이 방법은 C.elegans에 있는 긴장 반응을 특성화하고 유전 또는 약리학 적인 동요가 보호 세포 통로의 활성화에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 방법은 분자 및 생리적 수준에 유전자 녹다운과 같은 수백 개의 동요의 신속하고 높은 처리량 테스트를 허용합니다. 분석이 제대로 수행되도록 하려면 양수 및 음수 컨트롤을 포함합니다.
건강하고 잘 먹이는 동물을 적절한 단계로 동기화하고 실험을 위해 신선한 접시를 사용합니다. 선택으로 웜의 미세 조작을 시각화하면 새로운 사용자가 웜이 어떻게 줄 지어 생존 가능성을 평가하는지 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 필 프랭티노, 홀리 길데아, 멜리사 멧칼프, 우리의 실험실에서 대학원생이 될 것입니다.
내열성 망상의 활성화를 위해 열충격 단백질 4의 발기인하에 GFP를 발현하는 동물을 사용하려면 단백질 반응이 전개되고, L4 단계까지 20도에서 동기화된 리포터 동물을 성장시키고 M9 배지를 사용하여 플레이트에서 벌레를 씻어 튜브로 옮긴다. 원심분리에 의해 벌레를 수집한 후, M9에 대한 관심 약물의 밀리리터당 25 나노그램으로 M9을 조절동물관에서 M9 또는 디메틸 설산화물을 대체한다. 그런 다음 웜을 회전 플랫폼에 섭씨 20도에서 3~4시간 동안 배치합니다.
인큐베이션이 끝나면 웜을 원심분리하여 치료 용액을 M9의 15밀리리터만 교체합니다. 2개의 세징 후에, 동물을 NGM 플레이트 또는 NGM RNA 간섭 판으로 적절히 옮기고 벌레가 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 회복할 수 있도록 합니다. 벌레가 회복되면 박테리아없이 표준 NGM 접시에 100 밀리머 나트륨 아지드의 5 ~ 10 마이크로 리터를 추가하고 해부 현미경 아래에 벌레 접시를 놓습니다.
접시에서 아지드 나트륨 의 자리로 10~20마리의 동물을 옮기. 동물은 소금 용액에 착륙 한 직후 의 움직임을 포착해야합니다. 아지드 나트륨이 증발하면 모든 동물에 대해 동일한 방향으로 전방 및 후방 면으로 원하는 이미징 설정에 동물을 정렬하고 즉시 스테레오 현미경 아래에 동물의 접시를 놓습니다.
스테레오 현미경 이미징 소프트웨어를 실행하고 인수 탭에서 프로젝트 및 폴더를 클릭하여 새 프로젝트를 엽니다. 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이름을 변경하여 폴더이름을 변경합니다. 현미경 목표 아래에 웜 샘플을 배치하고 브라이트필드 설정을 사용하여 웜의 올바른 초점점을 찾아 형광 표백을 최소화합니다.
샘플의 중심은 계란의 선이 명확하게 보이고 퍼지지 않는 지점이 될 것입니다. 노출 시간을 설정하여 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하고 신호가 감지 한계를 초과하도록 합니다. 노출 시간, 줌, 포커스 및 브라이트필드 응축기를 적절한 설정으로 설정한 후 캡처 이미지 버튼을 클릭하여 이미지를 얻습니다.
복합 광야 현미경을 이용한 이미징의 경우, 베이스라인 제어 처리 플레이트를 복합 광야 현미경 단계에 배치하고 터치 패드를 사용하여 제어 프로그램을 시작합니다. 새 앨범과 파일 이름을 만들고 플레이트를 객관적인 렌즈 아래에 배치합니다. 기준선 제어 및 양수 제어 플레이트를 사용하여 노출 시간 및 형광 강도를 설정하여 신호가 보이지만 포화되지 않도록 합니다.
그런 다음 브라이트필드와 GFP FITC 이미지를 저장합니다. 큰 입자 흐름 세포측정에 의해 기자의 유도를 정량화하려면 먼저 세포계 레이저를 켜고 사이토미터 소프트웨어를 엽니다. 소프트웨어 창에서 레이저를 켜고 실행을 클릭하여 아르곤 레이저 제어 팝업 창에서 레이저를 시작하려면 시작하십시오.
레이저가 약 12 밀리와트에 도달하면 488 광원 수준이 약 12까지 올라가면 완료를 클릭하고 네 개의 압력 값을 확인하십시오. 값이 원래 설정에서 관찰된 값과 비슷해 보이는 경우 압력 확인 란을 선택합니다. 다음으로, 유동 셀을 통해 칼집과 샘플의 흐름을 차단하는 기포 나 파편이 없는지 확인하려면 여러 번 청소를 클릭합니다.
그런 다음 정렬을 끄고 칼집을 켜서 흐름을 다시 시작합니다. 유량을 확인하려면 60초 동안 칼집을 수집합니다. 60초 동안 15밀리리터 튜브에 칼집을 수집합니다.
유량은 분당 9~10밀리리터여야 합니다. 시료를 실행하려면 레이저 광증 전력을 감지 한계를 초과하지만 채도 한계보다 높지 않을 정도로 높은 수준으로 조정합니다. 거품, 파편, 계란 및 기타 원치 않는 작은 입자를 배제하고 성인과 같은 관심있는 동물만 포함하도록 크기 게이팅을 수행합니다.
스크리닝 매개 변수가 설정된 경우 준비된 웜을 컵에 추가하고 획득을 클릭합니다. 이 공기에 걸릴 및 검출기 내에서 거품을 만들 수 있기 때문에 모든 액체가 기계에 채택되지 않도록주의하십시오. 샘플이 낮거나 동물이 충분히 수집되면 중지를 클릭합니다.
크기 제약 조건에 따라 게이트된 데이터를 저장하려면 설정, 데이터 저장소를 클릭하고 게이트된 저장소만 저장하여 데이터를 저장합니다. 그런 다음 수집 컵을 탈온된 물로 헹구고 다음 샘플로 분석을 반복하기 전에 진공으로 세척을 세 번 제거합니다. 미토콘드리아 및 산화 스트레스 민감도를 측정하려면 M9에서 50~75마이크로리터를 평평한 바닥 96웰 플레이트의 조건당 8~10개의 우물로 추가하고 조건당 8~10개의 웜을 파라콰트의 각 우물에 전달합니다.
2시간마다 접시를 부드럽게 탭하여 살아있는 동물이 잘 죽은 동물의 수를 채점할 수 있도록 분쇄하거나 구부립니다. 동물의 온도 민감도를 측정하려면, 총 4~6플레이트에 대해 조건당 10~15마리의 동물을 도금하기 전에 20°C에서 3~4일 동안 벌레를 배양한다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 34도 또는 37도의 인큐베이터에 넣고 2시간마다 웜 생존을 기록합니다.
hsp-4 리포터는 스트레스가 없는 경우 최소한의 기저 인상을 가지고 있지만 동물이 투니카마이신 약물을 사용하여 내시경 망상 스트레스에 노출될 때 강력한 GFP 표현을 나타낸다. 이러한 차이는 또한 큰 입자 흐름 세포계를 사용하여 정량화될 수 있다. 더욱이, 폐막성 망상 응력 하에서 트랜스진의 유도는 RNA 간섭을 통해 XBP-1의 녹다운에 의해 완전히 억압될 수 있다.
유사한 소하는 미토콘드리아 스트레스, 산화 스트레스 및 열 스트레스를 측정하기 위해 수행 될 수있다. 스트레스에 대한 전체 동물 생리적 반응은 또한 여러 생존 방법을 사용하여 측정 될 수있다. 예를 들어, Tunicamycin에 노출은 내민성 망상 응력 감도를 측정하기 위하여 이용됩니다.
XBP-1 유전자의 녹다운은 튜니카마이신에 대한 민감도가 현저한 증가로 이산됩니다. 더욱이, 화학약제 파라쿼트에 노출되는 것은 산화 및 미토콘드리아 응력 감도를 측정하는 데 사용된다. DAF-2 유전자의 녹다운은 파라쿼트에 대한 저항성이 현저한 증가로 이산됩니다.
열성 편협은 높은 온도에서 동물의 생존을 결정함으로써 측정 될 수 있으며 생존 곡선으로 플롯 될 수있다. 이러한 분석은 적어도 4 ~ 6 번 수행해야하며 열성 편협이 다른 스트레스 측정에 비해 매우 높은 가변성을 보여 주면서 복제본을 모두 서로 에 대해 플롯해야합니다. 동물을 이미징할 때, 신호의 이상 또는 채도 미만이 없도록 매개변수를 설정하고 실험 전반에 걸쳐 동일한 매개 변수가 사용되는지 확인하는 것이 중요합니다.
여기에서 기술된 화상 진찰 프로토콜은 게놈 전체 스크린을 포함하여 대규모 검열을 위한 허용되고 그 때 기술된 생리적인 분석에 의해 후속될 수 있는 탐구및 확증 연구 둘 다를 위해 중대합니다.
