Name: isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
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프로토콜은 동물 실험, 이론적 근거와 연구의 목적을 수행하기 위해, 남부 캘리포니아 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 제출하여 승인을했다. 취소 확인 된 인간의 식도 표본에서 차 문화의 설립을위한 프로토콜은 남부 캘리포니아 심사위원회 (Institutional Review Board)의 대학에 의해 승인되었다. 1. 마우스 또는 인간의 식도를 얻습니다 <ol><li> 마우스 식도를 얻습니다 <ol><li> 자궁 경부 전위 다음에 2 % 이소 플루 란 흡입 과다 복용으로 8-12 일 이전 마우스를 안락사. </li><li> 아래로 향 배와 동물을 핀 및 70 % 에탄올로 복부 표면을 젖은. 핀셋으로 잡고 집게로 요도에 피부 앞쪽을 들어 올립니다. 턱 요도에서 복부 정중선을 따라 잘라 표준 바로 수술 가위를 사용합니다. 만 피부를 잘라주의하십시오. &lt;/ 리&gt; <li> &quot;Y&quot;거꾸로 형성 동물 양쪽 무릎 하방 개구부로부터 요도 절개를. 흉곽 따라 동물의 양쪽에 다른 절개를합니다. </li><li> 조심스럽게 기본 복막과 흉곽의 떨어져, 양쪽의 피부를 벗겨과 측면에 누워. 흉강과 복강을 덮는 복막 위에 놓인 흉곽을 검사합니다. <ol><li> 복부 내용에 대한 손상을 방지하기 위해 위쪽으로 가위를 가리키는 집게로 복막을 들어 올려 다이아 프램과 흉곽에 그것을 통해 잘라. 부드럽게, 간 좌엽을 들어 기본 위, 식도 - 위 접합부와 식도의 복부 부분을 노출. </li></ol></li><li> 자궁 거들까지의 중간 선을 따라 흉골과 흉곽 통해 잘라 멸균 수술 가위를 사용합니다. 포인트 가위 위로 흉부 내용의 손상을 방지합니다. 완전히의 내용을 노출측면에 갈비뼈를 잡아 당겨 흉강. </li><li> 조심스럽게 심장과 폐의 두 엽을 제거합니다. Q-팁 초과 혈액을 흡수한다. 식도는 흉추에 기관 및 전방에 좁은 유연한 튜브 거짓말 후방입니다. 참고 : 식도는 쥐의 신생아 식별하기 어려울 수있다. 식도 - 위 접합부의 현지화 식도 식별이 간단합니다. </li><li> 조심스럽게 주위의 혈관, 지방을 해부, 위장에서 식도를 따라 자궁 경부 공동의 식도 기원까지 모든 방법을 장간막. 무딘 끝 외과 용 가위는이 목적을 위해 최선을 작동합니다. </li><li> 후술하는 추가 처리를 위해 행크스 평형 염 용액 (HBSS)의 식도와 위의 전체 길이를 절제. 원하는 경우 방향을 위해 위의 일부를 제거합니다. 참고 : 작은 조직의 크기로 인해, 근육에서 근육 판의 고유 층의 분리점막 뮤린 신생아 식도에서 달성되지 않고, 전체 식도 후술 처리를 받게된다. </li></ol></li><li> 인간의 식도를 얻습니다 <ol><li> HBSS와 식도 절제 표본 (일반적으로 5cm 이하) 세척 및 장착 된 결합 조직, 지방, 또는 혈관을 제거합니다. </li><li> 시험편의 일부를 절제하고 필요하다면 향후 조직학 검사를 위해 포르말린에 놓는다. </li><li> 날카로운 해부하여 기본 근육 판의 고유 층에 남아있는 점막을 분리합니다. </li><li> 아래에 설명 된 프로토콜 서브 cm 조각으로 점막과 주제를 잘라. NOTE : 인간 식도 절제술 후술 처리 전에 최대 6 시간 동안 PBS에 저장 될 수있다. 식도 표본의 자료는 표본 크기를 지시하고 실험실 의존한다. </li></ol></li></ol> 2. 격리 설치류와 인간의 식도 기질 세포 <ol><li> F 식도 기질 세포를 분리기계 및 소화 효소의 조합에 의해 롬 쥐와 인체 조직. <ol><li> 기계적으로 HBSS 가위 여러 ​​세척과 조직을 닦지에 의해 소화. 효소 ml의 300 U / 콜라게나 제 XI 0.1 ㎎ / 25 분 (쥐의 조직)에 대한 ml의 디스 파제 또는 최대 6 시간 (인체 조직)의 조직 배양에 의해 소화. 닦지에 사용되는 악기는 멸균 및 살균되어 있는지 확인합니다. 참고 : 콜라게나 콜라겐, 함께 동물 조직을 유지하기위한 책임이 세포 외 기질 단백질 분해 효소이다. 콜라게나 제 XI 높은 콜라게나 제 활성을 가지고 있으며,이 격리 프로토콜의 성공을 보았다. 디스 파제는 세포막 활성을 유지하고 보조 효소로서 콜라게나 제와 병용되는 온화한 단백 분해 활성을 갖는 세균의 효소이다. </li><li> HBSS를 포함하는 1.7 ml의 마이크로 원심 분리기 또는 5 ml의 튜브에 마우스 나 인체 조직에서 얻은 점막 조각을 놓습니다. 말하다 조직 추가각각의 튜브에 맞는 오픈 팁 폭으로 가위를 사용하여 2-3mm 조각으로. 식도 점막 단편이 튜브 바닥에 침전하는 충분한 시간을 허용 할 수있다. </li><li> 천천히 실수로 조직을 삭제하지 않도록주의, HBSS를 가만히 따르다. 신선한 HBSS는 부드러운 흔들림에 의해 다음과 같이 교체합니다. 또한, 1 ml의 피펫으로 HBSS를 제거합니다. </li><li> 부드러운 식도 조각이 각 세척 사이에 침전을위한 시간을 허용 세척 사이에서 진탕이 방법으로 8 배의 총 조직을 씻으십시오. 참고 : 인간의 조직은 신생아 마우스 조직을 닦지 더 필요합니다. </li></ol></li><li> ml의 300 U / 콜라게나 제 XI 실온에서 느린 속도로 설정 흔들 통에 25 분 0.1 ㎎ / ㎖ 디스 파제와 쥐의 조직을 품어. <ol><li> 실온에서 느린 속도로 설정 흔들 통에, 최대 6 시간 동안 300 U / ㎖의 XI 콜라게나 0.1 ㎎ / ㎖ 디스 파제 인간의 조직을 품어. 참고 : 인간 esopha의 가용성거스는 변수입니다. 인간의 식도 점막은 차 문화의 성공적인 세대에서 최대 6 시간의 결과를 효소로 배양 하였다. </li></ol></li><li> 효소 소화 한 후, 10 분 동안 200 XG에 가위와 원심 분리기와 더 말하다 조직. </li><li> 상층 액을 제거한다. 생존 할 세포 및 잔해를 제거하기 위해 2 % 소르비톨 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 5 회 5 ㎖ 튜브에 혼합 된 세포 현탁액으로 이루어진 펠릿을 전송하고 세척 하였다. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 DMEM 6- 웰 플레이트 및 배양 (FBS), 10 ㎎ / ㎖의 인슐린, 10 μg의 종자 세포 / ㎖ 트랜스페린, 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 2 ng / ml의 상피 세포 성장 인자 (EGF) . 진공 필터 (0.22 μm의) 여과 후 추가 할 수 있습니다 EGF를 제외한 모든 구성 요소. 절제의 크기에 따라 여러 6 웰 플레이트 사이에 인간의 절제 표본에서 얻은 세포를 배포합니다. </li><li> 우물은 80 %의 합류가되면, T25에 통과 부착 세포는 우리를 플라스크보내고 0.05 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA). 400 x g에서 미디어와 스핀으로 중화. <ol><li> T25 플라스크에 6 잘 통로를 들어, 하나의 통로 세포 : 1의 비율. 2 또는 1 : 3 비율로 합류 T25 플라스크는 1 계대 배양 할 수있다. : 1 비율로 T75 플라스크에 T25 플라스크에서 통과하려면 1을 사용합니다. 2-3 일마다에 관계없이 선박의 변경 미디어. </li><li> 위에서 설명한 근섬유 미디어의 가습 5 % CO 2 배양기와 문화에서 37 ºC에서 세포를 성장. 참고 : 상피 세포가 이러한 문화 또는 통과 조건에서 생존하지 않습니다. 특성화 및 후술 연구에 사용 된 세포는 통로 (5) 및 (15) 사이이다. </li><li> 근섬유 매체 10 % 디메틸 술폭 시드를 첨가하여 액체 N 2 세포는 냉동 보존 -. </li></ol></li></ol> 3. 성격을 설치류와 인간의 식도 기질 세포 <ol><li> 거꾸로 현미경으로 세포의 형태를 검사합니다. 스핀들 모양을 관찰부착 성 세포의 형태 (도 1). </li><li> α-SMA, 멘틴, 최근 desmin 및 아세포 다음 골격 마커의 평가에 의해 배양 된 세포를 특성화. 근섬유 같은 표현형과 기질 세포는 α-SMA 및 멘틴 (그림 2) 세포 골격 근섬유 마커를 표현한다. <ol><li> 더욱 최근 desmin위한 발현 사이 근육 세포로부터 배양 기질 세포를 구별한다. 배양 된 세포에 면역 염색을 수행하려면, 4 잘 챔버 슬라이드에 1.5 × 10 4 세포를 판 24 시간 동안 근섬유 미디어에서 성장합니다. 근섬유 같은 표현형과 기질 세포는 약하거나 결석 최근 desmin 식을해야합니다. 간질 세포가 상피 마커 팬 아세포의 발현이 부족하다 (데이타는 나타내지 않음). 참고 : 문화의 평가가 유동 세포 계측법에 의해 면역 세포와 세포 표면 마커에 의한 세포 골격 마커의 평가를 포함한다. 면역 세포 화학은 전 같은 특성의 기본 방법으로 사용됩니다세포 골격 단백질의 Pression의 프로파일은 섬유 아세포, 근섬유 아세포 또는 근육 세포에 대해 고유하다. 유동 세포 계측법은 상피 세포, 내피 세포, 조혈 세포 마커의 세포 표면 발현을 평가하여 배양 순도를 확립한다. CD90는 인간 섬유 아세포와 근육 섬유 모세포에 모두 표현으로 인간의 기질 세포를 식별의 보조적인 방법으로 도움이됩니다. 그것은 또한 쥐 T 세포에 의해 표현되는 CD90는 뮤린 기질 세포의 특성 분석에 도움이되지 않는다. </li></ol></li><li> 세포가 60 % 합류에 도달 한 후, 인산 완충 식염수 (PBS)와 슬라이드를 씻어 메탄올로 고정한다. -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 세포를 품어, 다음 사용까지 4 ° C에서 PBS에 저장합니다. </li><li> 표준 면역 염색 프로토콜을 따르십시오. </li><li> 간략하게, 일차 항체를 적용하기 전에, PBS 중 5 %로 고정 goatserum 셀 블록. 뿐만 아니라 5 % 염소 혈청의 일차 및 이차 항체를 희석. <ol><li> α-SMA 및 멘틴의 검출을 위해 사용다음 항체 농도 : 마우스 단클론 항체는 α-SMA를하는 1 : 500 희석 : 1에서 멘틴 250 희석 토끼 PAB. </li><li> , 4 ° C에서 하룻밤 실온에서 일차 항체와 함께 품어 PBS로 3 회 씻어 1의 희석 로다 민 결합 염소 항 마우스 이차 항체를 추가 : 1 시간 동안 1,000 : 1의 희석에 200 CY2 결합 염소 항 토끼 실온에서 첨가 하였다. </li><li> Counterstain과 핵 4 &#39;, 1 분 동안 1 ㎍ / ml의 농도에서 6 Diamidino-2Phenylindole (DAPI) 다음 PBS로 세척한다. 거꾸로 현미경 슬라이드를 분석합니다. </li></ol></li><li> 조혈에 대한 쥐와 인간의 식도 세포 검사 (CD45) 및 유동 세포 계측법에 의한 내피 세포 (CD31) 세포 표면 마커 (그림 3)에 의해 문화의 순도를 설정합니다. 간질 세포 표면 마커 CD90의 발현에 의해 상기 인간 세포를 특성화. 주 : CD90은 T의 뮤린 CEL 같은 뮤린 간질 세포를 식별하기 위해 사용될 수 없다LS는 또한 CD90를 표현한다. <ol><li> , 회 FACS 완충액으로 세척 카운트 관련 이소 타입 컨트롤 FITC-CD45 및 APC-CD31 염색, 10 분 동안 37 ℃에서 비 - 효소 적 세포 해리 용액으로 처리하여 배양 플라스크에서 배양 된 마우스 식도 간질 세포를 분리있어서 표준 염색 절차. </li><li> 외과 팩스 칼리버를 사용하여 세포를 수집하고 FlowJo 소프트웨어와 데이터를 분석 할 수 있습니다. 세포 염색 전에, 항체 이소 타입을 최적화하고 제어 정상적인 마우스 비장 및 골수 세포를 이용하여 농도를 적정. </li></ol></li></ol>

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	<li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair.">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li><li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria.">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Helper+2+Cytokines,+Transforming+Growth+Factor+beta1,+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis.">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts.">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response.">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li><li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion.">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li><li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture.">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li><li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue.">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li><li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities.">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li></ol>

이 작품은 굿 생리학과 건강 (AS)와 라이트 재단 파일럿 상 (AS)에 NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), 건강의 AGA-제너럴 밀스 벨 연구소 및 영양 연구 학술 상에 의해 지원됩니다.

조직의 크기에 적합한 닦지 소화 회 뮤린 또는 인체 조직을 사용할 때 차 배양 생성 기법은 일반적으로 유사하다. 뮤린 조직의 경험은 상술 한 방법을 사용하는 것이 일관되게 차 배양의 성공 확립 될 것을 제안한다. 프로토콜 내에서 중요한 단계는 수술 장비의 살균 및 조직 문화의 표준 멸균 기술을 다음과 같습니다. 마우스의 나이는 중요한 단계입니다. 8~12일 된 신생아는 지속적으로 성공 차 ?...

상피 기질 상호 작용 재생 점막, 보수, 섬유증 및 발암 1,2- 포함한 위장관 다양한 기능의 조절에 관여한다. 이러한 상호 작용은 가장 작은 창자 및 결장에서 연구되었다 마찬가지로 식도 점막 질환 3에서 역할을 수행 할 수있다. 장과 대장 기질 세포라고 근육 섬유 모세포의 하위 집단은 조직 손상, 염증을 중재에 참여하고 4,5를 복구하는 입증되었다. 원위 위장관에서 이러한 스핀들 모양의 세포는 상피와 고유 층 사이의 계면에서 기저막에 인접하고, α-SMA 및 멘틴으로 정의 된 양,-팬 아세포 부정하고, 약한 양성 또는 최근 desmin 5 음. 식도 기질은 엄격하게 세포 또는 분자 수준에서 특징되지 않았습니다. 쥐의 식도에있는 우리의 작업은 취소했다monstrated의 α-SMA 편평 상피 6 때때로 밑의 식도 기질과 멘틴 세포. 상피 세포 - 기질 상호 작용 등의 위식도 중재 부상 (6)과 호산 구성 식도염 3과 식도 점막 질환에 연루되어있다. 섬유 성 협착은 위장 섬유증의 발병에 연루되어 식도 부상과 간질 세포의 알려진 합병증이다. 이러한 세포의 분리 미친 신호 전달 경로를 조사하는 데 필요한 연구를 수행하는 데 도움이됩니다. 이 제출는 이러한 상호 작용을 매개하는 신호 전달 경로에 대한 지식을 기존의 격차가 해결 될 수 있도록 α-SMA 긍정적 인, 멘틴 긍정적 인 근육 섬유 모세포의 차 문화를 구축하는 데 필요한 기술을 제공합니다. 기재된 기술이 성공적 일차 결장 뮤린 근섬유 7 furthe를 확립 저자 사용되고R 6은 뮤린 및 인간 근섬유 같은 식도 기질 세포의 확립을위한 장치. 여기에서 우리는 설정하고 마우스 또는 미래의 기능 연구에 사용하기 전에 인간의 식도에서 설립이 문화를 특징 짓는 데 필요한 조건을 설명합니다. 배양액을 성장시키고, 그 최대 15 계대 이용 될 수있다. 아래에 설명 된 방법을 통해 분리 및 차 문화의 설립은 근섬유 표현형과 간질 세포를 생성; , vimentin에 양성하고, 약한 양성 또는 최근 desmin에 음성 및 아세포 네거티브 SMA를 α. 이 표현형은 주로 멘틴 양성 식도 섬유 아세포의 표현형, 음의 α-SMA 3 근층 점막 (6)의 α-SMA 양성, 멘틴 부정적인 표현형 구별된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tissue culture reagents</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>trypsin/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagents for immunostaining</td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Mouse mAB to &amp;alpha;-SMA&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAB to vimentin</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 conjugated Goat anti Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 conjugated to eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 conjugated to APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V and 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Fc block for CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>5 ml tube</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety cabinet and incubators</td><td>Nuaire</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.nuaire.com/products/&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.nuaire.com/products/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>4-well chamber slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Vacuum-Driven Filter System</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>6-well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flasks</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Dissection scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single tipped Q-Tips</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Metamorph software (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of myofibroblasts from mouse and human esophagus

설치류와 인간의 식도 근육 섬유 모세포는 소화 효소를 통해 생성된다. 신생아 (8~12일 세) 쥐의 식도, 수확 다진, 세척하고, 25 분 동안 콜라게나 제와 디스 파제와 소화 효소 실시한다. 인간 식도 절제 표본 근층 고유 층과 외막의 벗겨, 나머지의 점막 다진되고, 최대 6 시간 동안 콜라게나 제와 디스 파제 및 소화 효소를 실시. 배양 된 세포는 α-SMA 및 멘틴 및 명시 최근 desmin 약하게 또는 전혀 표현한다. 배양 조건은 상피 세포, 조혈, 또는 내피 세포의 성장에 도움이되지 않습니다. 문화 순도는 또한 잠재적 오염 조혈 및 내피 세포의 세포 표면 마커의 발현을 유세포 평가에 의해 확인된다. 설명 된 기술은 간단하며 비 hematopoieitc 비 내피 간질 세포의 일관된 발생을 초래한다. 이 기술의 한계의 사용에 내재즉, 분자 생물학 연구의 주요 문화, 피할 수없는 변화는 다른 쥐 또는 인간 전반에 걸쳐 문화 사이에 발생했습니다. 그러나 차 배양 세포주에 비해 생체 상태의 대표성 반사된다. 이러한 방법은 연구자들에게 집단 간의 비교를 가능하게 분리 할 수​​있는 능력과 다른 임상 및 실험 조건에서 배양 기질 세포를 제공한다. 특성화 식도 기질 세포는 식도 상피의 질환 - 간질 상호 작용을 조사하는 연구에 사용될 수있다.

기계 및 소화 효소를 사용하여 격리 식도 기질 세포는 처음 도금 6 웰 플레이트에서 배양된다. 도금 시간 내에 거꾸로 현미경으로 세포의 시험은 판 바닥 (그림 1A)에 느슨하게 부착 혼합 세포 현탁액을 보여줍니다. 다음 24 시간에 걸쳐, 접시 바닥에 견고하게 부착 방추형 세포가 혼합 된 세포 현탁액 돋 셀 웰 오일 내에서의 전체 영역을 커버 및 형태 유지, 성공적으로 계대 수 .These <str...

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Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

마우스 및 인간의 식도에서 근섬유 아세포의 분리

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

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Biology

10.9K 조회수.  Keck School of Medicine, University of Southern California. We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions. 

비디오: Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Isolation of CD 90+ Fibroblast/Myofibroblasts from Human Frozen Gastrointestinal Specimens

Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and promotion of the tumor microenvironment. While there are currently many techniques for the isolation of MFs from gastrointestinal (GI) tissues, this protocol introduces a novel element of isolation of these stromal cells from frozen tissue. Freezing GI tissue specimens not only allows the researcher to acquire samples from worldwide collaborators, biobanks, and commercial vendors, it also permits the delayed processing of fresh samples. The described protocol will consistently yield characteristic spindle-shaped cells with the MF phenotype that express the markers CD90, &#945;-SMA and vimentin. As these cells are derived from patient samples, the use of primary cells also confers the benefit of closely mimicking MFs from disease states-namely cancer and inflammatory bowel diseases. This technique has been validated in gastric, small bowel, and colonic MF primary culture generation. Primary MF cultures can be used in a vast array of experiments over a number of passage and their purity assessed by both immunocytochemistry and flow cytometry analysis.

Here, a protocol to isolate and establish primary fibroblast/myofibroblast (MF) cultures from frozen gastric, small intestinal, and colonic tissue-yielding cells with a MF phenotype-is presented. These cells express CD90, &#945;-SMA and vimentin. MFs can be used for a variety of functional assays including enzymatic activity and cytokine production.

인간의 냉동 위장 표본에서 CD 90+ 섬유 아세포 / 근섬유 아세포의 분리


Fibroblasts/myofibroblasts (MFs) have been gaining increasing attention for their role in pathogenesis and their contributions to both wound healing and ...

연구

발생학

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

생체공학

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

생물학

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

마우스와 인간의 대장 조직에서 주요 근육 섬유 모세포의 분리

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

초음파 증강 원발성 섬유아세포 분리

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

의학

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

쥐 장 중간엽의 분리로 텔로세포의 높은 수율

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Functional Characterization and Visualization of Esophageal Fibroblasts Using Organoid Co-Cultures

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell populations are tucked away in anatomically distinct locations, enabling exclusive interactions with niche signals that maintain stemness. While the development of epithelial organoid cultures provides a powerful tool for understanding the role of stem and progenitor cells in homeostasis and disease, the interaction within the niche environment is largely absent, thereby hindering the identification of factors influencing stem cell behavior. Fibroblasts play a key role in directing epithelial stem and progenitor fate. Here, a comprehensive organoid-fibroblast co-culture protocol enabling the delineation of fibroblast subpopulations in esophageal progenitor cell renewal and differentiation is presented. In this protocol, a method to isolate both epithelial cells and fibroblasts in parallel from the esophagus is described. Distinct fluorescence-activated cell sorting strategies to isolate both the esophageal progenitor cells as well as the fibroblast subpopulations from either transgenic reporter or wild-type mice are outlined. This protocol provides a versatile approach that can be adapted to accommodate the isolation of specific fibroblast subpopulations. Establishing and passaging esophageal epithelial organoid mono-cultures is included in this protocol, enabling a direct comparison with the co-culture system. In addition, a 3D clearing approach allowing for detailed image analysis of epithelial-fibroblast interactions is described. Collectively, this protocol describes a comparative and relatively high-throughput method for identifying and understanding esophageal stem cell niche components in vitro.

Organoid-fibroblast co-cultures provide a model to study the in vivo stem cell niche. Here, a protocol for esophageal organoid-fibroblast co-cultures is described. Additionally, whole mount imaging is used to visualize the fibroblast-organoid interaction.

Functional Characterization and Visualization of Espacageal Fibroblasts using organoid co-cultures (오가노이드 공동 배양을 이용한 식도 섬유아세포의 기능적 특성 분석 및 시각화)

Epithelial stem and progenitor cells contribute to the formation and maintenance of the epithelial barrier throughout life. Most stem and progenitor cell ...