이 작품은 미국 심장 협회와 어린이의 심장 근육 병증 재단 (SDG2462390204001)과 국립 보건원 (HL114669)에 의해 지원되었다. CM은 심근염 재단, NJ에 의해 수여 박사 학위 취득 후 연구 활동 보조금의 수상자이다.

윤리 문 : 모든 동물의 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 실시 및 네브래스카 링컨, 링컨, 네브래스카의 대학에 의해 승인되었습니다. EAE 1. 유도 <ol><li> 단계 1.1 : EAE를 유도하기 위해, 다음의 수정 (11)에서 설명한 바와 같이 펩티드 / 완전 프로 인트 아쥬 반트 (CFA) 에멀션 제조. 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)의 1 ㎎ / ㎖의 농도에서 PLP 139-151 준비 단계 1.4 :. 동물 당 PLP 139-151의 100 μg을 포함 CFA 에멀젼 200 μl를 사용 1.4.1 단계 : 동물 10 마리를 예방 접종 1 PLP 139-151 ㎖의 (1 ㎎ / ㎖의 1X를 혼합하여 에멀젼 2 ㎖를 준비하는 . PBS)와 CFA의 같은 부피의 1.5 단계 : 두 서혜부 (~ 75 μL 각)과 5 ~-6 주짜리의 흉골 지역 (~ 50 μL)의 피하에 분할 복용 에멀젼 200 μl를 주입 FEMA르 SJL / J 마우스. 1.7 및 1.8 EAE의 유도를 위해 적용 할 수 없습니다 단계. </li></ol> EAE 마우스와 대뇌의 수확 2. 임상 점수 <ol><li> 임상 증상의 모양에 대한 동물을 모니터링하고, 다음 날 9 postimmunization 매일 질병 심각도 점수 : 0 - 건강; 1 - 꼬리 나 뒷다리의 약점 미약하지만 모두; 2 - 꼬리와 뒷다리의 약점 맥 빠진; 3 - 뒷다리의 부분 마비; 4 - 뒷다리의 완전한 마비; 5 - 죽어가는 혹은 죽은 12. </li><li> 그들은 CO 2를 사용하여 3 또는 4의 신경 학적 점수에 도달했을 때 쥐를 안락사. 쥐를 안락사하기 위해,하지 6 PSI를 초과하는 CO 2 탱크의 조절기를 설정하여 CO 2를 먼저 안락사 챔버를 미리 기입 동물이 완료 질식을 달성하기 위해 약 5 분 동안 챔버 내에서 체류 할 수 있습니다. 70 % 알코올에 안락사 동물을 적신다. 즉, 흡수 패드에 동물을 배치하고 멸균의 쌍을 사용CEPS와 가위 흉강을 통해 절단에 의해 마음을 노출합니다. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse. </li><li> 곡선 가위를 사용하여 순환 적 두개골을 자르는하여 두개골을 발굴, 조심스럽게, 집게와 두개골 뼈를 플립. 해부를 둔 깨끗한 메스, 소뇌에서 별도의 대뇌를 사용하여 두뇌를 수확. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 뇌를 놓고 처리 될 때까지 얼음에 튜브를 둡니다. </li></ol> 3. MHC 클래스 II (IA들) / PLP 139-151 Dextramers와 대뇌 섹션의 제자리 염색법에 <ol><li> 4 %는 PBS 버퍼 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열하여 용융 사용할 때까지 40 ° C의 물을 욕조에두고 준비합니다. </li><li> 처분 할 수있는 깊은베이스 금형 조직학 카세트의 뇌를 놓고 얼음 위에 보관 및 용융 (40 ° C) 아가로 오스를 붓는다. 즉시 부드럽게 뇌를 눌러집게는 조직을 잠수함으로. 응고가 완료 될 때까지 15 ~ 20 분 동안 얼음에 카세트를 남겨주세요. </li><li> 냉장 1X PBS로 vibratome 목욕을 입력합니다. 0과 2 사이의 PBS의 온도를 유지하기 위해 얼음 조각으로 vibratome 화장실 주위의 공간을 채우기 ° C. vibratome에 깨끗한 면도날을 수정하고 15 °로 블레이드 각도를 설정합니다. </li><li> vibratome에있는 조직의 위치. 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 대뇌의 복부 표면을 노출. <ol><li> 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 바르고 가로 단면의 접착제를 통해 대뇌의 노출 된 복부 표면을 배치하여 접착면에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 전송합니다. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오. </li><li> 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 한편, 티슈 참 배치24 - 웰 플레이트의 웰 당 하나를 BERS. 차가운 1X PBS 1 ㎖와 조직 챔버를 포함하는 우물을 입력하고 얼음에 플레이트를 둡니다. <ol><li> 얇은 나일론 최고 접착제를 사용하여 25 ㎖ 폴리 프로필렌 피펫의 절단 단부에 부착하여 메쉬 조직 실 준비; 피펫의 주위에 여분의 메쉬를 트리밍 한 후, 메쉬 1 cm의 길이로 피펫을 잘라. </li></ol></li><li> 조직의 상부면의 레벨까지 vibratome 블레이드를 내리고; 0.22 mm / 초에 vibratome 속도를 설정하고 200 μm의 두께 부분을 만들기 위해 전진과 절편 시작합니다. 잘 24 - 웰 플레이트의 우물 내에 배치 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 당 하나의 뇌 부분을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 복부 표면에 뇌 등의 세 가지 영역 (그림 2)에서 총 세 쌍 절에서 획득하려면 다음 단계를 수행합니다. 에서 하나의 섹션세 개의 개별 조직의 챔버에 배치 (총 세 부분에서) 각 쌍은 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 (IA S / PLP 139-151) 및 안티 CD4됩니다. 마찬가지로, 세 개의 개별 조직의 챔버에 배치됩니다 세 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된다 (IA S / TMEV 70 ~ 86) 및 안티 CD4. </li><li> 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 특정 dextramers로 염색마다 잘 대해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 알로 피코를 포함하는 칵테일의 300 μL (APC) - 복합 PLP 139-151 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 및 안티 CD4-피코 에리 트린 (PE,) 2 % 정상 염소 혈청과 솔루션 (1X PBS를 차단하는 / ㎖ 5 μg)은 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버. </li><li> 마찬가지로, 우리 당 하나의 챔버와 24 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송LL하는, APC-공액 TMEV 70 ~ 86 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖) 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일의 300 μL는 이전에 추가되었습니다. 뚜껑 우물을 커버. 참고 : Massilamany 참조 등 8 dextramers의 준비 및 dextramers이 친절하게 Immudex, 코펜하겐, 덴마크에 의해 제공되었다 준비하는 덱스 트란 분자.. </li><li> 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 ​​설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다. </li><li> 잠복기 후, 잘 차가운 1X PBS 1 ㎖를 포함하는 신선한에 조직 챔버를 전송하여, 락을 플랫폼에서 조직 섹션을 씻어 아니라 다른에 하나의 내용을 드리블하지 마십시오. 세척 당 적어도 10 분을 허용, 세 번 세탁을 반복합니다. 그들은 챔버의 측면에 충실 수있는 조직 섹션이 건조되지 않도록해야합니다. </li><li> 조직 참를 전송하여 섹션을 수정부드러운 회전과 2 시간 동안 락을 플랫폼에서 필터링 4 % PBS 버퍼 파라 포름 알데히드 (산도 7.4) 1 ㎖를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 신선한 잘으로 BER들. </li><li> 단계 3.10에 설명 된대로 세 번 세탁을 반복합니다. </li><li> 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 및 고정 섹션을 배치합니다. 부분을​​ 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다. </li><li> 4 ℃에서 빛을 방지 슬라이드 저장 상자에서 슬라이드를 저장 </li></ol> 마음의 EAM 및 컬렉션 4. 유도 <ol><li> 참고 11에 설명 된대로 EAM을 유도한다. </li><li> CO 2 가스 실린더가 장착되어 깨끗한 실을 사용하여 21 일 postimmunization에 쥐를 안락사, 70 % 알코올에 동물을 적신다. 즉시 흡수 패드에 동물을 배치하고 집게와 가위를 사용하여 심장을 노출흉강을 통해 절단하여의. 오른쪽 귓바퀴에 구멍과 마음의 왼쪽 심실에 차가운 1X PBS 10 ㎖를 주입하여 perfuse. 차가운 1X PBS가 들어있는 튜브에 하트와 장소를 수집합니다. </li></ol> 5. MHC 클래스 II (IA 케이) / Myhc 334-352 Dextramers 심장 섹션의 제자리 염색법에 <ol><li> 준비 4 % 저 융점 아가 로스, 50 ° C에서 가열 용융 (40)에 남겨 PBS 버퍼 &#160; 사용할 때까지 C 물 목욕 °. </li><li> 얼음에 보관 일회용 깊은베이스 금형 조직학 카세트에 마음을 놓고 단계 3.2에 설명 된대로 조직이 완전히 침수 될 때까지 용융 아가로 오스 40 ° C를 붓는다. </li><li> 3.3 단계를 따릅니다. </li><li> 포함 된 조직의 모든 측면에서 초과 아가로 오스를 정돈하고 약간 마음의 기반을 노출합니다. 최고 접착제와 vibratome 조직 블록을 도말의 노출면을 배치하여 접착 표면 아가 매립 조직을 전송할접착제 위에 심장. 조직이 블록에 설정되면, 조직을 이동하지 마십시오. <ol><li> 얼음에 아가로 오스 - 임베디드 조직을 포함하는 vibratome 블록을 배치하고, 접착제가 15 분 동안 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 단계 3.5 및 3.6을 따르십시오. </li><li> 24 웰 플레이트의 우물 내에 배치 된 조직 챔버에 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 심장 섹션을 전송합니다. 절편은 조직의 저하를 방지하기 위해 완료 될 때까지 얼음에 플레이트를 유지합니다. 참고 : 마음의베이스 정점에서 여덟 쌍 섹션 (그림 2) 총 취득하려면 다음 단계를 수행하십시오. 실 당 3 절까지 할당, 조직 챔버의 모든 섹션을 배치합니다. (총 여덟 섹션) 각 쌍에서 하나의 섹션은 특정 dextramers (IA K / Myhc 334-352) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다. 마찬가지로, 팔 부분의 또 다른 세트는 제어 dextramers (IA K / RNA 분해 효소 43-56) 및 안티 CD4로 염색을 위해 지정되어있다. </li><li> 이동잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에있는 세 개의 우물에 특정 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 조직 챔버하는 300 APC-공액 Myhc 334-352 dextramers (2.5 ㎍ / ㎖)이 포함 된 칵테일 μL와 솔루션을 차단하는 안티 - CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버. <ol><li> 이와 유사하게, 잘 당 하나의 챔버와 24 - 웰 플레이트에 세 우물에 제어 dextramers로 염색을 위해 지정된 섹션을 포함하는 세 가지 조직 챔버를 전송하는, 43-56 dextramers (2.5 μg을 APC-공액 RNA 분해 효소를 포함하는 칵테일의 300 μL 차단 솔루션에 / ㎖) 및 안티 CD4-PE (5 ㎍ / ㎖)을 이전에 추가했다. 뚜껑 우물을 커버. </li></ol></li><li> 우물을 레이블 및 알루미늄 호일로 접시를 포장하고 실온에서 어둠 속에서 1.5 시간 동안 부드러운 회전으로 ​​설정 흔들 플랫폼에서 접시를 놓습니다. </li><li> 단, 3.10 3.11에 따라 </li><li> 반복 세탁 THR단계 3.10에 설명 된대로 얼음. </li><li> 수채화 부드러운 브러시를 사용하여 깨끗한 현미경 슬라이드의 염색 고정 섹션 (최대 세 개의 섹션 / 슬라이드)를 놓습니다. 섹션을 건드리지 않고 여분의 수분을 닦아 설치 매체를 사용하여 섹션을 탑재합니다. 미세한 커버 슬립 커버 및 슬라이드 어두운 방에서 RT O / N에서 건조 할 수 있습니다. </li><li> 4에서 광 증거 슬라이드 수납 박스에 슬라이드를 보관 ° C. </li></ol> 6. Dextramer +의 분석 (두뇌와 심장 섹션 모두에 공통) 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 (LSCM)에 의해 (DEXT +) CD4 + T 세포 <ol><li> 일상적인 검사 및 이미지 수집을 위해 니콘 A1-이클립스 90I 공 초점 현미경 시스템을 사용합니다. 시작하려면 열기, NIS 요소 AR 소프트웨어 (버전 4.13). <ol><li> &quot;TRITC&quot;와 패널에서 &quot;Cy5에&quot;채널을 선택합니다. TRITC 및 Cy5의 채널에 대한 각각의 여기 / 발광 파장 561.5 ㎚ / 553-618 nm의 기본적으로 표시 nm의 640.7 ㎚ / 663-738. </li><li> 각각 TRITC (CD4-PE)와 Cy5에 (dextramer-APC) 채널에 대한 pseudocolors &quot;녹색&quot;과 &quot;빨강&quot;을 지정합니다. </li><li> 현미경 단계에 검사 할 슬라이드를 놓고 100 배 배율에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. (110)에 &quot;HV&quot;을 설정하고 &quot;0&quot;으로 오프셋 (offset). &quot;포커스&quot;를 클릭하고 레이저를 최적화하기 위해 &quot;전압&quot;을 조정한다. </li><li> &quot;포커스&quot;를 클릭; 위에서 아래로 섹션을 스캔 및 이미지 획득을위한 &#39;Z&#39;레벨을 설정합니다. &quot;CH 시리즈&quot;를 클릭하여 이미지를 순차적으로 취득. DEXT를 확인 + CD4 + T 세포는 적색 (dextramers)과 녹색 (CD4) 채널 모두에서 생성 된 신호의 공동 현지화를 기반으로 노란색 반점이있는 세포를 게재. </li></ol></li><li> DEXT + CD4 + T 세포의 쉬운 양적 열거 올림푸스 FV500-BX60 공 초점 현미경을 사용합니다. 시작하려면열기를 클릭, FLUOVIEW 소프트웨어 (버전 4.3). <ol><li> 드롭 다운 메뉴에서 염료 &quot;를 Cy3&quot;와 &quot;Cy5에&quot;를 선택하고, 각각의 레이저를로드하려면 &quot;적용&quot;을 클릭합니다. 참고 : Cy3에 대한 여기 / 방출 파장 (543 ㎚ / &quot;녹색&quot;모조 착색, CD4-PE)와 Cy5에 (633 ㎚ / &quot;빨간색&quot;모조 착색, dextramer-APC) 채널을. </li><li> 현미경 슬라이드를 검사 할 슬라이드를 놓고 낮은 배율 (배 또는 10 배)에서 수동으로 초점을 맞 춥니 다. Cy3에 레이저가 켜져있는 동안 &quot;포커스&quot;를 클릭하고, 염증 초점 초점을 맞 춥니 다. </li><li> 100 배의 배율로 목적을 변경합니다. 드롭 다운 메뉴에서를 &quot;512분의 512&quot;파일 크기를 설정합니다. &quot;포커스&quot;를 클릭하고 &quot;PMT&quot;, &quot;이익&quot;의 값을 조정하고를 Cy3와 Cy5에 대해 개별적으로 레이저를 최적화하기 위해 매개 변수를 &quot;오프셋&quot;. </li><li> &quot;Z 단계&quot;를 클릭하고 레이저가 모두 켜져있는 동안 다음 &quot;포커스&quot;를 클릭합니다. 세트&quot;위로&quot;와 &quot;아래&quot;화살표를 클릭하여 &quot;Z 스테이지&quot;의 두께. 2 μm의 &quot;Z&quot;간격을 설정합니다. </li><li> &quot;중지&quot;를 클릭하고 &quot;Seq123&quot;를 선택합니다. 그런 다음, &quot;XYZ&quot;버튼을 클릭 염증 초점 내에서 선택 영역에 대한 &quot;Z&quot;시리즈의 이미지를 획득 시작합니다. AVI 파일과 &quot;Z 시리얼 이미지&quot;를 저장합니다. 이미지 파일을 저장하려면 &quot;Z 시리얼 이미지&quot;에서 이미지를 선택한 후, &quot;티파니&quot;형식으로 저장합니다. </li></ol></li><li> 세 부분 중 하나 세트가 IA의 / PLP 139-151 dextramers/anti-CD4 및 IA의 / TMEV 70 ~ 86 dextramers/anti-CD4가 수행하는 세 가지 섹션의 다른 세트로 염색 된 뇌로부터 3 쌍 섹션을 검사 정량 분석​​. <ol><li> 이와 유사하게,하는, 여덟 섹션 중 하나 세트는 IA K / Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 다른 자체로 염색 한, 심장 8 개의 쌍으로 섹션을 분석RNA 분해 효소 43-56 dextramers/anti-CD4 여덟 섹션의 t. </li></ol></li><li> 대뇌 섹션 당 10 ~ 15 염증성 병소를 검사하고, 각 초점, 15 25 시리얼 이미지를 순차적으로 세트를 취득. <ol><li> 마음의 8 개의 모든 부분에서 각각의 초점에서 20 염증성 병소의 총 검사는 순차적으로 10 ~ 15 시리얼 이미지를 수집. 같은 초점 내에서 &#39;Z&#39;시리즈의 반복을 피할 수 있도록 &#39;수평 수직 최대 수평 - 수직 아래 운동에 슬라이드를 스캔하여&#39;Z &#39;일​​련의 이미지를 가져 가라. </li><li> &#39;Z&#39;연속 영상이 포착되면, 슬라이드 번호, 섹션 이름, 촬영 &#39;Z&#39;직렬 화상의 수를 파악하여 파일의 이름. <ol><li> CD4 + T 세포의 총수와 관련 DEXT + CD4 + T 세포를 계산하는 &#39;ImageJ에&#39;소프트웨어를 이용한다. ImageJ에 &#39;의&#39;카운터의 유형 &#39;을 선택, 확인 및# 8216; 모두 표시 &#39;및 각 셀의 중심을 클릭하여 계산을 시작하고 다른 계산에 계속&#39;쪽 화살표를 사용하여 Z &#39;시리얼 이미지. 모든 CD4 T 세포를 계산 한 후, 카운터의 다른 유형을 선택하고 + T 세포 CD4 + DEXT를 계산합니다. 두 개의 서로 다른 카운터로 계산 세포의 총 수를 얻을 수있는 결과 탭을 클릭합니다. </li><li> 총 수를 획득하기 위해 모든 세 대뇌 섹션 또는 모두 팔 심장 섹션을 나타내는 모든 &#39;Z&#39;일련의 이미지 셀의 수를 추가한다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis-inducing+epitope+of+myosin+binds+constitutively+and+stably+to+I-Ak+on+antigen-presenting+cells+in+the+heart.">Myocarditis-inducing epitope of myosin binds constitutively and stably to I-Ak on antigen-presenting cells in the heart.</a> J Exp Med. 182 (5), 1291-1300 (1995).</li><li>Liao, L., Sindhwani, R., Leinwand, L., Diamond, B., Factor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alpha-myosin+heavy+chains+differ+in+their+induction+of+myocarditis.+Identification+of+pathogenic+epitopes.">Cardiac alpha-myosin heavy chains differ in their induction of myocarditis. Identification of pathogenic epitopes.</a> J Clin Invest. 92 (6), 2877-2882 (1993).</li><li>Cameron, T. O., Cochran, J. R., Yassine-Diab, B., Sekaly, R. P., Stern, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+detection+of+antigen-specific+CD4++T+cells+by+HLA-DR1+oligomers+is+dependent+on+the+T+cell+activation+state.">Cutting edge: detection of antigen-specific CD4+ T cells by HLA-DR1 oligomers is dependent on the T cell activation state.</a> J Immunol. 166 (2), 741-745 (2001).</li><li>Novak, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+human+epitope-specific+T+cells+identified+by+class+II+tetramers+reside+within+a+CD4high,+proliferating+subset.">Activated human epitope-specific T cells identified by class II tetramers reside within a CD4high, proliferating subset.</a> Int Immunol. 13 (6), 799-806 (2001).</li><li>Reddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+autoreactive+myelin+proteolipid+protein+139-151-specific+T+cells+by+using+MHC+II+(IAs)+tetramers.">Detection of autoreactive myelin proteolipid protein 139-151-specific T cells by using MHC II (IAs) tetramers.</a> J Immunol. 170 (2), 870-877 (2003).</li><li>Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+In+situ+tetramer+staining+of+antigen-specific+T+cells+in+tissues.">Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues.</a> J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+tetramer+staining.">In situ tetramer staining.</a> J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).</li><li>Skinner, P. J., Haase, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+staining+using+MHC+class+I+tetramers.">In situ staining using MHC class I tetramers.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 17, Unit 17.14.11 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않았습니다.

MHC 클래스 I 테트라와는 달리, 일상적인 응용 프로그램의 MHC 클래스 II 테트라의 사용은 특히 자신의 활성화 종속성 6,15-17에 부분적으로 인해 낮은 친화력자가 반응 CD4 T 세포의 전구체 주파수를 열거하는 도전되고 있습니다. 최근에,이 문제는 이러한 PLP 139-151, MOG 35-55과 Myhc 334으로자가 항원의 수를 항원 특이 CD4 T 세포를 감지하는 우리를 허용 &quot;, dextramers&quot;라고 사량의 다음 세대를 ?...

주요 조직 적합성 복합체의 사용은 항원 특이 CD4 T 세포의 검출 (MHC) 클래스 II 테트라 도전 1-7이었다. MHC 클래스 II 테트라의 검출 감도를 향상시키기 위해, 연구팀은 지정된 차세대 테트라, &quot;dextramers&quot;8을 만들었습니다. Dextramers는 여러 가지 펩타이드 닿는, 바이오틴 MHC 단량체 한 덱스 트란 분자 9에 부착 할 수있는 여러 스트렙 타비 딘 - 형광 부분이 접합되는 덱스 트란 등뼈가 포함되어 있습니다. 따라서, 몇개의 MHC-펩티드 복합체를 포함하는 MHC dextramers의 큰 응집체가 다수의 T 세포 수용체 (TCR도)와 상호 작용할 수있다. 이 그룹은 최근 다양한 자기 항원에 대한 dextramers을 생성 dextramers의 검출 감도가 약 테트라 8보다 5 배 정도였다. 실험 시스템은 실험자가 면역 뇌척수염을 포함 (EAE) 테오 단백질 (PLP) SJL 마우스에서 139-151로 유도; EAE는 수초 희소 돌기 아교 세포의 당 단백질 (MOG) C57BL / 6 마​​우스에서 35-55로 유도; 실험자가 면역 심근염 (EAM)는 심장 미오신 중쇄-α (Myhc) A / J 생쥐에서 334-352로 유도. 이 연구는 PLP 139-151의 사용을 보여 - 및 Myhc 334-352함으로써 형광 항체를 사용하여 신호를 증폭 할 필요가 없어, 직접 염색 프로토콜을 개발함으로써 특이 반응계에서 항원 특이 CD4 T 세포를 검출 dextramers 접근 일반적으로 테트라의 사용과 채택했다. 또, 조직을 평가하는 포괄적 인 방법은 또한 안정적 시츄 (10) 항원 특이 CD4 T 세포의 빈도를 열거 고안되었다. 시츄 항원 특이 T 세포의 검출 와키 활성화로 인한 것과 특정 항원 자극에 의해 유발 사건 묘사를 허용한다. 마찬가지로,있는 현장 기술도 제공하기대상 기관에 항원 특이 T 세포 침윤의 동역학을 추적하는 에스 기회.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:619px;">CFA</td>
			<td style="width:364px;">Sigma Aldrich, St Louis, MO</td>
			<td style="width:219px;">5881</td>
			<td style="width:167px;">Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MTB&#160; H37Rv extract&#160;</td>
			<td>Difco Laboratories, Detroit, MI</td>
			<td>231141</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PT</td>
			<td>List Biologicals Laboratories, Campbell, CA</td>
			<td>181</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1x PBS&#160;</td>
			<td>Corning, Manassas, VA</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female A/J mice&#160;</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Female SJL/J mice</td>
			<td>Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME</td>
			<td>686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 1 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leur-lok sterile 3 ml syrringe</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 18 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile needle, 27 1/2 G</td>
			<td>BD, Franklin Lakes, NJ</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3-way stopcock&#160;</td>
			<td>Smiths Medical ASD, Inc. Dublin, OH</td>
			<td>MX5311L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kerlix gauze bandage rolls&#160;</td>
			<td>Covidien, Mansfield, MA</td>
			<td>6720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kimwipes</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade</td>
			<td>Promega corporation, Madison, WI</td>
			<td style="width:219px;">V2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Immunopure normal goat serum</td>
			<td>Thermo Scientific, Waltham, MA</td>
			<td style="width:219px;">31873</td>
			<td>Store at -20 &#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Anti-mouse CD4 conjugated with PE dye</td>
			<td style="width:364px;">eBioscience, San Diego, CA&#160;</td>
			<td style="width:219px;">12004185</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td style="width:219px;">19202</td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Faramount Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Dako, Carpinteria, CA</td>
			<td style="width:219px;">10073021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Conical tube (15ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conical tube (50 ml)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:219px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well flat bottomed tissue culture plates</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td>356775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water color #2 brushes</td>
			<td>Charles Leonard, Inc. Hauppauge, NY</td>
			<td style="width:219px;">73502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plain Microscope slides, size: 3&#34; x 1&#34; x 1.2 mm</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">1255010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Premium Cover glass, 22 x 22-1</td>
			<td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;">12548B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable deep base mold histology cassettes</td>
			<td>Laboratory prodcust, Rochester, NY</td>
			<td style="width:219px;">M-475-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Loctite Super glue</td>
			<td>Henkel Corporation, Westlake, OH</td>
			<td style="width:219px;">1471879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Razor blades</td>
			<td>Gillette SuperSilver</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Myhc-a 334-352 (DSAFDVLSFTAEEKAGVYK)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">PLP 139-151 (HSLGKWLGHPDKF)</td>
			<td style="width:364px;">Neopeptide, Cambridge, MA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MHC class II/IAs PLP 139-151 or TMEV 70-86 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">MHC class II/IAk Myhc 334-352 or&#160; or RNase 40-56 dextramers conjugated with APC dye</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Dextran conjugated SA-APC</td>
			<td>&#160;Immundex, Copenhagen, Demark</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td>Store at 4&#959;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile surgical scissors and forceps</td>
			<td style="width:364px;">INOX tool Corporation</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro oven</td>
			<td style="width:364px;">GE Healthcare, Pittsuburgh, PA</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leica VT 1200 Vibratome</td>
			<td>Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, IL</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus BX 60&#160; Laser scanning confocal microscope</td>
			<td>Olympus America, Inc. Center Valley, PA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nikon A1-Eclipse 90i confocal microscope</td>
			<td>Nikon Inc. Melville, NY</td>
			<td style="width:219px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ detection of autoreactive cd4 t cells in brain and heart using major histocompatibility complex class ii dextramers

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin proteolipid protein (PLP) 139-151-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL mice and cardiac myosin heavy chain-&#945; (Myhc) 334-352-induced experimental autoimmune myocarditis (EAM) in A/J mice. Two sets of cocktails of dextramer reagents were used, where dextramers+ cells were analyzed by laser scanning confocal microscope (LSCM): EAE, IAs/PLP 139-151 dextramers (specific)/anti-CD4 and IAs/Theiler&#8217;s murine encephalomyelitis virus (TMEV) 70-86 dextramers (control)/anti-CD4; and EAM, IAk/Myhc 334-352 dextramers/anti-CD4 and IAk/bovine ribonuclease (RNase) 43-56 dextramers (control)/anti-CD4. LSCM analysis of brain sections obtained from EAE mice showed the presence of cells positive for CD4 and PLP 139-151 dextramers, but not TMEV 70-86 dextramers suggesting that the staining obtained with PLP 139-151 dextramers was specific. Likewise, heart sections prepared from EAM mice also revealed the presence of Myhc 334-352, but not RNase 43-56-dextramer+ cells as expected. Further, a comprehensive method has also been devised to quantitatively analyze the frequencies of antigen-specific CD4 T cells in the &#8216;Z&#8217; serial images.

이 보고서에서, MHC 클래스 II dextramers 직접 염색하여 항원 특이, 반응성 CD4 T 세포의 현장 검출에 설명되어 있습니다. 갓 잘라 뇌 섹션은 EAE 마우스에서 파생 된 (제어) dextramers 및 안티-CD4 (특정) 또는 TMEV 70 ~ 86 PLP 139-151을 포함하는 칵테일을 염색 하였다. 그림 1의 상단 패널은 이중 양성 세포가 노란색 등장 PLP 139-151 dextramers (빨강) 및 CD4 항체 (녹색)로 costained 대뇌 부분의 LSCM 분?...

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In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다.

주요 조직 적합성 복잡한 클래스 II Dextramers을 사용하여 뇌와 심장에있는자가 반응 CD4 T 세포의 제자리 탐지에

This report demonstrates the use of major histocompatibility complex (MHC) class II dextramers for detection of autoreactive CD4 T cells in situ in myelin ...

in-situ-detection-autoreactive-cd4-t-cells-brain-heart-using-major

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

11.6K 조회수.  University of Nebraska, Lincoln.  주요 조직 적합성 복합체 클래스 II dextramers 직접 염색으로 뇌와 심장 자기 반응성 CD4 T 세포를 감지하는 프로토콜은이 보고서에 설명되어 있습니다. 종합적인 분석을 위해, 시츄 항원 특이 CD4 + T 세포의 빈도를 열거하는 신뢰할 수있는 방법도 고안되어있다. 

비디오: In Situ Detection of Autoreactive CD4 T Cells in Brain and Heart Using Major Histocompatibility Complex Class II Dextramers

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

&lt;em&gt;In Vitro&lt;/em&gt; Differentiation of Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;FOXP3&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T Cells Using a TGF-&amp;#946;-containing Protocol

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

TGF-β 함유 프로토콜을 사용하여 나이브 CD4 + T 세포에서 인간의 CD4 + Foxp3의 + 유도 규제 T 세포 (iTregs)의 체외 분화

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The development of stable, non-toxic, fluorescent dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) allows for rare, antigen-specific T cells to be distinguished from bystanders by diminution in fluorescent staining, as detected by flow cytometry. This method has the following advantages over alternative approaches: (i) it is very sensitive to low-frequency T cells, (ii) no knowledge of the antigen or epitope is required, (iii) the phenotype of the responding cells can be analyzed, and (iv) viable, responding cells can be sorted and used for further analysis, such as T cell cloning.

Quantification of Proliferating Human Antigen-specific CD4+ T Cells using Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Presented here is a protocol for measuring proliferating CD4+ T cells in response to antigenic proteins or peptides using dye dilution. This assay is particularly sensitive to rare antigen-specific T cells and can be modified to facilitate cloning of antigen-specific cells.

카르복시플루아세인 수치니미딜 에스테르를 이용한 증식 인간 항원 특이적 CD4+ T 세포의 정량화

Described is a simple, in vitro, dye dilution-based method for measuring antigen-specific CD4+ T cell proliferation in human peripheral blood mononuclear ...

Assessing the Expression of Major Histocompatibility Complex Class I on Primary Murine Hippocampal Neurons by Flow Cytometry

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A well-studied function of major histocompatibility complex class I (MHCI) is the presentation of cell-derived peptides to the adaptive immune system, particularly in response to infection. More recently it has been shown that the expression of MHCI molecules on neurons can modulate activity-dependent changes in the synaptic connectivity during normal development and neurologic disorders. The importance of these functions to the brain health supports the need for a sensitive assay that readily detects MHCI expression on neurons. Here we describe a method for primary culture of murine hippocampal neurons and then assessment of MHCI expression by flow cytometric analysis. Murine hippocampus is microdissected from prenatal mouse pups at the embryonic day 18. Tissue is dissociated into a single cell suspension using enzymatic and mechanical techniques, then cultured in a serum-free media that limits growth of non-neuronal cells. After 7 days in vitro, MHCI expression is stimulated by treating cultured cells pharmacologically with beta interferon. MHCI molecules are labeled in situ with a fluorescently tagged antibody, then cells are non-enzymatically dissociated into a single cell suspension. To confirm the neuronal identity, cells are fixed with paraformaldehyde, permeabilized, and labeled with a fluorescently tagged antibody that recognizes neuronal nuclear antigen NeuN. MHCI expression is then quantified on neurons by flow cytometric analysis. Neuronal cultures can easily be manipulated by either genetic modifications or pharmacologic interventions to test specific hypotheses. With slight modifications, these methods can be used to culture other neuronal populations or to assess expression of other proteins of interest.

This protocol describes a method for culturing primary hippocampal neurons from embryonic mouse brain. The expression of major histocompatibility complex class I on the extracellular surface of cultured neurons is then assessed by flow cytometric analysis.

유동 세포에 의한 주요 조직 적합성 복합 클래스 1의 표현 평가

Increasing evidence supports the hypothesis that neuro-immune interactions impact nervous system function in both homeostatic and pathologic conditions. A ...

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &beta;2-Microglobulin

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and tumor development. The hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitution from different species can be stabilized in vitro. This is a feasible means to study MHC I of mammals, when the homologous &#946;2m is not available. Meanwhile, it is indicated that mammalian &#946;2m substitution does not significantly affect peptide presentation. However, there is limited summarization regarding the methodology and the technology for the hybrid MHC I complexed with heterologous &#946;2-microglobulin (&#946;2m). Herein, methods to evaluate the feasibility of heterologous &#946;2m substitution in MHC I study are presented. These methods include preparation of expression constructs; purification of inclusion bodies and refolding of the MHC complex; determination of protein thermostability; crystal screening and structure determination. This study provides a recommendation for understanding function and structure of MHC I, and is also significant for T cell response evaluation during infectious disease and tumor immunotherapy.

Stability and Structure of Bat Major Histocompatibility Complex Class I with Heterologous &amp;#946;2-Microglobulin

The protocol describes experimental methods to obtain stable major histocompatibility complex (MHC) class I through potential &#946;2-microglobulin (&#946;2m) substitutions from different species. The structural comparison of MHC I stabilized by homologous and heterologous &#946;2m were investigated.

배트 메이저 조직적합성 복합클래스 1등급 의 안정성 및구조 β 2-마이크로글로불린

The major histocompatibility complex (MHC) plays a pivotal role in antigen peptide presentation and T cell immune responses against infectious disease and ...

Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in cell line&#160;and three-dimensional (3D) cultures of human airway epithelium. The method allows highly specific and sensitive visualization of viral RNA by relying on HCR initiated by probe localization. Split-initiator probes help amplify the signal by fluorescently labeled amplifiers, resulting in negligible background fluorescence in confocal microscopy. Labeling amplifiers with different fluorescent dyes facilitates the simultaneous recognition of various targets. This, in turn, allows the mapping of the infection in tissues to better understand viral pathogenesis and replication at the single-cell level. Coupling this method with immunofluorescence may facilitate better understanding of host-virus interactions, including alternation of the host epigenome and immune response pathways. Owing to sensitive and specific HCR technology, this protocol can also be used as a diagnostic tool. It is also important to remember that the technique may be modified easily to enable detection of any RNA, including non-coding RNAs and RNA viruses that may emerge in the future.

Here, we describe a simple method that combines RNA fluorescence in situ&#160;hybridization (RNA-FISH) with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. This protocol may increase understanding of the molecular characteristics of SARS-CoV-2 RNA-host interactions at a single-cell level.

시투 혼성화에서 면역 RNA-형광을 이용한 SARS-CoV-2의 시각화

This manuscript provides a protocol for in situ hybridization chain reaction (HCR) coupled with immunofluorescence to visualize severe acute respiratory ...

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" of a T cell needs to be assessed by function, and higher function is associated with more powerful immune protection. T cells that can simultaneously produce two or more cytokines or chemokines at the single-cell level are called polyfunctional T cells (TPFs), which mediate immune responses through a variety of molecular mechanisms to express degranulation markers (CD107a) and secrete interferon (IFN)-&#947;, tumor necrosis factor (TNF)-&#945;, interleukin (IL)-2, or macrophage inflammatory protein (MIP)-1&#945;. There is increasing evidence that TPFs are closely related to the maintenance of long-term immune memory and protection and that their increased proportion is an important marker of protective immunity and is important in the effective control of viral infection and reactivation. This evaluation applies not only to specific immune responses but also to the assessment of cross-reactive immune responses. Here, taking the Japanese encephalitis virus (JEV) as an example, the detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs produced by peripheral blood mononuclear cells of children vaccinated against Japanese encephalitis were tested to provide a reference for similar studies.

Detection of Polyfunctional T Cells in Children Vaccinated with Japanese Encephalitis Vaccine via the Flow Cytometry Technique

The present protocol combines ex vivo stimulation and flow cytometry to analyze polyfunctional T cell (TPF)&#160;profiles in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) within Japanese encephalitis virus (JEV)-vaccinated children. The detection method and flow cytometry color scheme of JEV-specific TPFs were tested to provide a reference for similar studies.

유세포 분석 기술을 통한 일본 뇌염 백신 접종을받은 어린이의 다기능 T 세포 검출

T cell-mediated immunity plays an important role in controlling flavivirus infection, either after vaccination or after natural infection. The "quality" ...