저자는 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 HEK293 세포의 관대 한 기부에 대한 예일 대학에서 박사 프레드 Sigworth의 실험실에서 박사 양양 얀에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한 저자는 비디오 소개에 표시 여유의 극저온 전자 현미경 상 동성 모델의 박사 Sigworth에게 감사의 말씀을 전합니다.이 연구는 LKK에 NIH 보조금 DH067517 및 NS073943에 의해 지원되었다

1. 세포 배양 (플레밍과 Kaczmarek 18에서 적응) <ol><li> 2보다 큰 미만 10 구절이 분석에서 사용하기 전에 적절한 미디어 문화 세포. 안정적으로 쥐 한산한-B 단백질을 발현하는 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포와 HEK-293 세포는 Leibovitz의 L-15 중간 10 %의 열 불 활성화 된 소 태아 혈청과 항생제로 보충 절반 둘 베코의 수정 된 이글 매체와 반에서 재배된다. 500 ㎍ / ㎖의 네티 (G418)를 안정적으로 여유 채널의 발현을 선택 한산한-B를 표현하는 HEK-293 세포에 첨가된다. 0.25 % 트립신-EDTA 용액으로 요리에서 분리하여 70-90%의 합류 통로 세포. </li></ol> 2. 피브로넥틴 및 오발 부민과 티오 2 384도 광 바이오 센서 플레이트의 세포 외 기질 (ECM) 코팅 <ol><li> 피브로넥틴 ECM 혼합물 및 알부민 블로킹 용액의 조제 <ol><li> fibronect의 작업 솔루션을 준비합니다20.0 ㎖의 PBS에서 파이브로 넥틴의 5 μg / ML의 최종 농도와 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)에서. 1.0 ㎎ / ㎖의 주식 농도에서 200 배 희석 20.0 ㎖의 PBS 100 μl를 추가합니다. 피브로넥틴의 작업 솔루션을 준비 후 분주 및 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 멸균 열 불 활성화 알부민의 5 % 주식 솔루션을 준비합니다. 5 % 용액과 무균 조직 배양 등급 물에 알부민을 희석하여 60 ℃에서 30 분 동안 열 불 활성화 실온 및 살균 필터 솔루션 용액을 냉각. 4 ° C에서 5 % 알부민 용액과 상점을 나누어지는 </li><li> PBS로 5 % 스톡 용액을 희석하여 알부민의 2 % 작동 용액을 준비한다. 예, 30.0 ML의 최종 볼륨 PBS의 18.0 ml의 5 % 알부민 원액의 12.0 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 384도 광 바이오 센서 플레이트 코팅 <ol><li> 20.0 μL / 잘와 티오 2 판을 수화물15 분 동안의 무균 조직 배양 등급 물. 다음 단계는 16 - 채널 피펫으로 수행되어야한다. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오. </li><li> 각 웰에 피브로넥틴 작업 솔루션의 20.0 μl를 추가하고 ECM을 만들 실온에서 2 시간 동안 배양한다. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 플레이트 1X을 씻으십시오. </li><li> 물론 각 알부민 작업 솔루션의 40.0 μl를 추가하고 판을 차단하는 4 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 물론 당 50.0 ㎕의 PBS와 판 3 배를 씻으십시오. ECM 코팅 된 플레이트는 최대 48 시간 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 3. 384도 광 바이오 센서 접시에 세포의 파종 <ol><li> 세포에서 성장 미디어를 제거하고 접시에서 세포를 이동시키다 트립신을 추가합니다. 세포를 수집하고 1 분 1,000 XG에 원심 분리기. 성장 미디어 트립신 미디어에 resuspend 세포를 제거합니다. </li><li> 혈구 나 자동화를 사용하여셀 카운터, 세포 농도를 결정한다. </li><li> 배양 중에 증발의 영향을 최소화하기 위해, 웰 당 성장 배지 50.0 μL가 사용될 것이다. 세포를 성장 배지 중에서 50.0 μL의 부피 웰 당 세포의 원하는 수를 달성하기 위해 희석되어야한다. 이 실험을 위해, 1,000 세포 / 웰 바이오 센서에 도금했다. </li><li> 시드 세포가 공기 / 5 % CO 2에서 37 ° C에서 성장 배지에서 하룻밤 배양 할 수 있습니다. </li></ol> 4. RWG 광 바이오 센서 분석을위한 바이오 센서 및 복합 플레이트의 제조 <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세포 성장 매체를 제거합니다. 세포 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)와 1x는 씻으십시오. 각 웰에 HBSS의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> BIND 스캐너에 바이오 센서 플레이트를 놓고 세포가 1 ~ 2 시간 동안 실온으로 평형을 할 수 있습니다. </li><li> 그 리간드가 광고됩니다되는 별도의 복합 플레이트를 준비분석 기간 동안 바이오 센서 판에 공격 한. 이러한 분석은 솔루션 함유 화합물의 25.0 μL은 50.0 μL의 총 볼륨의 바이오 센서 플레이트에 각 웰에 첨가 하였다. 따라서, 용액 중의 화합물 2X 원하는 최종 농도로 제조 하였다. </li></ol> 5. RWG 광 바이오 센서 분석을 수행 <ol><li> 잘 BIND 스캔 소프트웨어를 사용하여 각의 중심 1.5 mm에 4,125 μm의 / 픽셀의 최대 해상도를 사용하여 우물 A1-P12 (SBS 384 - 웰 플레이트의 절반)의 스캐너 시스템과 기준 측정을 가져 가라. 이 기준 검사는 약 30 분 소요됩니다. </li><li> 우물 A1-P12에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> 웰스 A13-P24의 기준 측정을 가져 가라. </li><li> 웰스 A13-P24에 대한 각 웰에 복합 솔루션의 25.0 μl를 추가합니다. </li><li> 우물 A1-P12에 대한 게시물 화합물 첨가 측정을하고, 우물 A13-P24에 대해 반복합니다. </li></ol> 6.BIND보기와 분석 데이터의 (분석) <ol><li> Windows의 기본 측정을​​ 위해 BIND 분석 데이터를 열고, 셀 선택을 가능하게하는 &quot;그리드 편집기&quot;버튼을 클릭합니다. 이 소프트웨어는 사용자가 정의한 그 통계를 계산합니다. </li><li> &quot;셀 찾기&quot;와 &quot;Baseliner&quot;기능을 포함하는 &quot;플러그 - 인&quot;을 엽니 다. &quot;셀 찾기&quot;에서 매개 변수를 설정 세포는 바이오 센서의 배경과 구별되도록. </li><li> 기준 측정을위한 &quot;셀 찾기&quot;데이터가 포함 된 셀의 맵 파일을 내 보냅니다. </li><li> 반복 포스트 화합물뿐만 아니라 데이터에 대한 6.1-6.2 단계를 반복합니다. </li><li> &quot;Baseliner&quot;플러그를 열고 기준 측정에서 세포 맵을 가져옵니다. 이 소프트웨어는 배경과 포스트 화합물 데이터 사이의 PWV의 변화를 계산합니다. </li><li> 세포에 대한 PWV의 평균 변화의 출력은 &quot;Δ 셀 평균&quot;을 선택합니다. 데이터는 마이크로 소프트 EXC로 내보낼 수 있습니다추가 분석을 위해 엘. </li></ol>

<ol>
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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+diacylglycerol+degradation+to+M1+muscarinic+receptors+by+beta-arrestins.">Targeting of diacylglycerol degradation to M1 muscarinic receptors by beta-arrestins.</a> Science. 315, 663-666 (2007).</li><li>Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Gribbon, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+real-life+high-throughput+screening+data.">Evaluating real-life high-throughput screening data.</a> J. Biomol. Screen. 10, 99-107 (2005).</li></ol>

스티븐 M. Shamah는 X - BODY 생명 과학의 직원입니다.

Z 프라임 (Z &#39;) 요소는 높은 처리량 스크리닝 검사 (20)의 품질을 정량화하는 일반적인 통계 방법이며,이 분석에서 GPCR 작용제의 심사 SBS 호환 384 잘 분석에서 발생했기 때문에, 훌륭한을 제공합니다 이 분석 (21)의 안정성과 유효성의 측정. 1 애리조나 &#39;값이 존재하지 않는 표준 편차와 데이터 포인트의 무한한 번호를 이론적으로 최적의 분석을 나타냅니다. 0.5 이하의 소폭 정보...

생리 학적으로 중요한 상황에서 살아있는 세포를 검사하는 표적 세포의 생물학적 기능을 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 채널과 같은 coimmunoprecipitation 분석법 규제 세포질 단백질 사이의 상호 작용을 조사 분석법은 일반적으로 살아있는 세포의 상호 작용의 시간 경과에 약간의 정보를 제공한다. 현재 셀 기반 분석의 대부분은 그 찬란 태그 단백질의 전위와 같은 특정 세포 이벤트를 측정합니다. 이러한 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수있다 또한 단백질의 변형을 요구한다. 시스템의 조작을 필요로 세포 활동의 연속 측정을 제공하고 그들의 가장 생리 학적으로 관련 국가 4 세포의 연구를 허용하지 않는 비 침습적 인 세포 기반 분석. 광 바이오 센서를 생산하도록 설계센서 표면에 결합되는 광의 특성에 측정 가능한 변화. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 및 공진 파장 격자 (RWG) 기법을 포함 소멸 파를 이용하는 광 바이오 센서는, 주로, 센서 표면에 고정 생물학적 수용체에 결합하는 분자의 친화도 및 반응 속도를 검출하기 위해 사용되어왔다. 최근 시판 RWG 바이오 센서는 높은 공간 해상도 (최대 3.75 μM / 픽셀) 5에서 센서 표면에 부착 한 세포의 바닥 부 내의 질량 상대적인 변화의 검출을 허용하도록 개발되었다. 이러한 바이오 센서는 세포 부착 및 퍼짐, 독성, 증식 및 G-단백질 결합 수용체 (GPCR에) 포함하여 세포 표면 수용체의 다양한 의해 유도 신호 전달 경로와 같은 자극으로부터 발생 살아있는 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지 할 수있는 6 . RWG 바이오 센서는 상대적으로 찬 검출바이오 센서 (7)의 150 nm의 사이에서 질량 상대적인 변화의 함수로서 굴절률의 GE. 세포를 바이오 센서에 도금되는 경우, 굴절률의 변화는 바이오 센서에 부착 세포의 변화로 인한 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 반영. 이 프로토콜은 RWG 바이오 센서를 사용하여 채널의 단백질 상호 작용의 검출에 대해 설명합니다. RWG 데이터 수집 시스템의 몇 가지 요소로 구성됩니다. X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너가이 실험에 사용 되었기 때문에, 우리는 플레이트 리더, 관련 바이오 센서, BIND 스캔 수집 소프트웨어, BIND보기 분석 소프트웨어 8로 구성이 특정 시스템의 구성 요소를 참조해야한다. 광자 결정 바이오 센서는, 광학 바이오 센서를 이하에서 언급 할의주기적인 배열로 구성되어 특정의 빛의 전파를 방지한다 2 또는 3 차원의 유전체 재료파장 및 방향. 광자 결정 구조는 나무의 변종이라는 현상을 기반으로합니다. 처음으로 1902 년에 발견 목재, 이러한 변이는 특히 회절 차수의 세기의 급격한 변동이 소정의 좁은 주파수 대역에서 발생하는 광 회절 격자에 의해 반사되는 빛의 스펙트럼에서 관찰 된 효과이다. 1962 년 Hessel의 및 Oliner 유한 기간의 격자가 서 공명 파장 9를 생성하는 나무의 이상 현상의 새로운 이론을 제시했다. 여기에 설명 된 광 바이오 센서에서 나무의 이상이 흰색 빛으로 자극하는 경우가 파장 만 매우 좁은 밴드 (대표적으로는 850-855 nm의) 반영 RWG 바이오 센서를 생산하는 데 사용됩니다. 개별 바이오 센서는 높은 굴절률 유전체 이산화 티탄 (티오이)의 얇은 층으로 코팅되어 주기적 표면 구조를 가진 저 굴절률 플라스틱 재료로 구성되어있다. 때 biosens또는 광자 결정의 광 격자가 BIND 스캐너에서 분광 광도계로 측정되는 빛의 파장의 좁은 범위를 반영하는 광범위한 파장의 광원으로 조명된다. 반사 된 파장 (피크 파장 값 또는 PWV)의 피크 강도는 그 신호로부터 계산된다. 바이오 센서 표면의 근접성 내의 질량의 증가 또는 감소 (~ 150 nm 정도)의 결과로서 굴절율의 변화에​​ 따라 빛 시프트 PWV. 광 바이오 센서는 생명 과학을위한 표준 협회 (SBS) 이러한 실험에 사용 된 분석을위한 384 - 웰 마이크로 플레이트에 통합됩니다. RWV 바이오 센서는 셀 10 생활에 외인성 신호의 추가에 변화를 감지하는 데 사용됩니다. 세포를 직접 RWG 바이오 센서의 표면 상에 배양하고 굴절 로컬 인덱스의 변화는 특정 자극 치료시 모니터링된다. 바이오 센서의 질량의 변화의 방향이 될 수있다로컬 바이오 센서 근처의 질량 증가로 굴절 결과의 인덱스의 증가는 PWV의 증가로서 측정되기 때문에, 결정. 반대로 질량 감소는 PWV의 감소를 생성한다. 검출 PWV의 변화는 세포 접착의 변화, 단백질 모집 / 해제, 엔도 시토 시스 및 재활용, 세포 외 유출, 세포 사멸 및 세포 골격의 재 배열 등 다양한 세포 사건에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 분석은 칼륨 채널 및 다른 세포질 또는 세포 골격 성분 간의 채널 단백질 상호 작용의 변화를 검출 할 수있다. 이벤트는, 그러나, 바이오 센서 근처 ~ 150 nm의 검출 영역 내에서 발생하고, 세포막 근처 연결된 셀의 경우한다. 세포 반응의 취득은 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 수행되며 SBS 플레이트의 웰 (384)의 각각의 이미지 표현이 생성된다. 이 시스템은 하나의 셀에있는 이벤트의 검출을 허용 최대 3.75 μM / 화소의 해상도를 가지며,(예 : HEK293 또는 CHO 세포와 같은) 세포 라인 이상 생리학 관련 기본 세포로도 사용할 수 있습니다. BIND View 소프트웨어와 이미지 분석은 개별 세포의 인구 모두에서 세포 반응의 검출을 할 수 있습니다. 바이오 센서는 마이크로 플레이트 384 - 웰 표준 SBS에 통합됨에 따라, 시스템은 고 처리량 스크리닝 (HTS)에 용이하게 적응할 수있다. 공진 파장 격자 광 바이오 센서 (11)는 이전의 GPCR의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 우리 연구소는 두 나트륨 활성화 (K NA) 칼륨 채널, 슬랙-B와 슬릭 (12)를 복제했다. 둘 다 B 흔들림 매끄러운 채널의 활성이 매우 강력한 단백질 키나제 C (PKC)의 활성화 (13)의 직접적인 영향을받을 것으로 나타났다. 이러한 M1 무스 카린 수용체와 mGluR1 대사성 글루타메이트 R 등 Gα Q의 단백질 결합 수용체의 활성화eceptor, 유력 PKC 활성화를 통해 채널의 활동을 조절한다. 이러한 K 나 채널은 지속적인 신경 자극 동안 적응 올릴 액션 타이밍의 정확도는 14 전위 조절. 여유 채널 FMRP, 허약 한 X 정신 지체 단백질 (15, 16)를 포함하여 세포질 신호 분자의 다양한 상호 작용하는 것으로 알려져있다. 유년기 (MMPSI), 심한 발달 지연 (17) 결과 간질의 조기 발병 형태의 다수의 마이그레이션 부분 발작의 여유 결과 돌연변이.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DMEM, High Glucose</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11415-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Geneticin G-418 Sulfate</td>
			<td style="width:172px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:119px;">AB05057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">HBSS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Fibronectin from human plasma</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Albumin from chicken egg white</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">DPBS</td>
			<td style="width:172px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:265px;">Hausser Bright-Line Phase Hemocytometer</td>
			<td style="width:172px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">02-671-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Carbamoylcholine chloride</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">SFLLR-NH2 trifluoroacetate salt</td>
			<td style="width:172px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">Finnpipette (5-50 &#181;l)</td>
			<td style="width:172px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4662090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">BIND Scanner System</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:265px;">384-well TiO2 coated plates</td>
			<td style="width:172px;">X-BODY Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">TiO-96-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of label-free optical biosensors to detect modulation of potassium channels by g-protein coupled receptors

이온 채널을 선택적으로 이온이 플라즈마 막 (1)을 통해 흐르게함으로써 뉴런 및 다른 흥분성 세포 유형의 전기적 특성을 제어한다. 신경 세포의 흥분성을 조절하기 위해, 이온 채널의 생물 리 학적 특성은 종종 이종 체 채널 착물 2,3을 형성하는 채널 자체에 바인딩 신호 단백질 및 분자에 의해 수정된다. 살아있는 세포에서의 상호 작용의 시간 경과에 적은 정보를 제공하면서 채널 및 규정 단백질 사이의 상호 작용을 조사 전통적인 분석은 잠재적으로 단백질의 동작을 변경하고 대상의 생리 학적 관련성을 줄일 수 외인성 라벨을 필요로한다. 이러한 X-BODY 생명 과학 BIND 스캐너 시스템과 광 바이오 센서는, 공명의 변화를 감지하는, 새로운 라벨이없는 기술, 공진 파장 격자 (RWG) 광 바이오 센서를 사용하는 바이오 센서 주변의 빛을 반영합니다. 이 분석은 허용 상대 검출세포 접착의 리간드 유도 변화 확산 독성, 증식 및 세포막 근처 단백질 - 단백질 상호 작용의 변화로 인해 발생하는 바이오 센서의 표면에 부착 한 생세포의 바닥 부 내에 질량 변화. RWG 광 바이오 센서는 G 단백질 결합 수용체 (GPCR에), 수용체 티로신 키나아제, 및 다른 세포 표면 수용체의 활성화 다음 세포의 세포막 근처 질량의 변화를 감지하기 위해 사용되어왔다. 이온 채널 단백질 상호 작용의 리간드에 의한 변화는이 분석을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 이 논문에서, 우리는 한산한-B 나트륨 활성화 칼륨 GPCR에 의해 (K 나) 채널의 변조를 감지하는 데 사용되는 실험 절차를 설명합니다.

한산한-B 안정적 HEK-293 세포를 형질 전환 및 제어 형질 감염되지 않은 HEK-293 세포는 물론 384도, ECM 코팅 RWG 바이오 센서 접시에 1,000 세포 /에 씨앗을 품고 있었다. 바이오 센서의 중앙 1.5 mm 2의 이미지는 4,125 μm의 / 픽셀의 해상도 (그림 1)을 기록했다. 질량 밀도 구배지도는 사전 생성 및 BIND 스캔 소프트웨어와 함께 30 분 후 화합물 첨가 하였다. BIND보기 소프트웨어는베이스 라?...

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Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다.

G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조를 감지하기 위해 라벨이없는 광 바이오 센서의 사용

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

use-label-free-optical-biosensors-to-detect-modulation-potassium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K 조회수.  Yale School of Medicine.  광학적 바이오 센서 기술은 살아있는 세포에서 세포막 근처 질량의 변화를 감지 한 개별 세포와 세포 집단 모두에서 세포 반응을 수행 할 수있다. 이 프로토콜은 이러한 접근법을 사용하여 그대로 세포에서 G-단백질 결합 수용체에 의해 칼륨 채널의 변조의 검출에 대해서 설명한다. 

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Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) technique), make use of various surface modification techniques, that can, for example, prevent surface fouling, tune the hydrophobicity / hydrophilicity of the surface, adapt to a variety of electronic environments, and most frequently, induce specificity towards a target of interest.1-5 These techniques extend the functionality of otherwise highly sensitive biosensors to real-world applications in complex environments, such as blood, urine, and wastewater analysis.2,6-7 While commercial biosensing platforms, such as Biacore, have well-understood, standard techniques for performing such surface modifications, these techniques have not been translated in a standardized fashion to other label-free biosensing platforms, such as Whispering Gallery Mode (WGM) optical resonators.8-9
WGM optical resonators represent a promising technology for performing label-free detection of a wide variety of species at ultra-low concentrations.6,10-12 The high sensitivity of these platforms is a result of their unique geometric optics: WGM optical resonators confine circulating light at specific, integral resonance frequencies.13 Like the SPR platforms, the optical field is not totally confined to the sensor device, but evanesces; this "evanescent tail" can then interact with species in the surrounding environment. This interaction causes the effective refractive index of the optical field to change, resulting in a slight, but detectable, shift in the resonance frequency of the device. Because the optical field circulates, it can interact many times with the environment, resulting in an inherent amplification of the signal, and very high sensitivities to minor changes in the environment.2,14-15
To perform targeted detection in complex environments, these platforms must be paired with a probe molecule (usually one half of a binding pair, e.g. antibodies / antigens) through surface modification.2 Although WGM optical resonators can be fabricated in several geometries from a variety of material systems, the silica microsphere is the most common. These microspheres are generally fabricated on the end of an optical fiber, which provides a "stem" by which the microspheres can be handled during functionalization and detection experiments. Silica surface chemistries may be applied to attach probe molecules to their surfaces; however, traditional techniques generated for planar substrates are often not adequate for these three-dimensional structures, as any changes to the surface of the microspheres (dust, contamination, surface defects, and uneven coatings) can have severe, negative consequences on their detection capabilities. Here, we demonstrate a facile approach for the surface functionalization of silica microsphere WGM optical resonators using silane coupling agents to bridge the inorganic surface and the biological environment, by attaching biotin to the silica surface.8,16 Although we use silica microsphere WGM resonators as the sensor system in this report, the protocols are general and can be used to functionalize the surface of any silica device with biotin.

Biosensors interface with complex, biological environments and perform targeted detection by combining highly sensitive sensors with highly specific probes attached to the sensor via surface modification. Here, we demonstrate the surface functionalization of silica optical sensors with biotin using silane coupling agents to bridge the sensor and the biological environment.

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

연구

생체공학

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

광 핀셋으로 단일 RNA 분자의 Nanomanipulation

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

단일 세포 분비물의 공간 - 시간 영상의 레이블이없는 기술

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid 광 공진기를 사용하여 라벨이없는 단일 분자 검출

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

The Use of a &amp;#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations and development of microstructurally motivated mathematical models for understanding the mechanical properties of human resistance arteries in health and disease have the potential to aid understanding how disease and medical treatments affect the human microcirculation. To develop these mathematical models, it is essential to decipher the relationship between the mechanical and microarchitectural properties of the microvascular wall. In this work, we describe an ex vivo method for passive mechanical testing and simultaneous label-free three-dimensional imaging of the microarchitecture of elastin and collagen in the arterial wall of isolated human resistance arteries. The imaging protocol can be applied to resistance arteries of any species of interest. Image analyses are described for quantifying i) pressure-induced changes in internal elastic lamina branching angles and adventitial collagen straightness using Fiji and ii) collagen and elastin volume densities determined using Ilastik software. Preferably all mechanical and imaging measurements are performed on live, perfused arteries, however, an alternative approach using standard video-microscopy pressure myography in combination with post-fixation imaging of re-pressurized vessels is discussed. This alternative method provides users with different options for analysis approaches. The inclusion of the mechanical and imaging data in mathematical models of the arterial wall mechanics is discussed, and future development and additions to the protocol are proposed.

We describe simultaneous mechanical testing and 3D-imaging of the arterial wall of isolated, live human resistance arteries, and Fiji and Ilastik image analyses for the quantification of elastin and collagen spatial organization and volume densities. We discuss the use of these data in mathematical models of arterial wall mechanics.

레이블 없는 형광 현미경 검사 법에 의해, 인간의 저항 동맥에 콜라겐과 엘라 스 틴 압력 종속 마이크로아키텍처가 평가

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...