이 기술은 지역화뿐만 아니라 개별 난모세포 및 배아에서 후보 mRNA의 양도 허용합니다. PCR을 포함한 다른 분석법과 비교하여 이 기술의 완성으로 인해 변동이 낮은 재현 가능한 데이터가 생성됩니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 켈시 팀메 (Kelsey Timme)가 될 것입니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 5~8주에 필요한 물질 및 여성 마우스의 준비로 이 절차를 시작합니다. 70%에탄올을 사용하여 마우스를 청소하십시오. 복강을 노출하고 여성 생식 기관을 시각화합니다.
난소를 집게로 잡고 난소 주위에서 자궁 인대와 과도한 지방 조직을 제거하십시오. 자궁에서 oviduct를 잘라. 그런 다음 난소 oviduct 쌍을 35 mm 접시에 따뜻한 홀딩 배지에 놓습니다.
난소와 주변 지방 조직을 제거합니다. 반 인치 27 게이지 바늘을 사용하여 oviduct의 부어 오른 앰풀라를 찢습니다. 눈물의 부위에 oviduct를 밀어 내고 적수 세포 난낭 복합체가 추방됩니다.
구강 파이펫을 사용하여 배란된 난소세포를 히알루로니다아제로 보유 하는 매체를 포함 하는 100 마이크로 리터 드롭에 전송. 적혈구를 제거하기 위해, 메타상 2 개의 난낭 수중 세포가 구강 파이펫으로 배지를 보유하는 히알루로니다제에서 위아래로 복합체를 피펫한다. 적혈구가 없는 후에는 입 파이펫을 사용하여 각 난미세포를 매미만 포함하는 세척 방울로 옮깁니다.
각 세척 액적당이 반복됩니다. 조각화되거나 투명한 난모세포는 전송하지 마십시오. SM-FISH 염색을 수행하려면 먼저 고정 버퍼 500 마이크로리터를 포함하는 6개의 웰 플레이트의 개별 우물에서 난모세포를 수정합니다.
우물에 20 개의 난모세포 이하를 잠급하십시오. 실온에서 20분 동안 고정 버퍼에 난모세포를 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 난모세포를 세척한 후, 실온에서 30분 동안 충혈 버퍼로 난모세포를 배양한다.
또 다른 세척후, 전액을 80 마이크로리터로 옮기면 실온에서 30분 동안 3개의 버퍼를 미리 희석한 프로테아제3버퍼로 옮깁니다. 나노그, Pou5f1 및 DapB에 대한 온난한 프로브 세트를 프로브 희석제에서 1~50으로 희석합니다. 40섭씨에서 2시간 동안 성적증명서 의 80마이크로리터에 난모세포가 인큐베이션됩니다.
난모세포가 프로브와 AMP 버퍼에 있을 때 부유하는 경향이 있습니다. 버퍼에 부드럽게 밀어 넣으면 난모를 담는 것이 필수적입니다. 난모를 500 마이크로리터의 세척 버퍼로 옮기고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.
이제 증폭 버퍼에서 oocytes를 순차적으로 배양합니다. 첫째, AMP1 80 마이크로리터에서 40도에서 30분 동안 난모세포를 배양합니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 세척 버퍼의 500 마이크로 리터로 난모를 옮깁니다.
다음으로, AMP2 의 80 마이크로 리터에서 40 °C에서 15 분 동안 난모세포를 배양합니다. 전과 같이 난모를 세척한 후, AMP3 80 마이크로리터에 40도에서 30분 동안 난미료를 배양한 다음 최종 세척을 합니다. 마지막으로, 섭씨 40도에서 15분 동안 AMP4FL 80 마이크로리터에 난모를 추가합니다.
파이펫 12 마이크로리터의 안티 페이드 장착 매체는 시약에 거품을 추가하지 않고 슬라이드의 중앙에. 가능한 한 적은 세척 버퍼로 난모를 마운팅 매체로 옮깁니다. 마지막으로 커버 슬립을 적용합니다.
Z 단계 공초점 현미경 을 사용하여 3 차원 난모를 이미지하고 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 이미지를 저장합니다. 피지에 ND2 파일을 드래그하고 하이퍼 스택을 선택합니다. 이미지 탭을 클릭하고 색상을 선택하고 분할 채널을 클릭하여 ND2 파일의 형광 채널을 분리합니다.
각 형광 채널에서 난모세포의 각 Z 조각에 대해 개별 TIFF 파일을 생성합니다. 이렇게 하려면 이미지 탭을 클릭하고 스택을 선택하고 이미지로 스택을 클릭합니다. 그런 다음 이미지 탭을 클릭하고, 유형을 선택하고 RGB 색상을 클릭하여 각 Z 슬라이스를 개별 RGB 색상 이미지로 변환합니다.
변환된 각 이미지를 TIFF 파일로 저장합니다. 각 형광 채널에 대한 단일 난초에서 이미지를 새 폴더에 배치하여 바느질 중에 혼동을 피합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 파일을 정규화한 후 플러그인 탭을 클릭하고 스티치를 선택하고 그리드 컬렉션을 클릭합니다.
드롭다운 메뉴에서 순차적 이미지를 선택하고 확인을 클릭합니다. 디렉터리 탐색하고 한 파장에서 개별 난모세포에 대한 Z 슬라이스 이미지를 모두 포함하는 폴더를 선택합니다. 확인을 클릭합니다.
스티치 이미지 의 하단에 있는 슬라이더를 사용된 파장에 적합한 색상 채널로 이동합니다. 이미지를 클릭하고, 유형을 선택하고, RGB 색상을 클릭하여 최종 RGB 스티치 이미지를 만듭니다. 스티치 된 이미지를 32 비트 최대 투영 된 그림으로 변환합니다.
이렇게 하려면 이미지를 클릭하고 입력을 선택하고 32비트를 클릭합니다. 이 이미지를 새 TIFF 파일로 저장합니다. 스팟 찾기 및 추적 프로그램에서 32비트 스티치 이미지를 엽니다.
드롭다운 지역화를 선택하고 로컬화를 클릭하여 이미지에 있는 스팟 수를 계산합니다. 여기에 표시된 스팟 파인더 및 추적을 사용하여 mRNA의 정량화입니다. 파란색 화살표는 임계값 위의 양수 신호를 가리킵니다.
흰색 화살표는 임계값 아래에 형광 지점을 표시하므로 계산되지 않습니다. mRNA 카운트는 표준 데이터 분석 도구를 사용하여 이후에 분석되었다. 중간 Z 시리즈 이미지의 대표적인 이미지는 Pouf51 및 Nanog에 표시됩니다.
메타상 2스핀dle에 정렬된 염색체의 DAPI 염색은 흰색으로 표시됩니다. 이 프로토콜에서 수집된 데이터는 775Pouf51 성적증명서와 113개의 나노그 성적증명서를 메타상 2개의 난소세포에서 보여주었습니다. 중요한 것은, 부정적인 제어 역할을 DapB 프로브로 표시되는 난모세포에서 검출된 반점이 없었다는 것입니다.
비 부착 셀을 사용하는 경우 SM-FISH 키트에서 프로테아제 버퍼의 최상의 희석을 경험적으로 식별하는 것이 중요합니다. mRNA 검출은 1xPBS에서 희석되지 않은 여러 희석 프로테아제 버퍼 농도의 적정 곡선을 사용하여 테스트되었다. 이 프로토콜에 사용된 프로테아제 희석은 메타상 2oocytes에서 Pouf51 mRNA의 평균 형광 발현에서 가장 낮은 변이를 보였기 때문에 1-8이었다.
표적 단백질의 동시 면역 형광은 RNA 결합 단백질과 mRNA를 공동국화하기 위해 수행될 수 있다. RNA 결합 단백질과 mRNA의 공동 국소화는 조사자가 oocyte 또는 태아 내의 mRNA 저장, 번역 및 분해를 조절하는 메커니즘을 결정할 수 있게 합니다.
