표적 프로테오믹 접근법은 단기 프로테오믹스 기반 실험이나 분자 생물학 기반 실험에서 단백질의 검증을 위한 선택의 방법이 빠르게 되고 있습니다. 다중 반응 모니터링은 생물학적 샘플에서 단백질을 검출하고 정량화하는 데 점점 더 사용되는 이러한 표적 접근법 중 하나입니다. 이 연구에서 우리는 MRM 실험의 기본 요구 사항에 독자를 소개하는 의도로 인간의 뇌 조직에서 단백질을 감지하고 정량화하는 데 관련된 다양한 단계를 거쳤습니다.
약 50 mg의 뇌 조직의 무게를 측정하고 1x 인산염 완충식식염 300 마이크로 리터로 조직을 씻으시면 됩니다. 이 단계는 조직의 외부 표면에 어떤 혈액을 제거하기 위하여 수행되고, 따라서 가능한 한 많은 혈액을 제거하는 것이 좋습니다. PBS를 사용하여 세차하는 다음, 조직을 포함하는 튜브에 300 마이크로 리터의 리시스 버퍼를 추가합니다.
얼음 욕조에 튜브를 유지하면서 프로브 초음파 처리기를 사용하여 조직을 lyse. 조직을 완전히 lyse하는 비터를 사용하여 조직 균질화를 계속합니다. 4도 섭씨에서 15 분 동안 6000g에서 튜브의 내용을 원심 분리합니다.
상체를 신선한 튜브로 옮기고 균일하게 섞습니다. 상체의 작은 알리쿼트(aliquot)를 취하고 표준 단백질 분석체를 사용하여 단백질 함량을 정량화한다. 여기에서 우리는 브래드포드 분석기를 사용하여 단백질 추정의 예를 보여줍니다.
마이크로센트심분리기 튜브에 50마이크로그램의 단백질을 섭취하고 최종 농도가 20밀리머인 TCEP를 추가하여 내용물들을 줄입니다. 1시간 동안 37도에서 내용물들을 배양합니다. 인큐베이션에 이어, 최종 농도가 40 밀리머인 튜브에 요오도아세타미드를 첨가하여 감소된 단백질을 알킬 수 있다.
30 분 동안 어둠 속에서 튜브를 배양. 이제 우레아의 최종 농도가 1마리 미만이 도록 감소된 단백질을 함유한 튜브에 버퍼 B를 첨가한다. 트립신을 30효소 대 단백질 비율로 1개에 넣고 일정한 흔들림으로 37도에서 하룻밤 동안 튜브를 배양합니다.
소화후 소화된 펩티드를 진공 농축기에 농축한다. 이 단계에서 펩타이드는 향후 사용을 위해 마이너스 80에 재구성및 탈염또는 저장할 수 있습니다. 탈염, 또는 펩티드 정리는 모든 LC-MS에 샘플을로드하기 전에 필수적입니다. 샘플의 염 및 기타 오염 물질은 컬럼을 막고 장기적으로 기기의 감도에 영향을 줄 수 있습니다.
이 프로세스는 시판되는 C18 STAGE 팁 또는 열을 사용하여 수행할 수 있습니다. 여기서 우리는 C18 STAGE 팁을 사용하여 펩티드 탈염에 대한 워크플로우를 묘사했습니다. 탈염 후, 진공 농축기에서 펩티드를 건조.
이러한 깨끗한 펩티드를 재구성하고 Scopes 방법을 사용하여 정량화를 진행한다. 이를 위해, 마이크로드롭 플레이트에 샘플의 마이크로리터 2개를 적재하고 슬라이드에 표시된 바와 같이 농도를 계산한다. 전환 목록 준비는 SRM 또는 MRM 실험에서 중요한 단계입니다.
전환 목록에는 질량 분광계에서 전환을 모니터링하는 데 필요한 모든 정보가 포함되어 있습니다. 여기에는 전구체 및 제품 이온의 m x 값, 전이의 충돌 에너지, 계측기의 극성 및 데이터 수집시간 범위가 포함됩니다. 스카이라인을 사용하여 전환 목록을 준비합니다.
UniProt의 휴먼 프로테오메 우타 파일을 사용하여 배경 프로테오메를 준비하고 펩타이드 설정의 배경 탭에서 선택되었는지 확인합니다. 필터 탭에서 최소 길이 8및 최대 길이 25를 설정합니다. 펩티드에 다른 수정 사항이 없는 경우 기본 설정을 계속 사용합니다.
펩티드 설정이 완료되면 전환 설정을 클릭합니다. 필터 탭에서 전구체 요금을 2및 3으로 설정합니다. 이온 요금을 1로 설정하고 이온 유형을 y로 설정합니다.
제품 이온은 사용자의 선택에 따라 선택할 수 있습니다. 모든 매개 변수를 기본값으로 둡니다. 이제 선택한 표적 단백질의 가입 ID를 삽입합니다.
이 작업은 편집 탭을 클릭한 다음 삽입을 선택하고 마지막으로 가입 ID를 붙여서 수행할 수 있습니다. ID는 백그라운드 프로테오메의 단백질과 이전에 설정된 펩타이드 및 전이 설정을 기반으로 생성된 전이 목록에 매핑됩니다. 이 전환 목록을 내보냅니다.
악기 유형 드롭다운 옵션을 클릭하여 올바른 계측기를 선택해야 합니다. 이 경우 계측기는 열 알티스입니다. 정의되지 않은 전환 목록에 전환이 너무 많기 때문에 목록당 350개의 전환만 으로 제한하고 여러 메서드로 내보냅니다.
이진 용매 시스템이 사용됩니다. 용매 A는 1 % FA이고 용매 B는 80 % ACN입니다. 흐름 속도를 분당 450 마이크로리터로 유지하고 그라데이션을 도시된 대로 유지합니다.
기둥 구획 온도를 섭씨 45도로 설정합니다. 열 및 LC 시스템에 대한 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. TSQ Altis의 MS 설정이 여기에 표시된 대로 있는지 확인합니다.
새 메서드를 만들 려면 단일 전환 목록을 가져옵니다. 쿼드러폴 1과 쿼드러폴 3에 대한 해상도를 7에서 유지하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 이를 더 최적화할 수 있습니다.
실행의 일관성과 결과적으로 데이터 품질을 보장하려면 표시된 대로 실행 시퀀스를 준비합니다. 몇 개의 공백으로 시작하여 빈 혼합물의 조성을 위한 텍스트를 참조하고, 알려진 농도의 QC 표준 조명 BSA가 계측기의 하루 현명한 반응의 변동을 모니터링합니다. 수행된 QC는 샘플 바로 앞에 있어야 합니다.
다음으로 모든 샘플을 공백으로 정렬합니다. 각 시료의 동일한 볼륨을 주입하여 주사당 25~1나노그램의 펩티드를 차지합니다. 구체화된 메서드를 만들려면 먼저 정의되지 않은 메서드를 전체 샘플에 대해 실행합니다.
결과를 스카이라인으로 가져오고 각 펩타이드를 수동으로 확인합니다. 각 펩티드에 대해 모든 샘플에서 일관되게 좋은 피크를 나타내는 전구체 하나를 선택합니다. 좋은 피크를 표시 하지 않는 전구체와 펩 티 드를 삭제 합니다.
모든 피크에 제대로 추가되었는지 확인합니다. 올바른 피크를 선택하고 각 전구체에서 전환을 더 구체화하려면 라이브러리를 사용할 수 있습니다. 라이브러리는 현재 실험 데이터의 펩타이드 및 전환과 일치하는 MS-MS 스펙트럼 데이터 집합입니다.
DART P 값이 1에 가까운 피크를 선택하고 라이브러리와 일치하지 않는 전환을 제거합니다. DART P 값은 실험 적인 피크와 라이브러리 피크 사이에 일치가 얼마나 좋은지 나타냅니다. 1~2회 최적화 후, 세련된 목록이 준비됩니다.
이 세련된 목록은 개별 샘플에 대해 실행할 수 있습니다. 세련된 실행을 스카이라인으로 가져오고 피크에 제대로 부가됩니다. 문서 설정 아래의 음부 탭을 사용하여 문서 그리드의 각 샘플에 신중하게 음표합니다.
그룹 비교 기능을 사용하여 실험의 조건 1과 조건 2 간의 비교를 만듭니다. 이렇게 하면 조정된 P 값이 있는 테이블과 두 그룹 간의 접이식 변경 값을 제공합니다. 우리의 지식에, 이것은 단백질 Apolipoprotein A-1, Vimentin 및 니코틴아미드 인지질 전달제 인간 두뇌 조직 견본에 있는 펩티드를 검출하기 위하여 MRM의 사용을 이용하는 첫번째 연구 입니다.
LC 그라데이션, 거주 시간, 사이클 시간 및 충돌 에너지와 같은 다양한 매개 변수를 최적화하면 MRM 실험의 성공에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 우리는 이 기술이 다른 임상 조건과 질병을 구별할 수 있는 능력을 가진 biomarkers의 패턴을 개발하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다.
