이 프로토콜은 자궁 내막 오가노이드 배양을 위해 마우스 자궁에서 고순도 자궁 상피를 분리하는 단계별 방법론을 보여주기 때문에 중요합니다. 이 방법은 효소 및 기계적 해리를 효율적으로 활용하여 자궁 상피를 분리합니다. 이 기술은 분리된 상피에서 파생된 자궁내막 상피 오가노이드를 확립, 치료 및 분석하기 위해 간소화되었습니다.
사용하기 전에 약 1-2 시간 동안 얼음에서 젤 매트릭스를 해동하여 시작하십시오. 그런 다음 안락사 된 마우스를 가위로 복부에 정중선 절개를하고 피부를 부드럽게 벗겨 밑에있는 복막층을 노출시켜 해부합니다. 복부 지방 패드를 부드럽게 옆으로 움직여 자궁 뿔을 찾고 자궁 경부 접합부에서 자궁 뿔을 잡고 장간막 지방을 따라 절단하십시오.
마우스 자궁을 해부 한 후 작은 가위로 자궁 뿔에서 지방 조직을 철저히 제거하십시오. 완료되면 각 자궁 뿔을 각각 약 4-5mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 한 자궁의 모든 자궁 조각을 0.5 밀리리터의 1 % 트립신이 들어있는 24 웰 플레이트의 한 우물에 넣습니다.
그런 다음 24웰 플레이트를 섭씨 37도의 가습 조직 배양 인큐베이터에서 약 1시간 동안 배양하여 밑에 있는 기질에서 자궁내막 상피를 효소적으로 분리합니다. 배양 후, 자궁 단편을 Dulbecco의 인산염 완충 용액 또는 DPBS 1 밀리리터를 함유하는 35 밀리미터 조직 배양 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 자궁 단편의 한쪽 끝을 집게로 잡고 피펫 끝을 단편을 가로질러 세로로 부드럽게 움직여 자궁관의 다른 쪽 끝에서 상피를 짜내어 해부 현미경으로 자궁 상피를 분리합니다.
그런 다음 해부 현미경으로 자궁 조각에서 분리 된 상피 시트를 관찰하십시오. 다음으로, 1 밀리리터 피펫을 사용하여 모든 상피 시트를 동일한 1.5 밀리리터 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 해리된 상피 시트를 375 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.
세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 밀리리터 콜라게나제 0.5밀리리터에 DNA 용액 밀리리터당 2밀리그램을 더한 2밀리리터에 재현탁시킵니다. 약 10회 위아래로 또는 단일 세포 현탁액이 달성될 때까지 피펫팅합니다. 다음으로 DMEM F/12 0.5ml와 소 태아 혈청 10% 또는 FBS와 항생제를 넣고 375 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
상청액을 제거하고 1 밀리리터 DMEM / F12와 10 % FBS와 항생제에 세포를 재현 탁시키고 세포를 원심 분리합니다. 준비가 될 때까지 젤 매트릭스를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 원심분리기로부터 상층액을 세포로부터 제거하고, 기포를 도입하지 않고 겔 매트릭스의 20배 부피를 사용하여 세포 펠렛을 재현탁시킨다.
겔 매트릭스 세포 현탁액을 실온에서 약 10분 동안 침전시킵니다. 겔 매트릭스 셀 현탁액이 반고체 겔이 되면 넓은 구멍의 200마이크로리터 팁이 있는 P200 마이크로피펫을 사용하고 25마이크로리터의 겔 매트릭스 세포 현탁액을 부드럽게 흡입합니다. 12웰 플레이트의 웰당 3개의 개별 25마이크로리터 돔을 분주하고 겔 매트릭스가 15분 동안 경화되도록 하고 섭씨 37도의 가습 조직 배양 인큐베이터를 사용합니다.
겔 매트릭스가 경화된 후, 겔 매트릭스 돔을 포함하는 각 웰에 750마이크로리터의 오가노이드 배지를 첨가하고, 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 인큐베이터를 첨가한다. 마우스 자궁내막 오가노이드의 위상차 이미지는 상피 및 기질 세포 분리가 반대 세포 유형의 10%에서 15% 이하의 오염을 가진 샘플을 산출한다는 것을 보여주었습니다. 자궁내막 상피 세포는 3 내지 4일 이내에 오가노이드로 조립되었다.
절편된 포르말린 고정 파라핀 포매 자궁내막 오가노이드는 헤마톡실린 및 에오신 염색에 의해 시각화되었으며, 이는 오가노이드의 내강인 상피 및 중공 중심의 단일 층을 표시했습니다. 형광 현미경 이미징은 오가노이드의 모든 세포가 사이토케라틴 8 양성이고 DAPI를 함유하고 있음을 보여주었으며, 이는 자궁내막 오가노이드의 고정, 삽입 및 처리가 항체 기반 면역염색과 호환됨을 나타냅니다. 실시간 정량 PCR은 10 나노 몰 에스트라 디올로 자극하면 상피 오가노이드에서 리포칼린 2, 락토페린 및 프로게스테론 수용체의 발현이 증가한다는 것을 보여 주었으며, 이는 자궁 내막 상피 오가노이드가 에스트라 디올에 반응하는 유전자 발현 변화를 측정하는 데 성공적으로 사용될 수 있음을 나타냅니다.
기계적 해리 단계에서 자궁내막 상피의 명확한 분리가 이루어지도록 하는 것이 중요합니다. 자궁관에서 나오는 상피를 관찰 할 수 있어야합니다. 다른 방법은 겔 매트릭스로 캡슐화함으로써 상피 오가노이드를 확립하는 것을 포함한다.
원하는 경우, 기질 구획을 추가로 분해하여 3D 상피 기질 공동 배양을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 자궁 내막의 재생을 제어하는 신호에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 자궁 내막증, 임신 손실 및 암과 같은 여성의 질병을 치료하는 데 도움이 될 수 있습니다.
