이 책에서보고 된 연구는 휴스턴 대학의 새로운 능력을 부여, 초전도에 대한 텍사스 센터에서 시드 부여하고, 미국 화학 학회 석유 연구 기금 (52537-DNI)에 의해 지원되었다.

콜로이드 중합체 혼합물의 하나. 제조 주 :이 프로토콜은 폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA) 입자, 입체적 폴리 (12 - 하이드 록시 산)를 사용하여 안정화 및 표준 다음 합성 하였다 (예 나일 레드, 로다 민 B, 또는 플루오 레세 인 등) 형광 염료로 표지를 사용 조리법 52. <ol><li> 주식 용매로 헥실 브로마이드 (CXB)과 데카 (DHN)의 3:1 W / W 혼합물을 준비합니다. 이 혼합물은 거의 입자의 굴절의 밀도 및 인덱스와 일치합니다. 부분적으로 입자에 전하를 화면에 1.5 mm의 농도로 용매에 유기 염, 테트라 부틸 암모늄 클로라이드 (TBAC) 46을 추가합니다. </li><li> DHN 용매 : 정확하게 입자의 밀도를 확인하려면 대략 입자의 부피 분율 Φ에서 서스펜션 = CXB 0.10를 준비합니다. 75 분 800 XG에 현탁액을 원심 분리기 및 부력을 향상시키기 위해 CXB 또는 DHN의 적하 추가일치. 이들 실험에서, PMMA 입자의 밀도 = 1.223 g / ㎖ ρ 될 측정 하였다. </li><li> DHN 혼합 용매 : CXB의 PMMA 입자의 집중 주식 서스펜션 (여기서, Φ = 0.40) 준비합니다. </li><li> DHN 혼합 용매 : CXB 선형 폴리스티렌 (PS)의 농축 된 용액을 준비합니다. 여기에, 3,000,000가 (선회 R G = 15 ㎚의 반경) 50 ㎎ / ㎖ ≈ 농도 C의 P에서 준비 ≈ W 분자량 M의 PS의 솔루션을 제공합니다. </li><li> 입자와 고분자의 원하는 농도로 현탁액을 공식화하는 입자, 폴리머, 용제 주식 혼합물의 가중치를 적절하게 혼합한다. 참고 : 여기에, 단 분산 입자의 현탁액은 일정 콜로이드 체적 분율 Φ에서 준비 = 무료 볼륨 53 C의 P 0.15 변수 중합체 농도 = 0 ~ 25 ㎎ / ㎖ 및 W, 콜로이드 입자의 두 가지 크기를 포함하는 현탁액을 bidispersed독특한 형광 라벨 담지 i 번째의 각 크기는 고정 된 전체 콜로이드 부피비 Φ로 제조된다 = 소립자 0.15, 체적 분율의 비율은 5 ~ 25 ㎎ / ㎖의 자유 부피 = 0.50 R 및 중합체 농도. </li><li> 각 현탁액을 제조 한 후, 현탁액 내의 입자 클러스터 부력 일치 남아 있는지 확인하기 위해 최소 75 분 800 XG에 CXB 또는 DHN 적하 원심 분리기 샘플을 추가합니다. </li><li> 이전의 영상 실험에 최소 24 시간 동안 모든 샘플을 평형. </li></ol> . 2 대기 샘플 실험 : 위상 동작 <ol><li> 벌크 상 거동을 결정하기 위해, 유리 커버 슬립 (그림 1a)에서 직사각형 챔버를 제작. 이 연구에서 콜로이드 고분자 혼합물의 경우, (현미경 슬라이드의 두께에 의해 설정) 두께 H = 1 ㎜의 챔버 대량 동작을 제공합니다. </li><li> 하나의 현미경 실험에서 여러 confinements에 액세스하려면, 얇은 쐐기 - 제작하나의 웨지에 스페이서로서 단일 커버 슬립을 사용하여 실 모양 (도 1B). 뷰의 단일 필드에서 벽은 매우 거의 평행이되도​​록 챔버의 개방 각도는 &lt;0.5 °이다. 대표적인 챔버&gt; 100 μm의 = 6 시간의 구속 두께에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 이미징을위한 커버 슬립베이스에 실을 구축하고 CXB-DHN 혼합 용매에 용해되지 않는 UV 경화형 에폭시로 밀봉. </li><li> 공 초점 현미경을 사용하여 이미지 샘플. 이 프로토콜은 NA가 1.40 = 개구의 100X 기름 침지 렌즈가 장착 된 거꾸로 현미경에 부착 된 라인 스캐닝 공 촛점과 영상을 보여줍니다. </li><li> 레이저 소스를 사용하여 염료를 여기. 여기에서 λ = 491 또는 561 nm의 각각의 형광 및 로다 민 / 나일 레드 염료를 자극하는 데 사용되는 파장을. </li><li> 포인트 - 스캔 시스템에서 급속에서 (샘플에 걸쳐 초점을 스캐닝 x-의해 화상을 생성공 초점 소프트웨어를 사용하여 Y 평면). 512 픽셀의 2 차원 이미지가 1 / 32 초에서 획득 할 수있는 약 50 ㎛ × 50 ㎛의를 덮고 512 픽셀, 배. 여러 이미지들을 평균하거나 획득 시간을 증가시킴으로써 화질을 향상시킨다. </li><li> 챔버의 바닥을 찾습니다 (Z = 0), 그 아래에 부착 된 입자에 초점을 맞춤으로써, 예를 들어. 이 설정에서, 높이 (z)는 챔버 내로 포커스 증가와 함께 증가한다. </li><li> 예로서, 챔버의 미드 플레인에서 (XY 평면) 화상의 2-D의 시계열을 취득함으로써 입자의 역학에 구속 효과를 특성화. 전형적인 실험에서, 치수 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀이 1 프레임 / 초의 프레임 속도 (시간의 Δt = 1 초 간격)에 인수된다. </li><li> 두 번째 예로서, 화상의 입체 시리즈 (x, y, z)를 취득하여 입자의 3-D 구조를 특성화. 전형적인 실험에서, 이차원 이미지 (512 화소 × 512 화소)이다ΔZ의 일정한 간격 = 압전 설정 연속 된 이미지 사이에 0.2 μm의와, 챔버 내에서 여러 Z 위치에 인수했다. H의 두께를 포함하는 볼륨 스택 = 30 μm의, 따라서 151 이미지가 포함되어 있습니다. </li><li> 찾기 및 2-D 또는 3-D에서 시간이 지남에 따라 추적 입자 IDL 23,54-56, MATLAB 57, 58, LabVIEW는 59, 파이썬 (60)로 작성 입자 추적 소프트웨어를 사용하여. 이러한 알고리즘은 일반적으로 입자의 중심이 40 ~ 50 나노 미터 내에 해결 될 수있다. 성공적인 입자 추적 입자가 연속 된 프레임 사이의 입자 간 간격보다 이동하는 것이 필요합니다. </li><li> 입자의 위치에서, 구조 및 동적 통계를 계산합니다. 여기에 도시 된 세 가지 편리한 메트릭 (3-D 쌍 상관 함수 g (R) (61), 2-D, 평균 제곱 변위 (MSD) 58,62, 및 반 호브 상관 함수 G (S)의 2-D자가 일부인 x, t) 58. 후자의 두 메트릭은 또한 3-D로 계산 될 수있다. </li></ol> . 3 흐르는 실험 : 유동 특성 <ol><li> 테프론 튜브에 부착되어 사각형 단면 (100 μM × 100 μM)와 유리 마이크로 모세관을 사용하여 간단한 플로우 셀을 제조. 도 7에 개략적으로 도시 된 바와 같이, 모세관을 지원 및 기계적 강성을 제공하기 위해 유리 커버 슬립을 사용한다. </li><li> 유리 주사기에 콜로이드 폴리머의 혼합물을로드합니다. 주사기 펌프 또는 공기 유체 분배 시스템에 주사기를 연결합니다. </li><li> 거꾸로 현미경에 흐름 전지 설치를 탑재합니다. 유량 프로파일에 중력의 영향을 최소화하기 위해 동일한 높이로 셀 및 유출 흐름 주사기 유지. </li><li> (시린지 펌프) 체적 유량 또는 (압력 상자)인가 압력에 의해 유동 셀을 통해 현탁액의 유량을 제어한다. 마이크로 채널에있는 현탁액의 평균 속도는 SU에 의존spension 제제. 여기에서 측정 된 사각형 마이크​​로의 최대 속도의 일반적인 값은 200-2,000 μm의 / 초이다. </li><li> 흐름 동안, 빠른 프레임 속도에서 2-D 촛점 시계열을 획득. 여기서 차원의 500 이미지가 X 512 픽셀 512 픽셀 Z에서 = 5에 이르기까지 마이크로의 바닥 (Z = 0 μm의) 위의 서로 다른 높이에 (시간 간격 Δ의 T = 1 / 32 초) 32 프레임 / 초에 취득 - 50 ㎛. 7 그림 삽입과 같이 각각의 이미지는, 마이크로의 측면 치수 (Y)의 약 절반을 커버한다. 입자가 타원 나타날 경우 인수의 프레임 속도를 향상시킬 수 있습니다. </li><li> 대기 실험에서와 같이, IDL 또는 MATLAB에서 입자의 위치 및 추적에 대한 표준 알고리즘을 사용하여 2-D의 입자를 찾습니다. 입자는, 프레임 사이의 평균 입자 간 거리보다 적게 이동 궤적을 구하는 추적 알고리즘을 사용하는 느린 흐름하십시오. </li><li> CALC 이미지의 상관 관계를 사용하여ulate 빠른 흐름의 속도 프로파일. <ol><li> 흐름의 방향을 따라 일정한 높이 (Y)의 수평 이미지로 이미지를 세분 (X). 두 순차 이미지 I 1 (X, Y) 및 I 2 (X, Y)에 대한 계수 ΔX에 의해 후자의 이미지를 이동하고 나서 1 (X, Y) 사이의 교차 공분산을 계산하고 I 2 (X + ΔX, Y). </li><li> 각각의 횡 방향 위치 (y)에서의 평균 이류 속도를 얻기 위해 이미지의 각 쌍 사이의 크로스 공분산을 최대화 ΔX 값들의 히스토그램의 피크 위치를 식별한다. 이러한 분포가 강하게 뾰족하지 않은 경우 빠른 프레임 레이트로 영상을 획득. </li></ol></li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

마이크론 크기의 콜로이드 입자는 원자와 분자보다 훨씬 느린 역학을 전시하기 때문에 쉽게 몇 군데 시간 10 이상 추적 할 수 있기 때문에 콜로이드 현탁액은 널리 국한 상 거동에 대한 모델로 연구한다. 이러한 기초 연구의 경우, 밀폐 된 단계 행동에 입자 간 관광 명소의 효과를 이해하는 것은 모세관 응축 및 증발 21,22,67 등의 현상을 탐구 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 밀?...

이 논문은 대기 흐르는 국한 콜로이드 고분자 두의 혼합물 및 세 가지 차원와 (b) 입자 추적 및 상관 관계 상 거동 및 유동 특성에 대한 정량적 인 정보를 얻기 위해 생성 된 이미지의 분석 () 공 초점 영상을 보여줍니다. 매력적인 입자 간 상호 작용 콜로이드 현탁액은 직접 조립 1-3, 약물 전달 4, 개선 된 탄화수소 복구 5-7, 에너지 저장 8 재료로 기술 응용 프로그램에서 보편적으로 나타납니다. 이러한 응용 프로그램의 일반적인 특징은 입자는 노즐, 프린트 헤드, 마이크로, 또는 다공질 미세한 형상을 통해 유입되어야하며, 및 / 또는 얇은 필름 또는 봉으로 형성 될 것입니다. 전자 현미경 (17, 18), x-레이 현미경 (19), 및 레이저 회절 m 등 좁은 형상, 미크론 크기의 콜로이드의 구조를 조사하는 데 사용되는 기술20 icroscopy, 마이크로 스케일의 입자의 구조와 역학을 측정하는데 사용될 수있다. 이러한 기술은, 그러나, 구조 및 동적 메트릭 수치 시뮬레이션 21,22 직항 비교를 위해 계산 될 수있는 개별 입자의 궤적에 대한 액세스를 허용하지 않는다. 공 초점 현미경 형광 샘플의 얇은 부분의 영상을 가능하게 형광 현미경의 변종이다. 콜로이드 과학 (10)의 경우,이 기술은 깊은 밀도 현탁액 내에서 또는 세 가지 차원으로 이미징에 특히 유용합니다. 입자 추적 알고리즘 (23)는 보이는 모든 입자의 궤적을 수득 둘 또는 공 초점 현미경의 입체 시계열에 적용. 결과적으로, 공 초점 현미경 및 입자 추적의 조합 순서 결정 24-27 및 장애를 포함하여, 상 거동, 구조 및 콜로이드 현탁액의 동역학을 연구하기 위해 적용된ED는 28 ~ 31, 젤 32-35 안경. 기타 이미지 분석 알고리즘은 공 초점 현미경의 시계열로부터 입자 동역학을 측정하기 위해 적용될 수있다. 예를 들어, 확산 입자 역학 공 초점 차 동적 현미경 (36)를 사용하여 시간이 지남에 따라 강도의 변동을 분석하여 공부하실 수 있습니다. 입자 변위는 입자 간 간격보다 큰 경우, 입자 화상 유속계 38-40에 근거 화상 상관 관계 (37)는 입자의 속도 프로파일을 측정하기 위해 적용될 수있다. 추적 및 상관 관계 알고리즘의 조합은 콜로이드 역학 느리고 빠른 흐름 11-16,41-45을받은 시스템에서 측정 할 수있다. 우리는 매력적인 콜로이드 현탁액 9 모델로 콜로이드 폴리머의 혼합물을 사용합니다. 이러한 혼합물에서, 매력적인 입자 간 전위의 범위 및 강도 비율을 통해 제어된다입자 반경 및 중합체 및 정전 반발력 농도 관성 중합체 반경 가의 유기 염 (46)의 첨가를 통해 제어된다. 입자 간 상호 작용이 깊게 튜닝 될 수 있으므로, 이들의 혼합물의 고화는 광범위 34,47-51 공 촛점 현미경으로 연구되었다. 여기서 우리는 콜로이드 체적 분율이 Φ 고정 개최되는, 대기 흐르는 콜로이드 고분자 혼합물의 공 촛점 이미징 및 이미지 분석 (37)를 보여 = 0.15, 그 프로브 상 거동 및 이들의 혼합물의 유동 특성에 대한 제한의 효과. 이러한 기술은 굴절되어 입자상 시스템에 광범위하게 적용될 수있다 지수 일치하고있는 입자 및 / 또는 용매를 형광 염료로 표지 할 수있다.

<table><tbody><tr><td>Cyclohexyl bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>135194</td><td>CAS Number&amp;nbsp; 108-85-0, Molecular wt. = 163.06, Used in stock solvent</td></tr><tr><td>Decahydronapthalene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D251</td><td>CAS Number 91-17-8, Molecular wt. = 138.25, Used in stock solvent</td></tr><tr><td>Nile Red</td><td>Sigma Aldrich</td><td>72485</td><td>Fluorescent dye</td></tr><tr><td>Fluorescein 5(6)-isothiocyanate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3651</td><td>Fluorescent dye</td></tr><tr><td>Rhodamine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>83689</td><td>Fluorescent dye</td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering&amp;nbsp;</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-APD</td><td>DLS equipment used for particle size measurement</td></tr><tr><td>Polystyrene&amp;nbsp;</td><td>Varian/Agilent</td><td>PL20138-23</td><td>Polystyrene (polymer) for inducing depletion attraction</td></tr><tr><td>Tetrabutyl(ammonium chloride) (TBAC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86870</td><td>monovalent salt</td></tr><tr><td>UV Adhesive</td><td>Norland Adhesive</td><td>NOA 68T</td><td>Part Number 68T01 (UV cured adhesive)</td></tr><tr><td>VT Eye</td><td>Visitech</td><td>VT Eye</td><td>confocal scanner</td></tr><tr><td>VT Infinity</td><td>Visitech</td><td>VT Infinity</td><td>confocal scanner</td></tr><tr><td>Microscope&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>DMI3000B</td><td>Inverted Microscope</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall ST 16</td><td>1-5,000 rpm</td></tr><tr><td>Teflon tubing</td><td>smallparts</td><td>SLTT 26-72</td><td>Zeus PTFE Sublite Wall Tubing 26 AWG 0.016&quot; ID x 0.003&quot; Wall</td></tr><tr><td>Epoxy</td><td>Devcon</td><td>DA051</td><td>5 min epoxy</td></tr><tr><td>Syringe</td><td>Micromate/Cadence</td><td>5004</td><td>glass syringe with metal luer lock tip</td></tr><tr><td>Syringe tips&amp;nbsp;</td><td>Nordson</td><td>7018462</td><td>32 GA precision tips&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Syringe pump&amp;nbsp;</td><td>New Era Pump system Inc.</td><td>NE1002X</td><td>Programmable microfluidic pump (syringepump.com)</td></tr><tr><td>Weigh balance</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB204-S</td><td>0.0001-220 g</td></tr><tr><td>PMMA particles</td><td>synthesized</td><td></td><td>poly(methylmethacrylate) colloidal particles</td></tr></tbody></table>

confocal imaging of confined quiescent and flowing colloid-polymer mixtures

매력적인 입자 간 상호 작용이 제한 콜로이드 현탁액의 동작은 직접 조립 1-3, 약물 전달 4 재료의 합리적인 디자인, 개선 된 탄화수소 복구 5-7, 에너지 저장 8 유동성 전극에 중요합니다. 형광 콜로이드 및 비 흡착 중합체를 함유하는 현탁액은 범위와 입자 간 장르의 강도, 각각 중합체 컨트롤의 입자 반경 농도 관성 중합체 반경의 비로서, 모델 시스템을 호소하고있다. 중합체 특성 및 콜로이드의 체적 분율을 튜닝함으로써, 콜로이드 유체가 클러스터의 유체, 겔, 결정 및 유리 구를 얻을 수있다. 공 초점 현미경, 형광 ​​현미경의 변형은, 광학적으로 투명한 형광 샘플이 묘화 될 수있게 높은 공간 및 세 가지 차원의 시간 해상도를 가진. 이 기술, 작은 핀홀이나에서 현미경 광학계의 초점 체적 벗어나는 시료의 영역에서 블록들 출사 형광 슬릿. 결과적으로, 초점 평면에서의 샘플 만 얇은 부분이 묘화된다. 이 기술은 특히 단일 입자의 규모 밀도 콜로이드 현탁액의 구조와 역학을 조사하는 데 적합합니다 : 입자는 가시 광선을 사용하여 해결 될 수있을만큼 큰 상업 공 초점 시스템 (10)의 전형적인 스캔 속도로 캡처 할 정도로 천천히 확산 . 스캔 속도 및 분석 알고리즘의 개선은 흐르는 현탁액 11-16,37의 양적 공 촛점 이미징을 사용할 수있다.이 논문에서, 우리는 좁은 상 거동 및 콜로이드 고분자 혼합물의 유동 특성을 조사하는 공 초점 현미경 실험을 보여줍니다. 우리는 먼저 콜을 준비밀도와 굴절율이다 OID 중합체 혼합물 일치. 다음으로, 우리는 얇은 쐐기 모양의 세포에 변화 감금에서 대기 밀도 콜로이드 고분자 혼합물 이미징을위한 표준 프로토콜을보고합니다. 마지막으로, 우리는 마이크로 유동 중에 콜로이드 중합체 혼합물을 이미징하는 프로토콜을 설명한다.

공 촛점 이미징 및 입자 추적을 설명하기 위해, 우리는 콜로이드 폴리머의 혼합물을 63 ~ 65의 상 거동에 대한 제한의 효과를 조사 하였다. 이 실험을 위해 콜로이드 직경 2 = 0.865 ㎛,. 콜로이드 부피 분율은 Φ = 0.15로 고정시키고 중합체 C (P)의 농도는 0 내지 23.6 ㎎ / ㎖로 변화시켰다. 대표 공 촛점 이미지는 그림 2 (63), 왼쪽 열에 표시됩니다. 추적 알고리?...

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Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

공 초점 현미경은 매력적인 현탁액을위한 모델 시스템으로 공부하는 이미지 정지 흐르는 콜로이드 폴리머의 혼합물에 사용된다. 이미지 분석 알고리즘은 기하 구속에 의한 변화를 측정 콜로이드 입자의 구조 및 동적 메트릭을 계산하는 데 사용된다.

밀폐 무부하 흐르는 콜로이드 중합체 혼합물의 공 촛점 이미징

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

12.1K 조회수.  University of Houston.  공 초점 현미경은 매력적인 현탁액을위한 모델 시스템으로 공부하는 이미지 정지 흐르는 콜로이드 폴리머의 혼합물에 사용된다. 이미지 분석 알고리즘은 기하 구속에 의한 변화를 측정 콜로이드 입자의 구조 및 동적 메트릭을 계산하는 데 사용된다. 

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

microfluidic 비말 플랫폼 형광 검출 방법

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

연구

생체공학

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

단백질 접기 유학을위한 Microfluidic 믹서

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

제어 합성 및 매우 균일 한 폴리 형광 추적 (<em&gt; N</em&gt; 이소 프로필 아크릴 아미드) 미크로 겔

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

화학

Concurrent Quantification of Cellular and Extracellular Components of Biofilms

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified concurrent distribution of more than two components within biofilms because: 1)&#160;selection of fluorescent dyes having minimal spectral overlap is complicated, and 2)&#160;quantification of multiple fluorochromes poses a multifactorial problem. Objectives: Report a methodology to quantify and compare concurrent 3-dimensional distributions of three cellular/extracellular components of biofilms grown on relevant substrates. Methods: The method consists of distinct, interconnected steps involving biofilm growth, staining, CLSM imaging, biofilm structural analysis and visualization, and statistical analysis of structural parameters. Biofilms of Streptococcus mutans (strain UA159) were grown for 48 hr on sterile specimens of Point 4 and TPH3 resin composites. Specimens were subsequently immersed for 60 sec in either Biot&#232;ne PBF (BIO) or Listerine Total Care (LTO) mouthwashes, or water (control group; n=5/group). Biofilms were stained with fluorochromes for extracellular polymeric substances, proteins and nucleic acids before imaging with CLSM. Biofilm structural parameters calculated using ISA3D image analysis software were biovolume and mean biofilm thickness. Mixed models statistical analyses compared structural parameters between mouthwash and control groups (SAS software; &#945;=0.05). Volocity software permitted visualization of 3D distributions of overlaid biofilm components (fluorochromes). Results: Mouthwash BIO produced biofilm structures that differed significantly from the control (p&#60;0.05) on both resin composites, whereas LTO did not produce differences (p&#62;0.05) on either product. Conclusions: This methodology efficiently and successfully quantified and compared concurrent 3D distributions of three major components within S. mutans biofilms on relevant substrates, thus overcoming two challenges to simultaneous assessment of biofilm components. This method can also be used to determine the efficacy of antibacterial/antifouling agents against multiple biofilm components, as shown using mouthwashes. Furthermore, this method has broad application because it facilitates comparison of 3D structures/architecture of biofilms in a variety of disciplines.

A protocol for the concurrent quantification and comparison of three cellular and extracellular components within biofilms is presented. The methodology involves the use of confocal laser scanning microscopy, biofilm structural analysis and visualization software, and statistical analysis software.

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is a powerful tool for investigation of biofilms. Very few investigations have successfully quantified ...

면역학 및 감염병학

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is strongly regulated by the surrounding flow and nutritional environment. Biofilm growth also increases the heterogeneity of the local microenvironment by generating complex flow fields and solute transport patterns. To investigate the development of heterogeneity in biofilms and interactions between biofilms and their local micro-habitat, we grew mono-species biofilms of Pseudomonas aeruginosa and dual-species biofilms of P. aeruginosa and Escherichia coli under nutritional gradients in a microfluidic flow cell. We provide detailed protocols for creating nutrient gradients within the flow cell and for growing and visualizing biofilm development under these conditions. We also present protocols for a series of optical methods to quantify spatial patterns in biofilm structure, flow distributions over biofilms, and mass transport around and within biofilm colonies. These methods support comprehensive investigations of the co-development of biofilm and habitat heterogeneity.

Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.

바이오 필름 및 서식지의 이질성의 공동 개발을 특성화하기위한 방법

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

호중구 윤회에서 생리 흐름 중 내피 세포 - 세포 접합의 실시간 영상

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces

Adsorption of surface-active molecules to fluid-fluid interfaces is ubiquitous in nature. Characterizing these interfaces requires measuring surfactant adsorption rates, evaluating equilibrium surface tensions as a function of bulk surfactant concentration, and relating how surface tension changes with changes in the interfacial area following equilibration. Simultaneous visualization of the interface using fluorescence imaging with a high-speed confocal microscope allows the direct evaluation of structure-function relationships. In the capillary pressure microtensiometer (CPM), a hemispherical air bubble is pinned at the end of the capillary in a 1 mL volume liquid reservoir. The capillary pressure across the bubble interface is controlled via a commercial microfluidic flow controller that allows for model-based pressure, bubble curvature, or bubble area control based on the Laplace equation. Compared to previous techniques such as the Langmuir trough and pendant drop, the measurement and control precision and response time are greatly enhanced; capillary pressure variations can be applied and controlled in milliseconds. The dynamic response of the bubble interface is visualized via a second optical lens as the bubble expands and contracts. The bubble contour is fit to a circular profile to determine the bubble curvature radius, R, as well as any deviations from circularity that would invalidate the results. The Laplace equation is used to determine the dynamic surface tension of the interface. Following equilibration, small pressure oscillations can be imposed by the computer-controlled microfluidic pump to oscillate the bubble radius (frequencies of 0.001-100 cycles/min) to determine the dilatational modulus The overall dimensions of the system are sufficiently small that the microtensiometer fits under the lens of a high-speed confocal microscope allowing fluorescently tagged chemical species to be quantitatively tracked with submicron lateral resolution.

This manuscript describes the design and operation of a microtensiometer/confocal microscope to do simultaneous measurements of interfacial tension and surface dilatational rheology while visualizing the interfacial morphology. This provides the real-time construction of structure-property relationships of interfaces important in technology and physiology.

Adsorption of surface-active molecules to fluid-fluid interfaces is ubiquitous in nature. Characterizing these interfaces requires measuring surfactant ...

공학

Frugal Imaging Technique of Capillary Flow Through Three-Dimensional Polymeric Printing Powders

The development of novel imaging techniques of molecular and colloidal transport, including nanoparticles, is an area of active investigation in microfluidic and millifluidic studies. With the advent of three-dimensional (3D) printing, a new domain of materials has emerged, thereby increasing the demand for novel polymers. Specifically, polymeric powders, with average particle sizes on the order of a micron, are experiencing a growing interest from academic and industrial communities. Controlling material tunability at the mesoscopic to microscopic length scales creates opportunities to develop innovative materials, such as gradient materials. Recently, a need for micron-sized polymeric powders has been growing, as clear applications for the material are developing. Three-dimensional printing provides a high-throughput process with a direct link to new applications, driving investigations into the physio-chemical and transport interactions on a mesoscale. The protocol that is discussed in this article provides a non-invasive technique to image fluid flow in packed powder beds, providing high temporal and spatial resolution while leveraging mobile technology that is readily available from mobile devices, such as smartphones. By utilizing a common mobile device, the imaging costs that would normally be associated with an optical microscope are eliminated, resulting in a frugal-science approach. The proposed protocol has successfully characterized a variety of combinations of fluids and powders, creating a diagnostic platform for quickly imaging and identifying an optimal combination of fluid and powder.

The proposed technique will provide a novel, efficient, frugal, and non-invasive approach for imaging fluidic flow through a packed powder bed, yielding high spatial and temporal resolution.

3차원 고분자 인쇄 분말을 통한 모세관 흐름의 검소한 이미징 기술

The development of novel imaging techniques of molecular and colloidal transport, including nanoparticles, is an area of active investigation in ...

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor individual reactions live in well-controlled conditions. To do so, live single-filament experiments have emerged over the past 20 years, mostly using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and have provided a trove of key results. In 2011, in order to further expand the possibilities of these experiments and to avoid recurring problematic artifacts, we introduced simple microfluidics in these assays. This study details our basic protocol, where individual actin filaments are anchored by one end to the passivated coverslip surface, align with the flow, and can be successively exposed to different protein solutions. We also present the protocols for specific applications and explain how controlled mechanical forces can be applied, thanks to the viscous drag of the flowing solution. We highlight the technical caveats of these experiments and briefly present possible developments based on this technique. These protocols and explanations, along with today&#39;s availability of easy-to-use microfluidics equipment, should allow non-specialists to implement this assay in their labs.

We present protocols for simple actin filament microfluidic assays, in combination with fluorescence microscopy, that allow one to accurately monitor individual actin filaments in real-time while sequentially exposing them to different protein solutions.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...