We thank Cindy Voisine and Yoko Shibata for helpful discussion and critical comments on the manuscript. We acknowledge the High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) and the Biological Imaging Facility (BIF) at Northwestern University for their assistance. This work was funded by grants from the National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), the Ellison Medical Foundation, and the Daniel F. and Ada L. Rice Foundation (to R.I.M.). C.I.N.-K. was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. 모니터링 세포 횡단는 생체 시간 경과 영상으로 프리온 같은 단백질의 확산 참고 : C. 성장 표준 방법에 조심스럽게 재배 온도 (47)를 제어에 따라 elegans의 야생형 (WT) (N2)와 유전자 변형 라인. <ol><li> C.의 유전자 변형 라인을 생성 엘레 단량체 적색 형광 단백질 (MRFP) 태그 프리온 같은 단백질을 표현. 미세 주입 (48)를 사용하는 방법을 보여줍니다 비디오를 시청. 이러한 염색체 외 라인을 통합하는 방법에 대한 자세한 내용과 방법에 대해서는 49을 참조하십시오. </li><li> 계란은 표준 방법 (50)에 따라 누워 또는 표백에 의해 동기화 인구를 준비합니다. <ol><li> 달걀 누워에 의해 동기화 <ol><li> 전송 10-20 임신하는 접시에 성인들이 1 알을 낳는하자 - 2 시간. 접시에서 어른을 제거하고 자손이 원하는 나이까지 성장 할 수 있습니다. </li></ol></li> &lt;표백에 의한 리&gt; 동기화 <ol><li> 임신하는 성인의 동기화 인구를 수집 및 알칼리 차아 염소산 용액 (250 mM의 NaOH를 1 : H 2 O 상업 표백제의 4 (v / v)로 희석)로 표백. 2 O 7H, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 ·가 7H 2 O, 1 dH보다 2 O를 추가 M9 버퍼 (47) (21 mMNa 2 HPO 4 · 회 (218 XG 분 1) 계란을 세척 L). </li><li> 그들이 20 ° C에서 / 부드러운 교반 O와 M9 버퍼에 N을 부화 할 수 있습니다. 웜 개발 동기화 모집단을 떠나고, 음식 공급원의 부재하에 L1 단계에서 정지한다. OP50 E. 시드 신선한 선충 성장 미디어 (NGM) 접시에 L1s로 이동 대장균 박테리아와는 자손이 원하는 나이 47까지 발전 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 50 바와 같이 현미경 슬라이드에 (H 2 O) 2 % 아가로 오스 패드를 준비한다. <ol><li> 두 마일 준비그들의 전체 길이에 걸쳐 배치 된 테이프와 라벨 croscope 슬라이드 스페이서로서 이용된다. 그들 사이의 제 3 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 깨끗한 슬라이드에 H 2 O 2 % 아가로 오스와 피펫 한 방울을 녹여. </li><li> 한천 드롭의 상단에있는 세 개의 다른 슬라이드에 수직 네 번째 슬라이드를 놓습니다. 조심스럽게 라벨 테이프와 같은 두께로 패드를 평평를 누르십시오. </li><li> 스페이서를 제거하고 부드럽게 떨어져 슬라이드를 당겨 전에 1 분 동안 말리면. 한천 패드는 그 중 하나에 충실합니다. </li></ol></li><li> 피펫 ~ 10 μL 마취 패드 및 전송 (2 밀리미터의 levamisole M9 버퍼) ~ 백금 와이어 픽업을 사용하여 10 동물. 커버 슬립 (~ 22 X 22mm)로 덮고 1 시간 내에서 이미지를 가져 가라. </li><li> 대안 적으로, 더 긴 시간 동안 영화를 취득하거나, 또한 동물의 움직임의 가능성을 감소 및 마취제 고정화 비드 (51)의 조합을 사용한다. <ol><li> 10 % AGA 준비(M9 버퍼) (51)을 설명하고 3 μL 나노 구체의 크기 표준 솔루션 웜 (폴리스티렌 비즈, 100 ㎚) 플러스 3 μL 마취제 (M9 버퍼에 4 밀리미터의 levamisole)를 추가로 패드를했다. 커버 슬립으로 가볍게 커버. 탈수를 방지하기 위해, VALAP (바셀린, 라놀린, 파라핀 왁스 같은 양의 혼합물)와 커버 슬립을 봉인. </li></ol></li><li> 이미지는 공 초점 현미경을 사용하여 웜을 고정. 주 : 결과 EM-CCD 카메라와 MetaMorph로부터 같은 현미경 자동화 및 이미지 분석 소프트웨어를 구비 한 스피닝 디스크 AF 공 촛점 현미경을 사용하여 획득하고 아래 구체적인 개요이지만, 다른 유사한 공 초점 영상 시스템도 사용될 수있다. <ol><li> 63X 또는 100X / 1.4NA 오일 목표를 사용하여 현미경 슬라이드 홀더에 웜을 포함하는 현미경 슬라이드를 놓습니다. </li><li> 소프트웨어를 엽니 다. MRFP 이미징을위한 레이저 파워 및 필터를 조정합니다. 10 %의 전력 및 배출 필터&gt; 600 nm에서 561 nm의 레이저를 사용합니다. </li><lI&gt; 열기 &quot;다차원 취득&quot;. &quot;메인&quot;탭에서, &quot;어 Timelapse&quot;과 &quot;실행 저널&quot;(: 오프 하드웨어 자동 초점)의 확인란을 선택합니다. </li><li> &quot;저장&quot;탭에서 선택하거나 파일을 저장할 디렉토리 폴더를 만듭니다. 파일에 이름을 지정합니다. </li><li> &quot;파장 길이&quot;탭에서 적절한 조명을 선택하고 노출과 이득을 조정합니다. 100 ~ 300 밀리 초 100과 300 사이의 카메라 이득 사이의 노출 &quot;YokoQuad 레드&quot;(또는 MRFP 이미징 동등한 조명 설정)을 사용하여, 각각의 샘플에 따라 (라이브 이미지를 사용하여 평가). </li><li> &quot;어 Timelapse&quot;탭에서 &quot;시점의 수&quot;= 301, &quot;시간&quot;= 5 분 &quot;시간 / 간격&quot;= 1 초를 선택합니다. </li><li> &quot;AFC SET의 Z의 HOLD&quot;와 &quot;Z의 HOLD에 AFC 반환&quot;유형 : &quot;저널&quot;탭을 선택 저널에서 &amp;# 8220; 특수 &quot;(2 회), 초기 점 :&quot;시작 시간의 점 &quot;과&quot;시점의 끝 &quot;. 이 옵션은 자동 초점 화상 장기간에 걸쳐 동일한 부분에 중요하다. </li><li> 설정을 완료 한 후 &quot;취득&quot;. 인터벌 동영상은 별도의 TIFF 파일로 세이프가 걸려있다. </li><li> ImageJ에 주어진 시계열의 모든 .TIFF 파일을 엽니 다. &quot;이미지&quot;→ &quot;스택&quot;→ &quot;스택에 이미지&quot;로 이동합니다. 선택적으로, → &quot;파일&quot;의 영화를 내보내기 등, 크기, 줄을 추가, 밝기 및 대비를 조정 → &quot;AVI ...&quot; &quot;다른 이름으로 저장&quot;(예를 들어, 비디오 1과 2는 그림 1에 해당하는 참조). </li></ol></li></ol> 2. 자율 및 비 세포 자치가 Proteostasis 및 독성에 미치는 영향 세포를 조사하기 위해 접는 센서 및 스트레스 기자 사용 <ol><li> 접이식 센서 또는 스트레스 reporte을 같이 발현 형질 전환 라인을 생성함께 프리온 같은 단백질과 R. 십자가를 설정하거나 유전자 변형 라인을 생성하는 방법에 대한 방법에 대해서는, 48,49,52를 참조하십시오. C.의 목록은 표 1을 참조하십시오 사용할 수있는 엘레 균주. </li><li> 형질 전환 동물의 동기 인구를 준비하고 (1.2 절) (50) 전술 한 바와 같이 원하는 세 때까지 성장합니다. </li><li> 실체 현미경을 사용하여 접는 센서 또는 스트레스 기자의 각​​각의 표현형을 확인합니다. <ol><li> 폴딩 센서, 동기 후의 각 날 응집체 은닉 동물의 수를 결정 (예컨대,도 2e 및 F 참조). </li><li> 스트레스 기자를 들어, 테스트 기자의 증가 형광 프리온 같은 단백질 결과의 동시 발현은 (예를 들어, 그림 3 참조)합니다. </li></ol></li></ol> C.에서 프리온에 의한 독성의 억제를위한 3 게놈 전체 화면 엘레<img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> RNAi의 심사 프로토콜의 4 도식 표현 그림. 각 단계에 대한 자세한 설명 프로토콜 (3)을 참조하십시오. <ol><li> C.의 동기화 엘레 웜과의 RNAi 라이브러리의 중복 <ol><li> RNAi의 화면의 경우, Ahringer의 RNAi 라이브러리 (또는 비달의 RNAi 라이브러리) 53, 54을 사용합니다. 10 % 글리세롤 보충 100 μl의 LB-A 미디어와 플레이트 (LB 50 ㎍ / ml의 암피실린)를 작성하여 96 웰 플레이트에 원래 384 웰 형식에서의 RNAi 라이브러리를 Rearray 및 96 핀 복제기를 사용하여 접종. -80 ° C에서 교반 및 저장 37 ° CO / N에서 성장. </li><li> C. 유지 엘레 WT 20 ° C NGM에 플레이트에서 형질 전환 라인은 OP50 E. 시드 표준 방법 (47)에 따라 대장균 박테리아. </li><li>표백에 의해 프리온 도메인 형질 전환 및 WT (제어) 선충을 동기화 (1.2 절 참조). </li><li> 웜이 표백되는 당일에, 50 ㎍ / ㎖의 앰피 실린이 보충 된 LB 매체를 준비한다. 분배하도록 자동 지급기 시약을 사용하여 (또는 수동 피펫)을 96 웰 플레이트의 각 웰에 LB-A 매체 65 μL. </li><li> -80 ° C에서 96 웰 Ahringer의 RNAi 라이브러리 플레이트를 제거하고 종이 타월로 줄 지어 멸균 후드에 가져. 즉시 플레이트가 계속 동결하는 동안 판의 외부에 얼음에서 오염되지 않도록주의하면서, 거꾸로 접시를 들고하여 밀봉 테이프를 제거합니다. 판을 Reinvert하고 약 30 분 동안 해동 수 있습니다. </li><li> 하나의 신선한 LB-A 플레이트에 다음 하나의 RNAi 라이브러리 플레이트에 한 멸균 96 핀 복제기를 찍어합니다. 각각의 판에 대한 신선한 무균 복제를 사용합니다. 접착 호일 테이프 모든 판을 밀봉 및 -80 ° C에 라이브러리 번호판을 반환합니다. 벌레는 표백제에 담가 세척 할 수있다,다시 사용할 수 있도록 멸균. </li><li> 중복 된 RNAi의 플레이트가 37 ° C, 300 rpm으로 설정 인큐베이터에서 O / N을 성장하도록 허용합니다. HT115 E.을 사용하려면 대장균 컨트롤로 빈 벡터 (L4440)를 숨겨 박테리아, 문화 관에 별도로 성장하고 두 개의 96 웰 플레이트의 1/4에 멀티 채널 피펫 문화의 65 μl를 피펫. </li></ol></li><li> 박테리아 dsRNA를 생산 및 웜의 첨가 유도 <ol><li> DDH 2 O.에 5 mM의 농도로 이소 프로필-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)를 희석 분배하도록 멀티 헤드를 사용하여 자동화 된 워크 스테이션 (또는 수동 피펫)의 RNAi 박테리아와 제어 플레이트의 각 웰에 희석 IPTG 10 μL. 다시 봉인 및 인큐베이터에 접시를 배치합니다. 이를 37 ℃에서 3 시간 동안 흔들어 보자. </li><li> 박테리아가 떨고있다 동안, 벌레를 준비합니다. 유리 현미경 슬라이드에 - (10 μL ~ 5) 작은 샘플을 잘 M9 / 웜 현탁액을 혼합하고, 피펫. 계산실체 현미경 벌레의 수와는 μL 당 벌레의 수를 계산한다. </li><li> 0.20 ㎎ / ㎖ IPTG, 8.0 ㎍ / ㎖의 콜레스테롤 50 ㎍ / ml의 암피실린, 9.6 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 0.0835 ㎍ / ml의 Fungizone을하며 : 무균 기술을 사용하여, 다음의 최종 농도로 보충 M9 (M9 +)의 용액을 제조 50 μL 당 15 벌레. <ol><li> 프리온 도메인 형질 전환 및 WT 웜에 대한 별도의 솔루션을합니다. 최종 (아래 참조)의 RNAi 복사 플레이트의 수에 의존 할 필요 M9 + 웜 용액의 부피, 플러스 ~ 자동 디스펜서가 사용되는 경우, 저장소 내에 남아 불감 부피의 30 ㎖. </li></ol></li><li> 박테리아 dsRNA를 생산의 3 시간 유도 한 후, 인큐베이터에서 접시를 타고 그들이 동물을 강조 열을 피하기 위해 RT (~ 30 분)으로 냉각 할 수 있습니다. </li><li> 각각의 RNAi 판 웰과 빈 벡터 제어 플레이트의 일 50 μL + M9 프리온 유전자 도메인 웜 용액을 분주한다. 확인동물 저장조의 바닥으로 침강하는 경향이 각 공정 전에 웜 용액을 혼합하여주십시오. </li><li> 제 2 제어 플레이트에 WT 웜을 분배. 포기를 할 수 있도록 봉인 판을 둡니다. 5 접시를 함께 젖은 종이 타월 및 알루미늄 호일로 포장 - 증발에서 액체 문화를 유지하기 위해, 4 스택. 4 일 동안 20 ° C에서 200 rpm으로 품어. </li></ol></li><li> 점수 참고 : 인큐베이터 4 일 후, 웜은 성인의 두 번째 날에하고 화면 준비가됩니다. 동물이 방해받지 래싱을 보장하기 위해 심사 전에 30 분 동안 비 흔들어 조건을 조정할 수 있습니다. <ol><li> 제어 처리 프리온 도메인 형질 전환 동물에 비해 증가 탈곡 육안 모니터 화면 컴퓨터에 접속 된 콘 4M60 카메라를 사용. </li><li> wrMTrck를 사용하여 확인하는 예비 히트 곡의 목록을 컴파일 (다음 절 참조). </li></ol></li></ol> 예비 4. 확인화면 조회수 <ol><li> 고체 접시에 운동성 분석 <ol><li> 표준 방법 (47)에 따르면, 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린, 12.5 ㎍ / ㎖의 테트라 사이클린 및 1 mM의 IPTG로 보충 NGM와 접시를 준비합니다. 가능하다면, 모든 플레이트가 유선형 영상 획득 과정을 허용 할 미디어의 동일한 높이를 가질 보장 플레이트 주출 기계를 사용한다. </li><li> 37 ° C, 250 rpm에서 ~ 1 ML의 LB + 50 ㎍ / ㎖의 앰피 실린, O / N의 다른 RNAi의 클론 성장. </li><li> 다음날, 3 시간 동안 1 mM의 IPTG로하는 dsRNA의 발현을 유도한다. 얇은 층으로 확산 각각의 RNAi 세균성 클론의 150 μL와 접시를 시드. 어둠 속에서 실온에서 2 일간 건조 박테리아를 보자. RNAi의 클론 당 3 판을 준비합니다. </li><li> 표준 방법 (50) (1.2 절 참조)에 따라 표백하여 웜 인구를 동기화하고, 알이 부화의 O / N M9 미디어를 할 수 있습니다. </li><li> 웜 현탁액을 샘플 및 NEM의 양을 결정실체 현미경에서 μL 당 atodes. 30 L1 웜 -가 (25)가 포함되도록 그런 다음, 각 실험 플레이트에 M9 플러스 웜의 적절한 볼륨을 피펫. 벌레가 성년의 날 2에 도달 할 때까지 4 일 동안 20 ° C에서 선충 성장. </li></ol></li><li> ImageJ에 대한 wrMTrck 플러그인과 웜 운동의 정량 분석 참고 : 비디오는 하마 오카-R2 디지털 카메라 C10600-10B와 하마 마츠 간단한 PCI 이미징 소프트웨어의 10 배 배율로 실체 현미경을 사용하여 기록 하였다. <ol><li> 카메라와 간단한 PCI 이미징 소프트웨어를 켭니다. 이미징 조건의 조정을 허용하기 위해 &quot;라이브&quot;를 클릭합니다. </li><li> 다음 영상 조건을 설정 : 게인 = 0; 라이트 모드 = 높은; 속도 지수 = 1; 비닝 = 2. &quot;자동 노출&quot;다음 현미경 거울과 밝기 및 대비 다이얼을 이동, 조명 조건을 조정합니다. 참고 : 비디오는 overexp없이 높은 대비가 필요동물 밝은 배경으로 검은 모양을 나타나도록, osed. </li><li> &quot;시간 스캔&quot;을 클릭하고 폴더와 파일 이름을 선택합니다. 20 밀리 초에 &quot;필드 지연&quot;을 설정하고 30 초에 &quot;시간에 정지&quot;. (대부분의 웜이 어디에) 기록하는 판의 영역을 선택하기 위하여 눌러 &quot;라이브 리뷰&quot;. 보기 &quot;시작&quot;을 누릅니다 분야에서의 위치를​​ 확인 빨리 무대에있는 플레이트에 3 ~ 4 번을 누릅니다. </li><li> 동영상 촬영을 마친 후, 오른쪽 이미지를 클릭 .AVI에 .cxd 형식에서 동영상을 내보낼 &quot;수출 몽타주 시퀀스&quot;를 선택합니다. </li></ol></li><li> 운동성 비디오를 분석한다 <ol><li> , ImageJ에 소프트웨어를 열고 &quot;플러그인&quot;탭으로 이동 한 다음 &quot;wrmtrck을&quot;과 &quot;wrMTrck 배치&quot;를 선택합니다. 모든 파일이 들어있는 디렉토리를 선택 분석합니다. </li><li> Figur에 자세히 wrMTrck_Batch의 기본 입력 창에 입력 된 값을로드전자 5C. 각 매개 변수에 대한 설명은 플러그인을 동반 지침에서 찾아 볼 수있다. &quot;OK&quot;를 클릭하고 이동 분석을 실행 할 수 있습니다. </li><li> 결과를 보좌 신부와 감지 된 모든 트랙이 실제 C.에서하는 것을 확인하기 위해 엘레 및 아티팩트 제거, 각각의 동영상에 대해 생성 .txt 파일들 각각을 열고 데이터 분석 소프트웨어 파일에 정보를 복사한다. 만든 &quot;* _labels.zip&quot;파일을 열고 수동으로 확인하고 거짓 웜 트랙을 제거하는 결과 &quot;*의 _labels.tif&quot;를 실행합니다. </li></ol></li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

여기에 설명 된 방법은 확산 예시 도와 같은 프리온 단백질의 조립 전지 자율 및 비 독성 세포 자율. 우리는 최근에 집계가 발생하기 쉬운 세포질 프리온 도메인이 자식 작용과 관련된 과정에 막 결합 소포로 흡수되는 것을 발견했다. 이러한 소체의 특정 서브 세트 내에서 세포 및 조직과 40 사이 프리온 도메인을 수송한다. 살아있는 동물에서의 움직임을 모니터링하는 키는 단백질 만 MRFP ...

알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전염성 해면상 뇌증 (TSEs)를 포함한 많은 신경 변성 질환, 응집하기 쉬운 단백질과 연관되어 있고, 따라서 집합 적 단백질 미스 폴딩 장애 (즉 PMD라고도 ). 그들은 모두 인간과 동물 (1)에 감염 될 수 있다는 점에서 TSEs 또는 프리온 질병은 PMD를 독특한 클래스를 구성한다. 분자 수준에서, 프리온은 모집 및 병리학 적 β-시트 풍부한 PRP 사우스 캐롤라이나 형태 2,3에 단량체 α 나선이 풍부한 호스트 인코딩 세포 PRP (PRP C)를 변환하여 복제합니다. 자체 전파 단백질 응집체는 포유 동물의 프리온 4,5으로 중요한 특성을 공유 곰팡이에서 확인되었다. 또한 프리온은 포유류 세포 간에서 이동할 수 있으며 6,7 나이브 세포를 감염. 즉 PMD의 OTH 동안어 TSEs는 전염성이없는 것보다, 그들은 프리온 질환 8,9와 공통 병원성 원칙을 공유 할 수 있습니다. PMD를 각각에 연결된 단백질 구조 또는 기능에 관련되지는 않지만, 그들은 결정화와 같은 과정을 통해 모든 형태의 집계는 핵이라고 또는 중합 시드; 또한 단백질 씨는 수용성 이소 2,10,11 모집에 의해 성장한다. 자기 전파 효율이 함께 같은 분자 샤페론 같은 추가적인 요인 궁극적으로 세포 집합체 핵 시딩 단편화 및 12-15의 확산 속도를 결정하는 단백질의 고유 특성에 따라, 생체 내에서 변화한다. 따라서, 단백질 응집을 효율적으로 전파 할 수 있습니다 이러한 요인들 사이에서 좋은 균형이 존재해야한다. 일부 아밀로이드 응집체가 프리온의 특성을 항구, 따라서 모든 PMD가이 전염성이있는 이유도 설명 할 수 있습니다. 프리온은 &#39;최고의 공연&#39;O를 대표하는 것그들에게 PMD가 8, 13을 연구 할 수있는 강력한 도구를 만드는 자기 복제 단백질 집합체의 FA 다양한 스펙트럼. 흥미롭게도, 질병 관련 집계와 관련된 독성은 종종 비 셀 자율적 인 구성 요소 (16, 17)이있다. 이것은 그들이 단지 세포 유전자 전시에게 특정 표현형을 발현하는 것을 의미 엄격 셀 자율적 효과와는 달리, 해당 유전자를 발현하지 않는 인접 셀에 영향을 미치는 것을 의미한다. 이것은 강력하게 조직 - 특이 적 발현에 의해 증명 또는 신경 퇴행성 질환 18 ~ 26의 다양한 모델의 각 단백질의 노크했다. 다양한 메커니즘 점감 영양 공급, 신경 신호 불균형, 글루타메이트 흥분 독성 (excitotoxicity), 및 신경 염증 16,27,28 포함 PMD가이 비 - 자율적 인 세포 독성의 기초로 제안되어왔다. 또한, 질환 세포 간의 결합 된 응집체의 프리온 같은 운동 might이면 (29, 30)에 기여한다. 증가 증거는 프리온이 아닌 다른 단백질 흠이 특성은 여러 가지 PMD 30-36에서 관찰되는 병리의 확산을 설명 할 수있는 세포 간에서 송신 할 수 있음을 시사한다. 그러나, 아직 질환 단백질의 세포 내 이동 및 이웃 셀에 대한 독성 효과 사이의 명확한 인과 관계가 있는지를 판정해야한다. 따라서, 셀 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 기초 세포질 통로의 더 나은 이해는 신규 치료법의 개발이 필요하고 필수적이다. 그러나, 후생 동물에 잘못 접힌 단백질의 세포 간 전송에 영향을 미칠 확산 및 세포 인자 프리온 등의 여러 측면이 아니라 생명체의 수준에서, 특히 이해되지 않습니다. 예쁜 꼬마 선충 선충은 잠재력을 제공하는 몇 가지 장점이 있습니다 프리온 같은 spreadi의 새로운면을 발견후생 동물 17 ng를. 이는 생체가 생체에서의 형광 태그로 단백질을 추적 가능 투명하다. 또한, 질병에 의해 영향을받는 많은 세포 및 생리 학적 과정은 인간에 웜으로부터, 그리고 C.된다 엘레 또한 유전자 조작 및 분자 생화학 적 분석 37 ~ 39의 다양한 의무입니다. 정확히 959 체세포는 여전히 근육, 신경 및 대장 등 여러 가지 별개의 조직 유형을 가지고 간단한 몸 계획을 가지고있는 성인 자웅 동체를 구성합니다. C. 새로운 프리온 모델을 설정하려면 엘레, 우리는 벌레 4,40에는 알려진 내생 프리온 단백질이 없기 때문에 외생 적, 잘 특징 글루타민 / 아스파라긴 (Q / N) 세포질 효모 프리온 단백질 Sup35의이 풍부한 프리온 도메인 NM을 표현하기로 결정했습니다. 효모 프리온은 프리온 복제 41 ~ 44의 기본 메커니즘을 밝히는데 귀중한왔다. 또한, NM은 전나무이다포유 동물 세포 배양 물 45, 46에서 프리온의 전체 라이프 사이클 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 세포질 성 단백질 프리온 등. 마찬가지로, C로 표시 할 때 엘레, 미토콘드리아 무결성 및 외관의 중단을 포함하여 40. NM 집계가 깊은 독성 표현형와 관련이 효모 세포 프리온 생물학의 전시 주요 기능에 비해 후생 동물 세포에서의 전파에 대한 다양한 요구 사항에 매우 잘 채택 Sup35 프리온 도메인 세포 수준과 관련된 다양한 자식 작용 소체뿐만 아니라 배아와 유충 마비, 발달 지연과 유기체 레벨에 단백질 접힘 환경 교란 광범위. 놀랍게도, 프리온 도메인 유전자가 발현되지 않은 인접 조직에 영향을 미치는 세포 자율 및 비 자율 세포 독성을 나타낸다. 또한, 내부 및 셀간 프리온 도메인 소낭 수송 실시간 모니터링된다 &lt;EM&gt; 생체 (40). 여기에서 우리는 C.에서 프리온 등의 보급을 검사하는 방법에 대해 설명합니다 엘레. 우리는 시간 경과 형광 현미경을 이용하여 프리온 도메인을 함유 소포 인트라 및 세포 간 수송을 모니터링하는 방법을 설명 할 것이다. 우리는 조직 - 특이 폴딩 센서의 사용을 강조 편재 셀룰러 니스에 셀 자율 및 비 자율 셀에 미치는 효과를 평가하기 위하여, 응력 기자를 표현한다. 마지막으로, 우리는 프리온 - 유도 독성의 새로운 개질제를 식별하기 위해 최근에 수행 넓은 게놈 RNA 간섭 (RNAi의) 화면의 순서를 설명한다. 조합, 이러한 방법은 단백질의 세포 간 이동 및 그 이외의 세포 자율 독성에 관여하는 유전 적 경로를 떨어져 애타게하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="665">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Reagent</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Nanosphere size standards 100 nm</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">3100A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Levamisole</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">L-9756</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">IPTG</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td style="width:92px;">15502-10G</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Ahringer RNAi library</td>
			<td style="width:107px;">Source BioScience LifeSciences&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.lifesciences.sourcebioscience 
			.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Equipment</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC</td>
			<td style="width:107px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:92px;">75004521</td>
			<td style="width:255px;">http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ 
			XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 
			VAC/EW-17707-60</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">96 pin replicator&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Scionomix&#160;&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">HiGro high-capacity, incubating shaker&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Digilab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.digilabglobal.com/higro</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Multidrop Combi Reagent Dispenser&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Titertrek</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Biomek FX AP96 Automated Workstation&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;width:211px;">Innova44 shaker</td>
			<td style="width:107px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&#38;pb=d78efbc05310ec 
			04&#38;action=products&#38;contentid=1&#38; 
			catalognode=83389</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">M205 FA&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera</td>
			<td style="width:107px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:211px;">Spinning Disc AF Confocal Microscope&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Leica</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">Falcon 4M60 camera&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Teledyne Dalsa&#160;</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">Software</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">MetaMorph Microscopy Automation &#38; Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software</td>
			<td style="width:107px;">Meyer Instruments</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">ImageJ</td>
			<td style="width:107px;">NIH</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">wrMTrck plugin for ImageJ</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:211px;">C. elegans strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:211px;">N2 (WT)</td>
			<td style="width:107px;">Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">AM815&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td>
			<td style="width:107px;">Morimoto lab</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;">available from our laboratory&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:211px;">See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism c. elegans

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer&#8217;s disease (AD), Parkinson&#8217;s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

생체 시간 경과 영상에 의해 프리온 같은 단백질의 확산 세포 간 모니터링 형질 전환 C. 프리온 도메인을 발현 간스 라인 형상의 프리온 단백질, 예를 들면 세포 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 특정 양상의 분석에 특히 적합하다. 수의 형광 추적 동물의 투명성은 삶의 모든 단계에서 생체 내에서 단백질을 태그. 이것의 활용, 세포 형광...

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Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

후생 동물 모델 생물을 사용하여 확산 및 독성 프리온 같은 단백질을 조사<em&gt; C. 엘레</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

investigating-spreading-toxicity-prion-like-proteins-using-metazoan

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

15.7K 조회수.  Northwestern University. Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

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Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale. This complex process requires the coordinated activity of many pre- and post-synaptic proteins to ensure appropriate synaptic connectivity, conduction of electrical signals, targeting and priming of secretory vesicles, calcium sensing, vesicle fusion, localization and function of postsynaptic receptors and finally, recycling mechanisms. As neuroscientists it is our goal to elucidate which proteins function in each of these steps and understand their mechanisms of action. Electrophysiological recordings from synapses provide a quantifiable read out of the underlying electrical events that occur during synaptic transmission. By combining this technique with the powerful array of molecular and genetic tools available to manipulate synaptic proteins in C. elegans, we can analyze the resulting functional changes in synaptic transmission. 
The C. elegans NMJs formed between motor neurons and body wall muscles control locomotion, therefore, mutants with uncoordinated locomotory phenotypes (known as unc s) often perturb synaptic transmission at these synapses 1. Since unc mutants are maintained on a rich supply of a bacterial food source, they remain viable as long as they retain some pharyngeal pumping ability to ingest food. This, together with the fact that C. elegans exist as hermaphrodites, allows them to pass on mutant progeny without the need for elaborate mating behaviors. These attributes, coupled with our recent ability to record from the worms NMJs 2,3,7 make this an excellent model organism in which to address precisely how unc mutants impact neurotransmission. 
The dissection method involves immobilizing adult worms using a cyanoacrylic glue in order to make an incision in the worm cuticle exposing the NMJs. Since C. elegans adults are only 1 mm in length the dissection is performed with the use of a dissecting microscope and requires excellent hand-eye coordination. NMJ recordings are made by whole-cell voltage clamping individual body wall muscle cells and neurotransmitter release can be evoked using a variety of stimulation protocols including electrical stimulation, light-activated channel-rhodopsin-mediated depolarization 4 and hyperosmotic saline, all of which will be briefly described.

Application of electrophysiology to accessible synapses provides a quantifiable measure of synaptic activity, useful in analyzing synaptic mutants. This article describes a dissection method used to expose the neuromuscular junctions (NMJ) of Caenorhabditis elegans (C. elegans) and briefly discusses some of the uses to which this preparation can be applied.

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

에서 Hypoxia의 효과를 연구하기 위해 정의된 기체 환경 만들기<em&gt; C. elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

선충류의 바디 크기 규정에 참여 유전자에 대한 화면으로 RNA로 인한 간섭 수유 전략을 사용하여<em&gt; C. elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

To stain C. elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be bypassed by chemical or mechanical methods. "Freeze-cracking" is one method used to physically pull the cuticle from nematodes by compressing nematodes between two adherent slides, freezing them, and pulling the slides apart. Freeze-cracking provides a simple and rapid way to gain access to the tissues without chemical treatment and can be used with a variety of fixatives. However, it leads to the loss of many of the specimens and the required compression mechanically distorts the sample. Practice is required to maximize recovery of samples with good morphology. Freeze-cracking can be optimized for specific fixation conditions, recovery of samples, or low non-specific staining, but not for all parameters at once. For antibodies that require very hard fixation conditions and tolerate the chemical treatments needed to chemically permeabilize the cuticle, treatment of intact nematodes in solution may be preferred. If the antibody requires a lighter fix or if the optimum fixation conditions are unknown, freeze-cracking provides a very useful way to rapidly assay the antibody and can yield specific subcellular and cellular localization information for the antigen of interest.

Antibody Staining in C. Elegans Using &quot;Freeze-Cracking&quot;

"Freeze-cracking," a method for exposing the inner tissues of the nematode C. elegans to antibodies for protein localization, is demonstrated.

항체 염색법에<em&gt; C. 엘레</em&gt; &quot;동결 크래킹 사용&quot;

To stain C.  elegans with antibodies, the relatively impermeable cuticle must be  bypassed by chemical or mechanical methods.  "Freeze-cracking" is one ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

허혈 / 재관류에 대한 산소 결핍 - 기아 모델<em&gt; C. 엘레</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis (diguanylate cyclases) and degradation (phosphodiesterases) of the second messenger c-di-GMP. In contrast, little information is available regarding the molecular mechanisms and cellular components through which this signaling molecule regulates a diverse range of cellular processes. Most of the known effector proteins belong to the PilZ family or are degenerated diguanylate cyclases or phosphodiesterases that have given up on catalysis and have adopted effector function. Thus, to better define the cellular c-di-GMP network in a wide range of bacteria experimental methods are required to identify and validate novel effectors for which reliable in silico predictions fail.
We have recently developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS) based technology as a powerful tool to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins. This technique has previously been reported to be applicable to a wide range of organisms1. Here we give a detailed description of the protocol that we utilize to probe such signaling components. As an example, we use Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen in which c-di-GMP plays a critical role in virulence and biofilm control. CCMS identified 74% (38/51) of the known or predicted components of the c-di-GMP network. This study explains the CCMS procedure in detail, and establishes it as a powerful and versatile tool to identify novel components involved in small molecule signaling.

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.