tr><td>Tissue marking dyes (black, blue, red, green, yellow and orange)</td><td>CDI</td><td>MD2000</td><td>after opening use only with single-use, sterile cotton tipped applicators, or use once and discard</td></tr><tr><td>Cotton tipped applicators, sterile</td><td>Fisher</td><td>23-400-115</td><td>single use only</td></tr><tr><td>Gauze pads, 10 x 10 cm, sterile</td><td>Fisher</td><td>2187</td><td></td></tr><tr><td>Plastic transfer pipettes, sterile, disposable</td><td>Samco</td><td>202-20S</td><td></td></tr><tr><td>Vinegar, white distilled</td><td>household use</td><td></td><td>5% acetic acid; after opening use only with sterile pipettes</td></tr><tr><td>#10 scalpels, sterile, disposable</td><td>Thermo Scientific</td><td>31-200-32</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish, sterile</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>TPP 115 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask, with removable lid</td><td>MidSci</td><td>90652</td><td>screw cap with filter</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Fisher</td><td>13-998-074</td><td>5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 37 &amp;deg;C, humidified chamber</td></tr><tr><td>inverted light microscope</td><td>Olypmus</td><td>IX51</td><td></td></tr><tr><td>8 M urea</td><td>Fisher</td><td>BP169-500</td><td>optional, for mass spectrophotometric analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>2X SDS tris-glycine buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>optional, for proteomic analysis of cultured cells</td></tr><tr><td>Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>optional, for preparing cell smears</td></tr></tbody></table>

non-enzymatic, serum-free tissue culture of pre-invasive breast lesions for spontaneous generation of mammospheres

동일계 (DCIS)의 유방 유관 암종, 정의에 의해, 아교질 기저막을 위반하지 않고, 유방 덕트의 범위 내에서 종양의 상피 세포의 증식이다. DCIS는 침습적 유방암에 비 의무적 인 전구체이지만, 침습적 암의 진행을 허용하는 분자 메커니즘 및 세포 인구는 완전히 알려져 있지 않다. 침공 할 수있는 전구 세포가 DCIS 세포 인구 내에서 존재 여부를 확인하기 위해, 우리는 조직의 효소 중단하지 않고, 수술시 무균 인간의 유방 조직을 수집 및 배양 방법을 개발했다. 유관 분야를 포함하는 무균 유방 조직은 일상 병리 검사 다음과 같은 수술 적 절제 유방 조직에서 수확된다. DCIS 함유 조직은 조직 배양 실험실 풍부한 영양소, 항생제 - 함유, 무 혈청 배지에 넣고, 반송된다. 유방 조직은 더 dissecte입니다d는 석회화 된 영역을 분리한다. 다중 유방 조직 조각 (organoids)는 가습 CO 2 인큐베이터에서 이동식 뚜껑과 함께 배양 플라스크에서 무 혈청 배지의 최소 부피에 배치된다. 14 일 - 상피 세포와 섬유 아세포 세포 인구 10 후 organoid에서 등장. 자연에 형성 상피 세포 단층 주변 Mammospheres. 특정 세포 집단은 인접 셀에 영향을주지 않고 플라스크에서 직접 수확 할 수 있습니다. 우리의 비 효소 조직 배양 시스템은 안정적으로 신선한 인간 DCIS 병변에서 세포 유전 학적 이상, 침습성 전구 세포를 보여준다.

현장 조직에 멸균 유방 유관 암 조달 및 배양을위한 워크 플로우 유방 조직 불임은 전형적인 병원 병리학 워크 플로우의 작은 변화 (그림 1)를 통해 세포 배양 실험실로 수술실에서 유지됩니다. 조직은 조직을 무균 상태로 유지하면서 방사선 평가를 허용 플라스틱 필름 커버 멸균 용기에 운반된다. 유방 유방 종양 절제술 또는 유방 절제술 샘플의 총 조직 처?...

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Non-enzymatic, Serum-free Tissue Culture of Pre-invasive Breast Lesions for Spontaneous Generation of Mammospheres

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

Breast ductal carcinoma in situ (DCIS), by definition, is proliferation of neoplastic epithelial cells within the confines of the breast duct, without ...

non-enzymatic-serum-free-tissue-culture-pre-invasive-breast-lesions

Research

JoVE Journal

Biology

12.5K 조회수.  George Mason University.  손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids>는 6 개월 가능한 남아있다. 

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Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J Mice

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular through transplantation of stromal cells and epithelial cells in the mammary gland of mice. Current transplantation models often involve the use of immunocompromised mice due to the different genetic backgrounds of stromal cells and epithelial cells. Extracellular matrices are often used to embed the two different cell types for consistent cell-cell interactions, but involve the use of Matrigel or rat tail collagen, which are immunogenic substrates. The lack of functional T cells from immunocompromised mice prevents accurate assessment of stromal cells on mammary tumor progression in vivo, with important implications on drug development and efficacy. Moreover, immunocompromised mice are costly, hard to breed and require special care conditions. To overcome these obstacles, we have developed an approach to orthotopically transplant stromal cell and epithelial cells into mice from the same genetic background to induce consistent tumor formation. This system involves harvesting normal, carcinoma associated fibroblasts, PyVmT mammary carcinoma cells and collagen from donor C57BL/6J mice. The cells are then embedded in collagen and transplanted in the inguinal mammary glands of female C57BL/6J mice. Transplantation of PyVmT cells alone form palpable tumors 30-40 days post transplantation. Endpoint analysis at 60 days indicates that co-transplantation with fibroblasts enhances mammary tumor growth compared to PyVmT cells transplanted alone. While cells and matrix from C57BL/6J mice were used in these studies, the isolation of cells and matrix and transplantation approach may be applied towards mice from different genetic backgrounds demonstrating versatility. In summary, this system may be used to investigate molecular interactions between stromal cells and epithelial cells, and overcomes critical limitations in immunocompromised mouse models.

In this report, we demonstrate a system to isolate and culture donor cells from the mouse mammary gland, and orthotopically transplant these cells in recipient mice to analyze stromal: epithelial interactions during mammary tumor development.

C57BL/6J 마우스의 Stromal 셀 및 암종 세포 이식 내유

The influence of stromal cells, including fibroblasts on mammary tumor progression has been well documented through the use of mouse models, in particular ...

연구

의학

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

인간 Mammary 섬유아 세포에서 암종 - 관련 섬유아 세포의 실험 세대 (CAFs)

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

세포 배양을위한 인간 감소 Mammoplasty과 유방 절제술의 조직의 처리

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major contributors to breast cancer initiation, relapse, metastasis and therapy resistance. It is imperative to understand the biology of breast cancer stem cells in order to identify novel therapeutic targets to treat breast cancer. Breast cancer stem cells are isolated and characterized based on expression of unique cell surface markers such as CD44, CD24 and enzymatic activity of aldehyde dehydrogenase (ALDH). These ALDHhighCD44+CD24- cells constitute the BCSC population and can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) for downstream functional studies. Depending on the scientific question, different in vitro and in vivo methods can be used to assess the functional characteristics of BCSCs. Here, we provide a detailed experimental protocol for isolation of human BCSCs from both heterogenous populations of breast cancer cells as well as primary tumor tissue obtained from breast cancer patients. In addition, we highlight downstream in vitro and in vivo functional assays including colony forming assays, mammosphere assays, 3D culture models and tumor xenograft assays that can be used to assess BCSC function.

This experimental protocol describes the isolation of BCSCs from breast cancer cell and tissue samples as well as the in vitro and in vivo assays that can be used to assess BCSC phenotype and function.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

암 연구학

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its progression. Although the mechanisms involved in promoting breast cancer growth have been intensively studied using monocultures of breast cancer cells such as MCF-7 cells, the contribution of other cell types, such as vascular and lymphatic endothelial cells that are intimately involved in tumor growth, has not been investigated in depth. Cell-cell interaction plays a key role in tumor growth and progression. Neoangiogenesis, or the development of vessels, is essential for tumor growth, whereas the lymphatic system serves as a portal for cancer cell migration and subsequent metastasis. Recent studies provide evidence that vascular and lymphatic endothelial cells can significantly influence cancer cell growth. These observations imply a need for developing in vitro models that would more realistically reflect breast cancer growth processes in vivo. Moreover, restrictions in animal research require the development of ex vivo models to elucidate better the mechanisms involved.
This article describes the development of breast cancer spheroids composed of both breast cancer cells (estrogen receptor-positive MCF-7 cells) and vascular and/or lymphatic endothelial cells. The protocol describes a detailed step-by-step approach in creating dual-cell spheroids using two different approaches, hanging drop (gold standard and cheap) and 96-well U-bottom plates (expensive). In-depth instructions are provided for how to delicately pick up the formed spheroids to monitor growth by microscopic sizing and assessing viability using dead and live cell staining. Moreover, procedures to fix the spheroids for sectioning and staining with growth-specific antibodies to differentiate growth patterns in spheroids are delineated. Additionally, details for preparing spheroids with transfected cells and methods to extract RNA for molecular analysis are provided. In conclusion, this article provides in-depth instructions for preparing multi-cell spheroids for breast cancer research.

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Crosstalk between mammary epithelial cells and endothelial cells importantly contributes to breast cancer progression, tumor growth, and metastasis. In this study, spheroids have been made from breast cancer cells together with vascular and/or lymphatic endothelial cells and demonstrate their applicability as an in vitro system for breast cancer research.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Quantification of Self-renewal in Murine Mammosphere Cultures

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. The role of mammary stem cells (MaSCs) is widely studied both in the physiological/developmental context and with regards to breast carcinogenesis. In this aspect, ex vivo studies focused on MaSC properties are highly sought after. Mammosphere cultures represent a surrogate of organ formation and have become a valuable tool for both basic and translational research. Here, we present a detailed protocol for the generation of murine primary mammosphere cultures and the quantitation of MaSC growth properties. The protocol includes mammary gland collection and digestion, isolation of primary mammary epithelial cells (MECs), establishment of primary mammosphere cultures, serial passaging, quantitation of mammosphere growth parameters and interpretation of the results. As an example, we present the effect of low-level constitutive Myc expression on normal MECs leading to increased self-renewal and proliferation.

Here, we describe the implementation and interpretation of the results of an in vitro mammosphere self-renewal quantitative assay.

뮤린 맘모스피어 문화에서 자체 갱신의 정량화

The mammary gland is characterized by extensive regeneration capacity, as it goes through massive hormonal changes throughout the life cycle of a female. ...

발생학

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine mammary gland is composed of two distinct epithelial cell compartments, serving different functions: the outer, contractile myoepithelial compartment and the inner, secretory luminal compartment. Here, we describe a method by which the cells comprising these compartments are isolated and then combined to investigate their individual lineage contributions to mammary gland morphogenesis and differentiation. The method is simple and efficient and does not require sophisticated separation technologies such as fluorescence activated cell sorting. Instead, we harvest and enzymatically digest the tissue, seed the epithelium on adherent tissue culture dishes, and then use differential trypsinization to separate myoepithelial from luminal cells with ~90% purity. The cells are then plated in an extracellular matrix where they organize into bilayered, three-dimensional (3D) organoids that can be differentiated to produce milk after 10 days in culture. To test the effects of genetic mutations, cells can be harvested from wild type or genetically engineered mouse models, or they can be genetically manipulated prior to 3D culture. This technique can be used to generate mosaic organoids that allow investigation of gene function specifically in the luminal or myoepithelial compartment.

The mammary gland is a bilayered structure, comprising outer myoepithelial and inner luminal epithelial cells. Presented is a protocol to prepare organoids using differential trypsinization. This efficient method allows researchers to separately manipulate these two cell types to explore questions concerning their roles in mammary gland form and function.

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

인간 유방암 조직과 세포주에서 Mammosphere 형성 분석

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

인간 조직에서 유방 상피 세포를 분리하기 위한 프로토콜

Isolation and Culture of Primary Human Mammary Epithelial Cells

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are the origin cells of breast cancer and other breast-related inflammatory diseases, have garnered considerable attention. However, isolating and culturing primary HMECs in vitro for research purposes has been challenging due to their highly differentiated, keratinized nature and their short lifespan. Therefore, developing a simple and efficient method to isolate and culture HMECs is of great scientific value for the study of breast biology and breast-related diseases. In this study, we successfully isolated primary HMECs from small amounts of mammary tissue by digestion with a mixture of enzymes combined with an initial culture in 5% fetal bovine serum-DMEM containing the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632, followed by culture expansion in serum-free keratinocyte medium. This approach selectively promotes the growth of epithelial cells, resulting in an optimized cell yield. The simplicity and convenience of this method make it suitable for both laboratory and clinical research, which should provide valuable insights into these important areas of study.

저자 스포트라이트: 육아종성 유선염 치료를 위한 동양 의학과 서양 의학의 통합

The present study reports an easier, time-saving, and economical protocol to efficiently isolate and grow primary human mammary epithelial cells (HMECs) from small amounts of mammary tissue. This protocol is suitable for quickly producing primary HMECs both for laboratory and clinical applications.

Isolation and Culture of primary human mammary epithelial cells(원발성 인간 유방 상피세포의 분리 및 배양)

The mammary gland is a fundamental structure of the breast and plays an essential role in reproduction. Human mammary epithelial cells (HMECs), which are ...