프로토콜없이, 살아있는 세포 이미징을 악용하여 myoblast 분화 및 근섬유 형성, 특히 핵 포지셔닝의 동적 과정을 조사 할 수 있습니다. 이외 세포 핵을 가진 myoblast의 살아있는 세포 화상 진찰은 살아있는 세포에 있는 myoblast 분화의 연구 결과 및 핵의 자동 추적을 허용합니다. 시각적 데모는 1차 세포 격리와 라이브 이미징 및 이미징 분석을 결합하는 방법을 이해하는 데 도움이 됩니다.
프레데리카 콜롬보와 함께 절차를 시연하는 것은 우리 실험실에서 박사 과정 학생인 조르가 카레치아(Giorga Careccia)가 될 것입니다. 티비알리스 밑바닥, 엑스텐소 디지오럼 롱우스, 위트록혈증, 사두근, 삼두근 근육을 성인 마우스의 뒷두발에서 얼음 위의 PBS 페트리 접시에 넣음으로써 시작하십시오. 멸균 가위와 핀셋을 사용하여 각 근육에서 힘줄과 지방을 조심스럽게 제거하고 근육을 빈 페트리 접시로 옮키게 하십시오.
균일한 질량이 얻어지고 근육 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮길 때까지 근육이 잘라내고 다진 멸균 곡선 가위를 사용합니다. 그런 다음 분당 250 회전에서 섭씨 37도 의 수조에 30 분 동안 근육 조각에 소화 매체 10 밀리리터를 추가합니다. 효소 소화의 끝에서, 차단 매체의 10 밀리리터와 반응을 중지합니다.
그리고 원심분리에 의해 샘플을 아래로 회전. 얼음에 튜브를 놓고 새로운 50 밀리리터 튜브로 상수 전송합니다. 상체원분리합니다.
그리고 DMEM의 1 밀리미터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 얼음 위에 10% 태아 소 혈청, 또는 FBS로 보충하십시오. 예약된 펠릿을 신선한 소화 매체의 10밀리리터로 소화하고 소화된 펠릿과 예비 셀 서스펜션을 얼음 위에 결합합니다.
70 마이크로미터 필터를 통해 끌어온 세포를 변형시키고 40 마이크로미터 필터를 제거합니다. 그리고 15 밀리미터의 신선한 DMEM에서 세포를 씻어 10 % FBS로 보충합니다. 원심 분리의 끝에서, 실온에서 적혈구 용해 완충제의 3 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
PBS의 40 밀리리터와 추가 원심 분리로 5 분 후에 용해를 중지합니다. DMEM의 20 밀리리터에서 펠릿을 다시 일시 중단하여 10%의 FBS로 보충하고 코팅되지 않은 페트리 접시에 세포를 미리 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 1시간 후 이산화탄소5%가 상류체를 함유한 위성 세포를 수집합니다.
그리고 전판 셀 서스펜션은 입증된 바와 같이 2회 더. 마지막 도금 후, 원심분리에 의해 위성 세포를 수집하고 신선한 증식 매체의 40 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단. H2BGFP 발현을 유도하기 위해 접시당 독시사이클린의 밀리리터 당 1마이크로그램으로 코팅된 두 콜라겐 페트리 접시로 세포를 분할합니다.
그리고 세포를 세포 배양 인큐베이터로 2~3일 동안 되돌려 보라고 한다. myoblasts가 적절한 실험 밀도에 도달하면, PBS의 5 밀리리터로 각 접시에 세포를 세척하고 5 분 동안 37 섭씨37도에서 접시 당 트립신의 두 밀리리터와 접시 바닥에서 세포를 분리. 가벼운 현미경 검사법에 의한 분리를 확인하고 DMEM의 5 밀리리터와 플레이트 당 10 % FBS로 반응을 중지합니다.
살아있는 세포 화상 진찰을 위해, 2 시간 동안 잘 당 지하 막 매트릭스로 보충된 분화 매체의 350 마이크로리터로 코팅된 12개의 웰 플레이트의 각 우물로 5번째 세포에 2배 10배 플레이트를 플레이트. 세포가 플레이트의 바닥에 부착된 경우, 플레이트를 공초점 현미경 단계에 섭씨 37도 및 5%의 이산화탄소 인큐베이터를 배치하고 20배 건조 목표를 사용하여 수백 개의 셀로 시야를 확보하여 16시간 마다 1024x 1024픽셀로 16비트 이미지를 획득한다. 획득한 각 위치에 대해 멀티 프레임 도트 tif 파일을 생성하고 선택한 폴더에 제공된 도트 지퍼 소프트웨어를 다운로드하여 추출합니다.
세분화 추적 폴더의 예를 열고 분할 점 M을 클릭하여 Matlab에서 명령 창을 엽니다. 변수 파일 이름 트랙이 tIF 파일 및 경로 입력 트랙의 이름이 점 tif가 포함된 폴더가 되도록 기한 분할 도트 M 스크립트를 변경합니다. 실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다.
분할의 결과는 파일 점 매트로 저장되며 핵의 분할은 출력 도면에서 시각화될 수 있다. 트랙을 생성하려면 먼저 두 번 클릭하면 동일한 작업 폴더에서 도트 M 트랙을 생성합니다. 다음으로, 파일 이름을 파일 이름 점으로 변경하여 분할된 핵에 적합한 점 매트 파일입니다.
실행을 클릭하여 스크립트를 실행합니다. 추적 의 결과는 다른 점 매트 파일로 저장되고 생성 된 트랙이 플롯됩니다. 트랙의 품질을 평가합니다.
먼저 검사 추적 점 M을 두 번 클릭하고 파일 이름을 적절한 점 tif 이름으로 수정합니다. 그런 다음 파일 이름 트랙을 클릭하여 트랙의 도트 매트 파일을 사용하고 실행을 클릭합니다. 그림 창에서 아래 스크롤 막대를 사용하여 핵을 선택합니다.
선택한 핵은 빨간색으로 동그라미를 치고, 선택한 셀의 궤적을 위 스크롤 막대를 사용하여 시간에 따라올 수 있다. 녹색 십자가는 검출된 핵을 나타냅니다. 증식과 분화는 Hoechst와 함께 배양된 근세포에서 강하게 손상됩니다.
H2BGFP 마우스로부터 분리되고 독시사이클린 또는 야생 유형으로 배양된 myoblast의 myoblasts에 비해, myosin 무거운 사슬은 myoblasts를 표시했습니다. H2BGFP 단백질을 발현하는 1차 근세포와 함께 살아있는 세포 화상 진찰은 분화 도중 핵의 추적을 허용합니다. 분화 기간의 초기 및 최종 시점에서 GFP 채널에서 전송의 병합 된 이미지는 myotubes의 식별을 허용하고 결과적으로 심덩이에 통합결국 핵또는 myotube에 융합하지 않습니다.
공초점 형광 현미경검사법에 의한 이미징 후, 핵은 입증된 바와 같이 분할될 수 있고 유역 변환은 근처의 물체를 분리하는 데 사용될 수 있다. 이러한 접근법으로, 대부분의 핵은 이미지에서 확인되어 핵 운동이 입증된 대로 추적될 수 있게 한다. 예를 들어, 궤적의 총 길이가 Hoechst로 염색된 세포의 경우 약간 더 높은 것으로 보입니다.
차이는 중요하지 않지만. 그러나, 시간 경과 동안 총 변위의 계산은 Hoechst로 염색된 세포의 총 변위가 얼룩지지 않은 세포의 총 변위가 스테인드 셀의 결과보다 훨씬 작다는 것을 보여줍니다. 예측된 바와 같이, 염색되지 않은 세포에 대한 총 연간 변이는 Hoechst로 염색된 세포에 비해 상당히 작습니다.
생물학적 단계의 기술적 기술을 공초점 현미경 및 소프트웨어 사용 단계와 결합할 때 특히 입증된 프로토콜을 정확하게 따르는 것이 중요합니다. 다른 근육 모델에서 근아세포 분화 및 핵 포지셔닝을 연구하기 위해 형광 핵 단백질로 고립된 myoblast를 이전할 수 있다. 이 기술은 근육 분화 도중 세포및 핵 역학을 탐구하고 이 프로세스에 있는 결점을 더 조사하는 쪽을 포장했습니다.
근 이영양증과 같은 다양한 병리학 적 조건하에서.
