크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1 1. 재질 설정 <ol><li> 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다. </li></ol> 8P 접시 조리법 : 3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4, 30g의 KH 2 PO 4, 산도 6.00) 25 ㎖. 10cm 배양 접시 (25 ㎖ / 플레이트)에 액체 한천 배지를 붓는다. <ol start="2"><li> 다음날 NA22 E. 1 ㎖로 농축 각 펩톤 한천 판의 표면 전체에 확산 2XYT 미디어 (16g 트립 톤, 10g의 효모 추출물, 멸균, 산도 7.0의 1 L에 5g의 NaCl) 37 ° C에서의 대장균 밤새 배양 이러한 박테리아는 임신하는 인원수 다량의 성장을지지하는 두꺼운 층을 형성 할 것이다 풍부한 음식 소스를 구성한다. 박테리아의 성장을 할 수 있도록 실온에서 하룻밤 시드 판을 둡니다. 이 과정은 4 ~ 5 시간 동안 37 ° C에서 배양에 의해 가속 될 수있다. </li><li> 시드 8P 접시에 굶주린 동물을 전송합니다. 5-6 M9 버퍼 또는 ㎖의 물을 사용하여 굶주린 NGM 플레이트를 동물을 씻어 각 8P 판에 현탁액의 1-2 ML을 추가합니다. </li><li> 동물의 성장과 증식이 UNT 허용일리노이 플레이트를 임신하는 성인에 의해 합류에 채워집니다. </li><li> C.의 제조에 필요한 달걀을 분리 용해 액의 5-6 ML을 사용하여 임신하는 성인의 배아 세포를, 엘레. </li></ol> 용해 액 레시피 신선한 표백제의 5 ㎖, 10 N NaOH를 1.25 ㎖의 멸균 H 2 O의 18.5 ML 이 혼합물을 사용하기 전에 매번 신선한 준비해야합니다. <ol start="6"><li> 계란 버퍼를 사용하여 임신하는 성인으로부터 격리 계란을 세척 : </li></ol> 계란 버퍼 레시피 118 밀리미터의 NaCl, 48 mM의 KCl을, 2 MM의 염화칼슘, 2 mM의 MgCl2를, 25 mM의 헤 페스, pH가 7.3, 삼투압이 340 mOsm. <ol start="7"><li> 키틴으로 처리하여 계란을 둘러싼 껍질을 제거합니다. 키티 나제는 산성 pH 25에서 가장 높은 활성을 가진 효소이다. 2 ㎎ / ㎖의 최종 농도 달걀 버퍼 pH를 6.5로 키티 나제 (시그마, 카탈로그 없음. C6137)을 녹인다. 키티 나제 주식을 저장멸균 15 ML 원뿔 튜브에 1 ㎖ 분량 씩 -20 ° C에서 솔루션을 제공합니다. 분취 량은 몇 개월 -20 ° C의 최대 저장할 수 있습니다. </li><li> C. 성장한다 땅콩 렉틴으로 덮여 멸균 커버 슬립 (12mm 직경)에 elegans의 배양 세포. 멸균 (0.5 ㎎ / ㎖)에 땅콩 렉틴을 녹입니다. 땅콩 렉틴 용액을 여과 또는 멸균 할 수 없습니다. 또한 UV 광으로 처리 될 필요가 없다. 최대 6 개월 -20 ° C에서 보관 2 ㎖ 씩 분주. </li><li> 완전한 세포 배양 배지 (500 ml)을 깁코, 50 ㎖ 태아 혈청 (열 불 활성화), 19.5 g의 수 크로스 (45 mOsm), 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg 5 ㎖ /부터 500 ㎖ L-15 배지가 포함 ml의 스트렙토 마이신 (2 %). 완전 배지는 다음 0.20 μm의 기공 필터를 사용하여 필터링된다. </li></ol> 계란 버퍼와 배지를 각각 340의 삼투압이 345 mOsm을 가지고 있습니다. 실제로, 포유 동물 세포에 반대, C. 엘레 세포는 비교적 높은 삼투압을 가지고즉, 세포의 세포막과 직접 접촉 할 수있는 솔루션을 준비 할 때 카운트 고려 될 필요가있다. 이러한 시약의 조리법 osmometer 하나를 사용하여 측정 하였다 원하는 삼투압에 도달하도록 조절 하였다. 이들 레시피를 정확히 따르는 손질 이들 시약의 제조에 사용되는 경우 osmometer를 사용할 필요가 없다. 다른 솔루션은 그 조리법 여기에보고되지 않습니다 또는 C를 사용하는 게시의 경우에, 준비해야하는 경우, 하나는 osmoter를 사용한다 배양 된 세포 엘레 간스. 2. 계란 격리 <ol><li> 그것은 (24 - 웰 플레이트에서) 배양 된 세포의 12 우물에 충분한 계란을 수집하기 위해 적어도 네 8P 플레이트로 시작하는 것이 좋습니다. </li><li> 절차를 시작하기 전에 땅콩 렉틴 원액 한 튜브를 해동. 24 웰 플레이트의 우물의 바닥에 멸균 커버 슬립을 놓고 커버 슬립에 땅콩 렉틴의 200 μl를 추가합니다. 1 시간 또는 u 품다그리로 갈때 세포는 도금 될 준비가 된 것입니다. 완전히 땅콩 렉틴을 제거하고 멸균 멸균 물 1 ㎖로 한 우물을 씻어. 커버 슬립의 땅콩 렉틴의 완전한 제거는 세포의 응집을 방지하는 데 필수적이다. </li><li> 멸균 멸균 물을 사용하여 한천 플레이트 떨어져 임신하는 성인을 씻으십시오. 두 멸균 원뿔 50 ML 튜브로 현탁액을 수집합니다. 튜브 (*)의 하단에있는 벌레의 강수량을 할 수 있도록 최대 5 분 동안 얼음에 튜브를 남겨주세요. 전송 플라스틱 피펫으로 물을 제거하고 신선한 멸균 멸균 물을 교체합니다. 200 XG 10 분 (~ 1,200 RPM) (*)에서 테이블 탑 원심 분리하여 웜 펠렛. 적어도 3이 마지막 단계를 반복합니다. </li><li> 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 웜을 전송하고 200 XG에 10 분 동안 (~ 1,200 RPM) (*)에 그들을 펠렛. 뿐만 아니라 튜브의 하단에있는 박테리아를 수집하지 않도록하기 위해 더 높은 원심 분리 속도를 사용하지 마십시오. 때로는 centrifugations 후 벌레가 완전히 펠렛되지 않습니다. AF터 각 세척 및 제거하기 전에 상층 액을 얼음에 5 분 동안 튜브를 놓습니다. 식힌 물 웜 튜브 바닥에 침전. </li><li> 물을 제거하고 용해 액의 5 ~ 6 mL를 넣고 (재료가 설정 참조). 5 ~ 10 분 동안 부드럽게 정지 록하고 매 2-3 분 실체 현미경을 이용하여 웜 용해 모니터링을 시작합니다. 현탁액의 방울은 쉽게 검사 용 커버 슬립 상에 배치 될 수있다. 배양 시간은 표백제의 신선도에 따라 달라집니다, 표백제의 작은 병을 구입하고 매월 새로운 병을 엽니 다. </li><li> ~ 웜 70 ~ 80 %의 (배양 시작부터 10 분)를 용해하는 경우, (재료가 설정 참조) 계란 버퍼 산도 7.3의 9 ML을 추가하여 용해 반응을 중지합니다. 10 분 동안 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 현탁액을 원심 분리기. 계란 (*)의 재 오염을 방지하기 위해 벤치에 분젠 버너를 가지고이 시점에서. </li><li> 조심스럽게 멸균 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거하고 펠렛 3-4 씻어용액을 명확 X 달걀 완충액까지. 각 세척하는 동안 알 버퍼에 펠릿 잘 혼합해야합니다. </li><li> 계란 30 % 수크로오스 용액을 사용하여 동물 사체로부터 분리된다. 살균 계란 버퍼의 2 ㎖에 펠렛을 재현 탁 2 ML 60 % 자당 용액 (살균 계란 버퍼의 주식을)를 추가합니다. 잘 섞어 200 XG (~ 1,200 RPM) (*)에서 20 분 동안 원심 분리. </li><li> 조심스럽게 원심 분리기에서 튜브를 제거합니다. 계란은 솔루션의 상단에 떠있다. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용, 신선한 멸균 15의 ML 원뿔 튜브에 모든 달걀을 전송합니다. </li><li> 10 분 200 XG (~ 1,200 RPM)에서 튜브와 원심 분리기에 살균 계란 버퍼 10 ML을 추가합니다. 세척 3 X를 반복합니다. 계란이 완전히 각 세척하는 동안 알 완충액되어 있는지 확인하십시오. </li></ol> 3. 배아 세포 해리 층류 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 과정의 다음 단계를 실시한다. 동물은 있지만모든 박테리아하지 않을 경우 대부분 제거해야 세균 플레이트, 세척 및 표백제가 포함 된 용해 용액으로 처리에 가운. 따라서 과정의이 시점에서 층류 후드를 사용하는 달걀 현탁액의 새로운 오염을 방지한다. <ol><li> 2 ㎎ / ㎖ 키티 나제 (계란 버퍼의 pH 6.5 (*) 재고) 1 ㎖에 계란 펠렛을 재현 탁하고 새로운 멸균 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 실온에서 10-30 분 동안 튜브를 흔들어. 정확한 배양 시간은 효소와 실내 온도의 신선도에 따라 변화하고, 따라서 각각의 제조에 대해 결정되어야한다. 그것은 배양 10 분 후 반전 된 세포 배양 현미경으로 계란을 모니터링을 시작하는 것이 좋습니다. 참고 : 우리의 경험에서, 낮은 pH는 키티 나제 효소의 활동을 증가시킨다. 이러한 이유로 우리는 키티 나제 (pH를 수산화 나트륨을 사용하여 6.5로 조정 위에서보고 레시피를) 용해 pH가 6.5에 달걀 버퍼를 사용합니다. </li><li> ~ 달걀 껍질의 80 %가 소화 될 때키티 나제 치료 (그림 1 AB)는 900 XG 3 분 (~ 2,500 RPM) (*)에서 원심 분리하여 계란 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 뜨는을 제거하고 L-15 배지 3 ㎖ (*)를 추가합니다. </li><li> 6cm 직경 플레이트에 달걀을 전송하고 부드럽게 18 G 바늘을 구비 한 10 ㎖ 멸균 주사기를 사용하여 세포를 해리. 신선한 플라스틱 페트리 접시에 현탁액 드롭을 배치하고 현미경으로 보면 해리도를 모니터한다. 손상 세포를 방지하기 위해이 절차를 수행하는 동안 주사기로 공기를 흡인하지 마십시오. 세포의 80 %가 분해됩니다 ~까지 해리를 계속합니다. </li><li> 살균 5 μm의 밀리 포아 필터를 사용하여 현탁액을 필터링합니다. 세포 현탁액은 세포 덩어리, 소화되지 않은 계란과 부화 유충을 제거하기 위해 필터링해야합니다. 모든 세포를 복구하기 위해 필터를 통해 신선한 L-15 미디어의 추가 4 ~ 5 ㎖의 필터. DA을 방지하기 위해 여과 단계에서 과도한 힘을 사용하지 마십시오필터 및 / 또는 세포를 maging. </li></ol> 4. 세포를 배양 <ol><li> 3 분 (*) 900 XG (~ 2,500 RPM)에서 원심 분리하여 해리 세포 펠렛. P1000의 피펫 멸균 팁을 사용하여주의 깊게 뜨는을 제거합니다. 전체 L-15 중간 플레이트 1 ML / 잘 펠렛 세포를 Resuspend. 첨가 매체의 사용량은 8P 플레이트의 개수, 접시에 웜의 합류 및 셀에 대해 수행 될 실험의 유형에 따라 달라진다. 세포 밀도는 혈구 계를 사용하여 측정 할 수있다. ~ 230,000 셀 / ㎠가 최적의 밀도를 도금 패치 클램프 녹음하십시오. </li><li> 배양액의 증발을 방지하기 위해 젖은 종이 타월을 함유 플라스틱 섬유 복합 재질 용기에서 24 웰 플레이트를 유지한다. 20 ° C와 주위 공기에 가습 인큐베이터에서 컨테이너를 저장합니다. </li><li> 세포는 보통 24 시간 이내에 실험을위한 준비가되었을 때 형태 학적 분화와 표현GFP 마커의 이온이 완료됩니다. 세포는 최대 2 주 동안 문화 유지 될 수 있지만, 도금 후 보통 7-9일까지 대부분의 건강. 매체는 건강한 세포를 유지하기 위해 하루에 한 번 교체해야. </li></ol>

C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세...

예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (&gt; 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 </EM&gt; 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사 <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). 많은 장점에도 불구하고, 몇 가지 실험 방법은 C에 도전 한 엘레. 이러한 조직 또는 세포 유형의 세포 및 아이솔레이션의 원형질막에 액세스를 필요로하는 것들을 포함한다. 실제로 C. 엘레 조직은 쉽게 효소 처리 또는 세제에 의해 소화되지 않는 그 압력 수압 골격 내에 국한된다. 1990 년대 말에 미리 암 굿맨과 자넷 리치먼드 C.의 전기 생리학 녹음하는 방법을 개척 엘레현장 9,10에있는 신경 세포와 근육 세포. 이러한 방법은 우리에게 신경 및 생체 내에서 근육의 기능에 중요한 통찰력을 준 반면, 도전과 낮은 처리량이다. 생체 내에서 세포의 기능을 연구하는 다른 방법은 대부분, 특히 같은 GCamP과 카멜레온 11-13로 유전자 인코딩 칼슘 센서를 사용하여 생체 내 칼슘 이미징, 개발했다. 그들이 그대로 살아있는 동물에 적용되기 때문에 이러한 방법은 그러나, 약리학 적 도구의 사용을 허용하지 않는다. 배양 C.의 첫 번째 시도 대규모 체외에서 elegans의 세포는 자신의 박사 학위 논문 (14)의 준비 기간 동안 레어 꽃에 의해 만들어졌다. 불행히도, 어려움이 기판에 세포 접착 불량으로 발생한 불량 세포 분화 및 생존은 강력한 세포 배양 방법으로 초기 프로토콜의 설립을 방지. 1995 년 에드가와 동료 절차를 출판단일 C의 분리 및 배양 세포 분열 형태 형성을 알아보고자 하였다. 엘레 15 배아. 효소 처리 및 수동 해리의 조합으로 달걀 껍질의 소화하여 얻은 배아 세포는 ~ 500 세포를 15까지 생산, 증식을 계속했다. 그 후, 양조위와 동료 장 형태 형성을 연구하는 할구의 작은 숫자를 배양. 그들은 하나의 체외 격리 E의 할구가 혀끝있는 adherens 접속점 (16)를 통해 서로 상호 작용에 의해 장 루멘과 유사한 구조를 만든 편광 장 세포를 생산 것을 보여 주었다. Buechner와 동료는 또한 배양 C에 대한 유사한 방법을보고했다. 관내 17 배아 세포 엘레 간스. 초기 작업을 바탕으로, 크리와 동료 배아 C를 배양하기위한 강력한 프로토콜을 개발했다. 엘레 체외 1 세포. 그들그 고립 C를 보였다. 엘레 세포는 다양한 세포 유형으로 분화 및 세포 특정 마커의 발현을 포함하여 그들은 생체 내에서 소유 기능을 유지할 수있다. 생체 내에서 도전하고 몇 가지 기술, 절연 C.에 적용 할 수 있습니다 배아 세포 엘레 간스. 이러한 전기 생리학 1,18 19, 이미징 및 면역 화학적 방법 (20, 21)뿐만 아니라, 세포의 특정의 cDNA 라이브러리 (22, 23)의 건설 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 특정 세포 유형의 격리 (가) 있습니다. 이러한 RNA 간섭 (RNAi의)와 같은 유전자 녹다운 (knockdown) 기술은 배양 된 C.에 적용 할 수 있습니다 엘레 셀 1 및 당 단백질 발견을위한 도구로서 아지 설탕을 사용한 신규 한 대사 표지 방법은 최근 체외 배양 C. 개발되었다 엘레 세포 24. 결론적으로, 세포 배양 방법은 어레이 O를 앞서C.에 적용 할 수있는 F 기법 살아있는 유기체의 컨텍스트에서 유전자 기능을 해독하기위한 노력의 elegans 모델. 우리는 C.를 배양 여기 프로토콜을 설명 주로 첫 번째 크리스티안와 동료 1에 기술 된 프로토콜을 기반으로 체외에서 배아 세포 엘레 간스.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 ​​초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.

C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레 크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의&gt; 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 ...

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A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.

배아 배양하는 방법<em&gt; C. 엘레</em&gt; 셀

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.4K 조회수.  University of Miami.  우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘?...

비디오: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Microinjection을 사용하여 안정적인 트렌스​​ 제닉 C. 엘레간스의 생성

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

연구

생물학

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

잠재적인 파킨슨병의 유전자 검증을위한 C. 엘레간스 도파민 신경 세포의 변성 분석의 응용

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

인간 배아 줄기 세포 인구에서 Hepatocyte 같은 전지의 강력한 생성

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

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C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Culturing 인간의 배아와 유도 Pluripotent 줄기 세포에 적합 마우스 배아 Fibroblast 세포의 준비

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

위한 시스템<em&gt; 예 생체</em배아 췌장의&gt; 배양

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans의 주 화성 분석

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...