우리는 그들의 이미징 및 현미경 장비의 사용을 위해 박사 타오 댕와 그녀의 실험실의 구성원의 공동 노력을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 자궁 조직으로 우리를 제공하기위한 Biorepository 및 조직 연구 시설 (BTRF) 코어, 제프 하퍼, 버지니아 대학에서 주민 감사합니다. 우리는 도식 개요와 도움 카롤 Szlachta 감사합니다.

이 원고에 사용 된 자궁 절제술 표본 IRB-HSR # 14424 번호가 대학 IRB 승인 윤리 프로토콜과 일치에 수집되었다. 임상 자료 1. 샘플 수집 <ol><li> 시작하기 전에 정부와 기관 기반의 윤리 지침 및 승인 문서를 얻습니다. </li><li> 무균 조건의 모든 단계를 실시한다. </li><li> 샘플이 바로 문화에서 처리 할 수​​없는 경우 4 ° C에서 50 ML 튜브 미디어 (RPMI 또는 DMEM / 높은 포도당)의 환자에서 파생 된 조직을 유지. 샘플은 24 시간의 최대이 상태로 저장 될 수있다. </li><li> 1X 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 조직 샘플을 세 번 씻고 세척 사이의 솔루션을 폐기하십시오. </li></ol> 긁는 방법을 사용하여 차 전지 라인 2. 준비 <ol><li> 성장 배지 (RPMI 또는 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - streptomy 보충 DMEM / 높은 포도당의 4-10 ML을 추가CIN) 조직에 30 분 동안 Fungizone (0.25 ㎍ / ㎖의 최종 농도)를 추가합니다. </li><li> 성장 미디어를 폐기하십시오. </li><li> 1X PBS로 두 번 조직을 씻으십시오. </li><li> 자궁 근층 및 자궁 내막 층 (그림을 추가로 설명 2A-2C 참조)을 구별하는 6cm 세포 배양 접시에 조직을 놓습니다. 자궁 내막을 분리합니다. </li><li> 6cm 세포 배양 접시에 긁 동안 메스 나 면도날을 사용하여 작은 조각으로 조직을 절개. 이러한 상처는 새로운 기본 자궁 내막 세포의 부착을 용이하게합니다. 트립신 방법에 비해 더 많은 조직은 (근사 그림 2D 참조)이 필요합니다. </li><li> 살짝 긁힌 요리 (조직 파편이 눈에 보이는 이상적으로 긁는 동작에서 고정됩니다)에 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 지정된 세포 배양 인큐베이터에 플레이트 (들)을 이동 (37 ° C와 5 % CO 2). 멀리 OTH에서, 일차 전지 라인을위한 장소를 지정세포 배양 접시 어. 차 문화는 감염과 오염에 더 민감하다. </li><li> 매일 가벼운 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포의 작은 인구 ​​(그림 (b) 참조) 분리 된 조직 주변에서 하루 두 세에 의해 등장한다. </li><li> , 문화를 유지 1X PBS로 가볍게 씻어 3 일에 신선한 성장 미디어 (2 ㎖)을 추가합니다. 증식 속도가 증가는 추가적인 성장 배지 (3-4 ㎖)을 6cm 배양 플레이트 (들)에 첨가 될 수있는 경우. 참고 : 세척 및 미디어 변경하는 동안, 조직의 조각 가능성이 흡입됩니다. 이 자기편 세포의 성장에 영향을 미치지 않습니다. 새로운 식민지 한 주 후에 나올 가능성이 같은 조직의 조각은 다음 단계 (2.10)에 의해 흡입해야한다. </li><li> 0.05 % 트립신을 사용하여 80 %의 합류 (그림 (b) 참조), 통과 - 6cm 판은 약 75 때. 기본 세포는 무한정 계대 배양 할 수 없습니다 - 두 개 또는 세 개의 플레이트 엄마입니다 즉시 세포의 한 판을 아래로 동결intained. 더 많은 통로가 필요한 경우 (참조 3에서 검토) 불멸화 프로토콜을 따릅니다. </li></ol> 트립신 방법을 사용하여 기본 셀 라인 3. 준비 <ol><li> 카나마이신 (0.03 ㎎ / ㎖ 최종 농도)로 보충 0.25 % 트립신 2 ㎖에 자궁 내막 조직의 작은 조각 (근사 그림 2D 참조) 놓습니다. </li><li> 30 분 동안 플랫폼을 회전에 37 ° C에서 조직을 품어. </li><li> 간단히 조직을 소용돌이. </li><li> 2 분 동안 200 ~ 400 XG에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 신선한 트립신 및 카나마이신을 추가합니다. </li><li> 시간 동안 회전하는 동안 37 ° C에서 조직을 품어. </li><li> 5 ~ 10 초 동안 조직을 소용돌이. </li><li> 트립신을 비활성화 (10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충) 성장 배지 2 ㎖를 추가합니다. </li><li> 2 ~ 3 분 동안 200 ~ 400 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> 뜨는을 취소하고 성장한다 2 ㎖를 추가펠렛 세포에 일 미디어. </li><li> 6cm 세포 배양 접시에 접시. 긁는 방법을 사용하여 기본 세포 라인을 준비 단계 2.5로 접시를 긁는 것은 필요 없습니다 만, 차 문화의 첨부 파일 및 파생물을 향상시킵니다. </li><li> 매일 광학 현미경으로 세포를 모니터링합니다. 세포 (그림 3C 참조) 48 시간 후 광학 현미경으로 일반적으로 볼 수 있습니다. </li><li> 문화를 유지하기 위해 세포를 모니터링하고 단계 2.9에서와 같이 2-3 일마다 미디어를 변경합니다. </li><li> 세포 75-80 % 년 컨 플루 (그림 3C 참조)에 도달 할 때 통과하는 세포는 0.05 % 또는 0.25 % 트립신을 사용합니다. </li></ol> 4. 추가 분석을위한 조직 (스냅 냉동 및 포르말린 고정)를 저장 <ol><li> 1X PBS로 두 번 샘플을 씻으십시오. </li><li> 가능한 한 많은 액체를 대기음. </li><li> 스냅 냉동, (그림 2 층과 2G 참조) 1.7 원심 분리 관에 자궁 내막 조직 샘플을 놓습니다. 1.7에게 배치원심 관 10 초간 액체 질소 나 때까지 조직 아래 냉동되었음을 알 수있다. 참고 : 샘플을 준비 할 때 직접 액체 질소를 건드리지 않도록주의하십시오. 샘플은 추가 처리 또는 분석 할 때까지 -80 ° C에 저장할 수 있습니다. </li><li> 포르말린 고정의 경우, 자궁 내막 조직 (그림 2H 참조)의 작은 조각을 잘라, 그리고 10 % 버퍼 아연 포르말린에 잠수함. 24 시간 후, 포르말린을 취소하고 추가 처리 될 때까지 조직 샘플에 70 % 에탄올을 추가합니다. </li></ol> 5. 면역 형광 (IF) <ol><li> 셀 고정 <ol><li> 문화 슬라이드 나 접시에 세포를 준비합니다. </li><li> 부드럽게, 1X PBS로 세포를 씻어. </li><li> 5 분 (1:1의 비율로 혼합) 미리 냉장 (4 ℃) 메탄올 및 아세톤을 추가합니다. </li><li> 공기는 진행하기 전에 슬라이드를 건조. 필요한 경우 슬라이드 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 처리 IF <ol><li> 10 분 동안 1X PBS로 세포를 재수. FO에 대한llowing는 회전 플랫폼에서 모든 세척 및 배양을 실시, 1-6 단계를 반복합니다. </li><li> 1X PBS를 사용하여 블록은 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)로 보충하고, 실온 (RT)에서 30 분 동안 1 % 종 특정 혈청 (2 차 항체 원). </li><li> (항체 희석에 대한 제조 업체의 권장 사항을 참조하십시오) 차 항체에 품어. 특정 항체에 대한 자료를 참조하십시오. 단계 5.2.2에서와 같이 신선한 블로킹 버퍼에 일차 항체를 희석. 이 배양은 실온에서 또는 밤새 4 ℃에서 최소 2 시간 동안 실시 할 수있다 </li><li> 5 분마다 1X PBS로 3 회 반복한다. </li><li> (항체 희석에 대한 제조 업체의 권장 사항을 참조하십시오) 이차 항체에 품어. 단계 5.2.2에서와 같이 신선한 차단 버퍼에 보조 항체를 희석. 광 표백을 방지하기 위해서는 빛의 부재로이 이후의 단계를 수행하는 것이 중요하다. </li><li> 5 분마다 1X PBS로 3 회 반복한다. </li><li> Thoroughly는 슬라이드를 건조. </li><li> 설치 미디어 및 DAPI의 counterstaining 솔루션을 추가합니다. </li><li> 커버 슬립을 적용하고 실란트 (들)을 사용하여 가장자리를 밀봉. 슬라이드는 최대 2 주 동안 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li></ol> 6. RNA 추출 <ol><li> 원심 분리하여 1 × 10 7 세포 펠렛. 이 프로토콜의 모든 재료 및 시약은 무료의 RNase해야합니다. </li><li> 1 ㎖의 TRIZOL 시약 및 핵 단백질 복합체의 분리를 완료하기 위해 실온에서 10 분 동안 균질화 된 샘플을 배양에서 세포를 Lyse. </li><li> TRIZOL 1 ㎖ 당 클로로포름 200 μl를 추가합니다. 15 초 동안 손으로 격렬하게 흔들어 실온에서 2 ~ 3 분 동안 품어. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 최대 속도 (15,000 XG)에서 원심 분리기 세 가지 레이어가 발생합니다. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 상단 수성 단계를 전송합니다. RNA 수율을 높이기 위해 1 μL 글리코겐을 추가; 그러나,이 단계는 필요시 소형RNA의 양이 예상된다. </li><li> 수성 층에 이소 프로필 알콜 0.5 ㎖를 추가하고 샘플을 3-5 번 반전. 10 분 동안 RT에서 샘플을 배양한다. 수율을 높이기 위해 샘플을 30 분 -20 ° C 또는 -80 ° C에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 최대 속도로 원심 분리기 </li><li> 이 시점에서, RNA의 작은 펠릿을 볼 수 있어야합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 75 %의 에탄올 1 ㎖로 RNA를 씻으십시오. </li><li> 5 분 동안 최대 속도로 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 샘플은 한 번 무기 오염 물질을 제거하는 것이 더 세척 할 수 있지만,이 단계가 필요하지 않습니다. </li><li> RNA 펠렛 건조 될 때까지 짧게, (일반적으로 7 ~ 10 분 소요) RNA 펠렛을 건조. 주 : 하나의 추가 단계는 무기 물질을 줄이고, 건조 시간을 단축 할 수있다. 추가 분 대기음 잔류 액의 최대 속도로 에탄올 세척, 스핀 샘플에서 뜨는을 폐기 한 후. 펠렛을 대기음하지 않도록주의하십시오. </li><li> RNA 펠렛의 크기에 따라, RNase가없는 물에 RNA를 용해. 볼륨은 일반적으로 10 ~ 50 ㎕의 범위. </li><li> 10 분 동안 55 ° C에서 샘플을 품어 및 RNA의 농도를 측정한다. </li><li> 추가 처리 될 때까지 -20 ° C에서 보관 샘플. </li></ol> 7. 전사 역 <ol><li> H 2 O와 9 μL의 볼륨에 샘플 RNA (1-3 μg)을 가지고 </li><li> 10 분 동안 70 ° C에 열 RNA. </li><li> 의 dNTP의 5 μL (50 μM의 작업 농도), N6 DNA 올리고의 5 μL (80 μM의 작업 농도), 배 AMV 버퍼의 5 μL 및 AMV의 1 μL : AMV 마스터 믹스를 생성하려면, 다음과 같은 시약을 결합 . 이 마스터 믹스 솔루션은 하나의 샘플 당 설계되었습니다. </li><li> 가열 된 RNA로 마스터 믹스의 16 μl를 추가합니다. 최종 반응 부피가 25 μL 반응 할 것이다. </li><li> (1 단계) 90 분 42 ° C에서, (역 : 역전사에 대해 다음과 PCR 조건을 사용하여5 분, 추가 처리 될 때까지 (3 단계) 4 °의 C에 대한 GE의 2) 95 ° C. </li></ol> 8. 리얼 타임 PCR <ol><li> 표 1에서 발견 프라이머 어닐링 온도, 사이클 수, 및 시약을 사용하여 PCR 반응을 실시한다. 참고 : (재료에 회사 카탈로그 번호 참조) PCR 시약을 사용하는 경우 제조 업체의 지침에 따라 적합합니다. </li></ol> 9. (참조 4와 5에서 파생) 체외 탈락 프로토콜 <ol><li> 자궁 내막 세포를 접시. </li><li> 75-85%의 포화 상태로 성장합니다. </li><li> 세포가 합류하게 한 후, 1X PBS로 한번 세척한다. </li><li> 신속, (페놀 무료 RPMI 5 % 목탄 스트립 FBS, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충) 호르몬이없는 용지를 추가합니다. </li><li> 24 시간 후, 1 μM 및 8 bromoadenosine 3의 최종 농도 메드 록시 프로게스테론 아세테이트 (MPA)로 보충 호르몬 가능한 미디어 &#39;, 5&#39;를 추가0.5 ㎜의 최종 농도 환식 모노 포스페이트 (캠프). </li><li> 적어도 48 시간 후에 반응을 정지하고 추가 처리를 위해 플레이트 (들)을 저장한다. </li></ol>

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저자는 공개 아무것도 없어.

다른 그룹은 콜라게나 4,12,13,15-18를 활용 대부분의 자궁 내막 기질 문화의 제조 방법을 설명하고 적응. 이 논문에서, 우리는 경제적 인 이유와 트립신 및 / 또는 면도날의 편리한 이용 가능 여부 연구실로 활용 둘 중 두 가지 간단한 기본 자궁 내막 배양 방법에 대한 방법론과 증거를 제공했다. 우리의 두 가지 방법을 비교했을 때, 모두가 성공적으로 실행 가능한 차 문...

인간의 자궁 체부는 세 개의 층, perimetrium (또는 장막), 자궁 근층 및 자궁 내막으로 구성되어 있습니다. 이들 층의 각각을 구별하는 것은 내막 세포주를 확립하는 중요한 단계이다. perimetrium은 자궁의 가장 바깥 층과 얇은 장액 세포로 구성. 근육층은 두꺼운 중간 자궁의 층과 평활근 세포로 구성된다. 자궁 내막은 자궁의 내부 층으로 식별하고 상피 및 간질 세포 집단을 포함한다. 자궁 내막은 또한 그 줄기 세포 인구는 약 28 일마다 1 functionalis 층을 다시 채울 가설 basalis 층으로 구분된다. 인간의 자궁 내막의 functionalis 층 호르몬 순환에 대한 응답으로 중요한 생화학 적 및 형태 학적 변화를 겪는다. 이 호르몬은 뇌하수체와 난소에서 파생됩니다. 생식주기의 조정 생산 및 호르몬 결과의 릴리스. 생식주기는 잠재적 인 배아 주입 이벤트에 대한 내막을 준비하도록 설계되었습니다. 인간의 생식주기는 &quot;월경주기&quot;라고하며 다음과 같은 세 가지 단계로 구분 - 증식, 분비, 월경. 분비 단계가 functionalis 성숙에 의해 표시되는 반면 증식 단계는 functionalis 자궁 내막 층의 확산을 포함한다. 특히, 세포 변화, 분비물, 그리고 세포 분화는 잠재적 인 주입 신호. 주입이 분비 단계의 끝 이전에 발생하지 않는 경우, functionalis의 자궁 내막 층은 생리 단계 흘렸다. 생리 및 functionalis 층의 흘리기를 트리거하는 이벤트의 중요성은 여전히​​ 논의되고있다. 인간에서는, 생리 알려진 특정 미드 분비 기 감별 이벤트의 결과라고 제기되었다&quot;자연 탈락&quot;2 등. 이 논문에서는, 양쪽 자궁 내막 세포 분리 방법에 대한 상세한 방법을 제공하며, 이러한 방법의 효능을 입증하기 위하여 면역 형광 및 디지털 이미지의 조합을 사용한다. 또, 일반적으로 적용 자궁 내막 세포 격리을 확인하기 위하여 자발 탈락의 시험 관내 모델에서 사용.

<table><tbody><tr><td>0.25 Trypsin or 0.05% Trypsin&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH3023602 or SH30004202</td><td></td></tr><tr><td>1.7 micro Centrifuge Tube&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272A</td><td></td></tr><tr><td>1 &amp;micro;l, 20 &amp;micro;l, 200 ml and 1,000 &amp;micro;l Pipette&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-401,24-402, 24-412, 24-430</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tube&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Cell Culture Dish&amp;nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>12-556-002</td><td></td></tr><tr><td>8 well Chambers&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Acetate&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>C4-100</td><td></td></tr><tr><td>AMV RT Enzyme/Buffer&amp;nbsp;</td><td>Bio Labs</td><td>M077L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffered Zinc Formalin&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>59201ZF</td><td></td></tr><tr><td>Charcoal strip FBS&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>NC9019735</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip&amp;nbsp;</td><td>Fisher Brand</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Cyclic AMP (cAMP)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B7880</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/High Glucose&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30243FS</td><td></td></tr><tr><td>dNTP&amp;nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti Goat -TRITC&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-3855</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s lab</td><td>017-000-002</td><td></td></tr><tr><td>E Cadherin Antibody&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>1702-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-1</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone Amphotericin B&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH Probe&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>HS99999905</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen&amp;nbsp;</td><td>5Prime</td><td>2301440</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti Mouse - FITC&amp;nbsp;</td><td>Jackson&amp;rsquo;s Lab</td><td>115-096-003</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Medroxyprogesterone acetate (MPA)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M1629</td><td></td></tr><tr><td>MeOH (Methanol)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media (w/DAPI)&amp;nbsp;</td><td>Vector Labratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>N6 DNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Number 15 Scraper&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>371615</td><td></td></tr><tr><td>Pan Cytokeratin&amp;nbsp; Mouse mAB&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4545</td><td></td></tr><tr><td>PBS (phosphate buffered saline)&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP-399-4</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Glutamine Solution 100X&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30082.01</td><td></td></tr><tr><td>PML Anti Goat Anti body&amp;nbsp;</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9862</td><td></td></tr><tr><td>Primer(s)&amp;nbsp;</td><td>Eurofins</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI&amp;nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30027FS</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (Phenol free)&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11835</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-4162</td><td></td></tr><tr><td>Taqman&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>AB-4138</td><td></td></tr><tr><td>Trizol&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin Antibody&amp;nbsp;</td><td>Epitomics</td><td>4211-1</td><td></td></tr></tbody></table>

two methods for establishing primary human endometrial stromal cells from hysterectomy specimens

많은 노력이 체외 세포 배양 시스템의 구축에 전념하고 있습니다. 이러한 시스템은 생체 내 프로세스의 광대 한 번호를 모델로 설계되어 있습니다. 인간의 자궁 내막 샘플에서 발생하는 세포 배양 시스템도 예외는 아니다. 응용 프로그램은 정상적인 생리주기 프로세스에서 같은 부인과 암, 감염성 질환, 생식 결함으로 자궁 내막 병변의 범위. 여기, 우리는 수술 절제 자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포를 확립하기위한 두 가지 방법을 제공합니다. 첫 번째 방법은 &quot;스크래핑 방법&quot;이라하고 두 번째 방법은 칭했다 반면 수술 또는 면도날을 사용하여 기계적 스크래핑 통합되는 &quot;트립신 방법.&quot;이 후자의 방법은 세포의 분리 및 일차 홍보 트립신 효소 활성을 사용 세포 가지. 우리는 디지털 이미지와 현미경을 통해 단계별 방법을 설명한다. 우리는 또한 제공하기양적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 및 면역 (IF)를 통해 자궁 내막 기질 세포 라인의 유효성을 검사하는 전자의 예입니다.

프로토콜 섹션에 강조으로, 인간의 조직을 처리하고 준비 할 때 모든 기관 정부에서 방법, 윤리적 지침을 수행해야합니다. &quot;긁는 방법&quot;의 일반적인 워크 플로의 그림 (그림 1A) 및 기본 자궁 내막 문화를 설정하는 데 사용 &quot;트립신 방법&quot;(그림 1B)은이 원고에 포함되어 있습니다. 이들 방법은 프로토콜 섹션에서 ?...

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Two Methods for Establishing Primary Human Endometrial Stromal Cells from Hysterectomy Specimens

자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다.

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

Many efforts have been devoted to establish in vitro cell culture systems. These systems are designed to model a vast number of in vivo processes. Cell ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

22.6K 조회수.  University of Virginia.  자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다. 

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Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. Although many efforts have been made to reveal the underlying mechanisms of decidualization, the exact signaling between the epithelial cells that are in contact with the embryo and the underlying stromal cells remains poorly understood. Therefore, studying decidualization in a way that takes both the epithelial and stromal cells into account could improve our knowledge about the molecular details of decidualization. For this purpose, in vivo models of artificial decidualization are physiologically the most relevant; however, manipulation of intercellular communication is limited. Currently, in vitro cultures of endometrial stromal cells are being used to investigate the modulation of decidualization by several signaling molecules. Conventionally, human or mouse endometrial stromal cells are used. However, the availability of human samples is very often limited. Furthermore, the use of murine tissues is accompanied with variety in the method of culturing. This study presents a validated and standardized method to obtain pure Endometrial Epithelial Cell (EEC) and Stromal Cell (ESC) cultures using adult intact mice treated with estrogen for three consecutive days. The protocol is optimized to improve the yield, viability, and purity of the cells and was further extended in order to study decidualization in a coculture of EEC and ESC. This model may be suitable to exploit the importance of both cell types in decidualization and to evaluate the contribution of significant signaling molecules secreted by EEC or ESC during the intercellular communication.

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a standardized and validated method for the isolation and culture of primary mouse endometrial stromal and epithelial cells, which can be used in a coculture system to study in vitro decidualization.

마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

연구

발생학

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and recurrent disease. This population can be identified by surface markers, enzymatic activity and a functional profile. These approaches per se are limited, due to phenotypic heterogeneity and CSC plasticity. Here, we update the sphere-forming protocol to obtain CSC spheres from breast and gynecological cancers, assessing functional properties, CSC markers and protein expression. The spheres are obtained with single-cell seeding at low density in suspension culture, using a semi-solid methylcellulose medium to avoid migration and aggregates. This profitable protocol can be used in cancer cell lines but also in primary tumors. The tridimensional non-adherent suspension culture thought to mimic the tumor microenvironment, particularly the CSC-niche, is supplemented with epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor to ensure CSC signaling. Aiming for robust identification of CSC, we propose a complementary approach, combining functional and phenotypic evaluation. Sphere-forming capacity, self-renewal and sphere projection area establish CSC functional properties. Additionally, characterization comprises flow cytometry evaluation of the markers, represented by CD44+/CD24- and CD133, and Western blot, considering ALDH. The presented protocol was also optimized for primary tumor samples, following a sample digestion procedure, useful for translational research.

The aim of this methodology is to identify cancer stem cells (CSC) in cancer cell lines and primary human tumor samples with the sphere-forming protocol, in a robust manner, using functional assays and phenotypic characterization with flow cytometry and Western blot.

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

암 연구학

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for embryo implantation into the uterine lining of the maternal womb. Improper decidualization has been established as a root cause for implantation failure and subsequent early embryo miscarriage. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying decidualization is advantageous to improving the rate of successful births. In vivo based studies of artificial decidualization are often limiting due to ethical dilemmas associated with human research, as well as translational complications within animal models. As a result, in vitro assays through primary cell culture are often utilized to explore the modulation of decidualization via hormones. This study provides a detailed protocol for the isolation of HESC and subsequent artificial decidualization via the supplementation of hormones to the culturing medium. Further, this study provides a well-designed method to knockdown any gene of interest by utilizing lipid-based siRNA transfections. This protocol permits the optimization of culture purity as well as product yield, thereby maximizing the ability to utilize this model as a reliable method to understand the molecular mechanisms underlying decidualization, and the subsequent quantification of secreted agents by decidualized endometrial stromal cells.

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

This study presents a validated and optimized procedure for the isolation and culture of human endometrial stromal cells to conduct in vitro decidualization assay. Further, this study provides a detailed method to efficiently knockdown a specific gene using siRNAs in human endometrial stromal cells.

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

의학

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can also become diseased and cause morbidity and even death. Model systems to study human endometrial biology have been limited to in vitro culture systems of single cell types. In addition, the epithelial cells, one of the major cell types of the endometrium, do not propagate well or retain their physiological traits in culture, and thus our understanding of endometrial biology remains limited. We have generated, for the first time, endometrial organoids that consist of both epithelial and stromal cells of the human endometrium. These organoids do not require any exogenous scaffold materials and specifically organize so that epithelial cells encompass the spheroid-like structure and become polarized with stromal cells in the center that produce and secrete collagen. Estrogen, progesterone and androgen receptors are expressed in the epithelial and stromal cells and treatment with physiological levels of estrogen and testosterone promote the organization of the organoids. This new model system can be used to study normal endometrial biology and disease in ways that were not possible before.

A protocol to generate human primary endometrial organoids that consist of epithelial and stromal cells and retain characteristics of the native endometrial tissue is presented. This protocol describes methods from uterine tissue acquisition to the histologic processing of endometrial organoids.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. Instead, ovarian cancer cells exfoliated from the primary tumor are carried by peritoneal fluid to metastatic sites within the peritoneal cavity. These sites, most notably the abdominal peritoneum and omentum, are organs covered by a mesothelium-lined surface. To investigate the processes of ovarian cancer dissemination, we assembled a complex three-dimensional culture system that reconstructs the lining of the peritoneal cavity in vitro. Primary human fibroblasts and mesothelial cells were isolated from human omentum. The fibroblasts were then mixed with extracellular matrix and covered with a layer of the primary human mesothelial cells to mimic the peritoneal and omental surfaces encountered by metastasizing ovarian cancer cells. The resulting organotypic model is, as shown, used to examine the early steps of ovarian cancer dissemination, including cancer cell adhesion, invasion, and proliferation. This model has been used in a number of studies to investigate the role of the microenvironment (cellular and acellular) in early ovarian cancer dissemination. It has also been successfully adapted to high throughput screening and used to identify and test inhibitors of ovarian cancer metastasis.

Here, we present a protocol to construct a three-dimensional in vitro model of the lining of the peritoneal cavity, composed of primary human mesothelial cells and fibroblasts layered with extracellular matrix, as a tool to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of luminal and glandular epithelium, a stromal compartment, a vascular network, and a complex immune cell population. Mouse models have been a powerful tool to study the endometrium, revealing critical mechanisms that control implantation, placentation, and cancer. The recent development of 3D endometrial organoid cultures presents a state-of-the-art model to dissect the signaling pathways that underlie endometrial biology. Establishing endometrial organoids from genetically engineered mouse models, analyzing their transcriptomes, and visualizing their morphology at a single-cell resolution are crucial tools for the study of endometrial diseases. This paper outlines methods to establish 3D cultures of endometrial epithelium from mice and describes techniques to quantify gene expression and analyze the histology of the organoids. The goal is to provide a resource that can be used to establish, culture, and study the gene expression and morphological characteristics of endometrial epithelial organoids.

This protocol describes methodologies to establish mouse endometrial epithelial organoids for gene expression and histological analyses.

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

생물학

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. While human and mouse endometrial organoids have been developed, research on rat endometrial organoids remains limited. Given that rats can better simulate certain endometrial pathologies, such as intrauterine adhesions, this study aimed to establish rat endometrial organoids. We present a detailed protocol for the isolation and culture of rat endometrial epithelial stem cells (reESCs) and the generation of rat endometrial organoids. Using a refined reESCs expansion medium, we successfully isolated and stably expanded reESCs, demonstrating their long-term culture potential. The reESC-generated organoids exhibited typical structural and functional characteristics of the endometrium, including hormone responsiveness. Our results showed that rat endometrial organoids could be cultured over a long term with stable proliferation, maintaining the glandular structure, cell polarity, and functional characteristics of the endometrial epithelium. This novel rat-derived endometrial organoid model provides a valuable platform for studying endometrial diseases and testing therapeutic interventions, with potential applications across various mammalian species.

Here, we present a protocol to isolate and culture rat endometrial epithelial stem cells (reESCs), generating rat endometrial organoids. This method facilitates in vitro studies of endometrial diseases, enabling gene editing and other cellular manipulations.

Endometrial organoids offer valuable insights into the development and pathophysiology of endometrial diseases and serve as platforms for drug testing. ...

<meta charset="utf8"></head><body>배아 착상 메커니즘을 조사하기 위한 3D 프린팅 스캐폴드 모델

Co-culture Model Using Two Types of Adherent Cell Lines

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications between various cell types within the decidua are crucial for regulating endometrial receptivity; however, the molecular mechanisms mediating this interaction are still unclear. In this regard, a model to study the implantation process is needed to establish a comprehensive in vitro model that can recapitulate the biology of endometrial epithelium-stroma interaction. This model is composed of regular cell-culture plates and a matching scaffold, which is generated by three-dimensional (3D) printing from low-cost materials. Here, we detail a set of protocols for model construction, cell preparation, cell seeding, cell culture, observation, and evaluation. Furthermore, we have included representative results with cells exhibiting good growth conditions under the microscope. This study aimed to develop in vitro models that would mimic the interaction between endometrial stromal cells and epithelial cells, as well as between trophoblast cells and endometrial cells.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 상피-기질과 배아 상호작용을 연구하기 위한 체외 자궁내막 모델

The protocol shows a novel in vitro experimental model that can recapitulate the biology of two kinds of adherent cell lines with a three-dimensional (3D)-printed scaffold. The construction of this model and operating procedures, from cell preparation and cell culture to analysis and evaluation, are described.

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

Embryo implantation is affected by the interactions among different cell types in the mother-embryo interface. The direct and indirect communications ...

자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법

요약

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마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한

부인과 및 유방암 종양에서 암 줄기 세포 구체 획득

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

고체 시편에서 기본 난소 암 세포를 얻는 방법

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

인간의 복강의의 Organotypic 문화 난소 암 보급의 초기 단계 모델링

마우스 자궁에서 3D 자궁 내막 오가노이드 확립

Generation and Characterization of Rat Uterus Organoids from Rat Endometrial Epithelial Stem Cells

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델

두 가지 유형의 부착 세포주를 사용한 공동 배양 모델