우리는 가치있는 토론 안드레아스 Radbruch 감사합니다. 우리는 우수한 기술 지원을 동물 관리 및 로버트 귄터에 대한 지원은 Gruczek, 패트릭 Thiemann와 마뉴 엘라 Ohde을 사빈에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 원고의 교정에 대한 조직 학적 샘플의 평가와 랜디 린드 퀴 스트에 대한 우리의 훈련 된 평가자 로라 Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, 카트린 로스, 피렌체 Pache와 카타리나 혼 감사합니다. 우리는 MBP-특이 항체에 대한 J. 및 N. 리, 메이요 클리닉, 스코 츠 데일, 애리조나, 미국 감사합니다. 이 작품은 생체 내에 현미경 지미-DFG의 핵심 시설 네트워크 연구비에 의해 DFG HA5354 / 4-1에 의해 지원되었다 TRR130 / TP17 및 DFG는 AEHSZ에 2165 (HA5354 / 6-1) 국제 막스 플랑크에 의해 지원되었다 감염증 및 면역학 (IMPRS-IDI), 베를린 (Berlin) 학교.

동물 실험은 동물 복지 (Landesamt에 대 한 아퍼 싶게 Soziales, 베를린)에 해당하는 국가위원회에 의해 승인되었고, 현재의 지침과 규정 (동물 실험 라이센스 G0194 / 11)에 따라 수행되었다. 형광 골수 키메라 마우스의 1 세대 주 : 9 전에 설명한 바와 같이 골수 간질 세포를 시각화하기 위해 형광 골수 키메라 마우스의 생성이 행해진 다. <ol><li> 델-Cre 호텔이 조사를 위해 준비하기 (탠덤 적색 형광 단백질 (tdRFP) 도처 11-13을 표현 마우스) ROSA-tdRFP 마우스를 X 치료를 시작합니다. 또한, 형광 단백질의 유비쿼터스 식으로 다른 변형을 사용합니다. 이일 조사 전에 마시는 물을 통해 네오 마이신의 1 ㎎ / ㎖, 1 ㎎ / 비타민 ml의를 (A, D3, E, C) 관리합니다. </li><li> 세슘 137 감마선 조사 장치 위스콘신 3.8 회색으로 두 번 쥐를 조사3 시간의 간격 얇은. 이를 위해, 각각의 조사 장치에 적합한 조사 파이 케이지에 마우스를 놓습니다. 참고 : 마우스의 조사의 경우, 우리 연구소는 마취가 필요하지 않습니다. 조사를위한 마취에 대한 지역 기관 정책을 따릅니다. 고통의 흔적이있는 경우 조사 후 하루 카프로 펜 피하 (SC)의 5 ㎎ / ㎏과 동물을 취급합니다. </li><li> 다음날, 전송 버퍼 9 C57BL / 6 마우스의 공여체 긴 뼈로부터 제조 3 × 106의 골수 세포의 정맥 내 주사에 의해 생쥐 재구성. 최대 2 주 동안 네오 마이신에 마우스 및 비타민을 유지하고이 시간 동안 자신의 건강과 체중을 모니터링 할 수 있습니다. 특정 실험 치료를 시작하기 전에 면역계의 재구성이 가능하도록 적어도 사주 잠깐 (예를 들어, 면역화) 9. </li><li> 쥐를 희생하고 해부 보드에 배치, 70 % 에탄올로 다리를 소독. Euthaniz지역 기관 정책에 따라 전자 마우스. 우리 연구소는 자궁 경부 전위를 수행합니다. </li><li> 허벅지에서 피부를 제거하기 위해 집게와 가위를 사용합니다. 대퇴 뼈를 노출 근육 조직을 제거합니다. 집게와 가위를 사용하여 고관절과 무릎 관절에서 대퇴골을 삐다. 깨지거나 뼈를 절단하지 않도록주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 가위를 사용하여 뼈에서 근육 조직과 연골의 큰 조각을 나머지 제거합니다. 실험실 휴지와 뼈를 문질러 남아있는 근육 조직을 제거합니다. 인산염 완충 식염수 (PBS)와 페트리 접시에서 청소 뼈를 수집합니다. </li><li> 6 시간 - 4 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA, 전자 현미경 등급)에 전체 대퇴 뼈를 고정합니다. </li><li> PFA를 버리고 PBS O / N 10 % 자당의 뼈를 품어. 다음 날, 20 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어. 날이 후, 30 % 자당 O의 / n에서 뼈를 품어. </li></ol> 뼈 2. 냉동 절편 참고 : 한 후6 - 30 % 자당에 24 시간, 뼈를 동결 카와 모토의 테이프 방법 (14, 15)에 따라 그들을 동결 절단 (Cryosections). <ol><li> 드라이 아이스, 아세톤으로 큰 비이커 (2000 ml의 부피)를 준비 (약 2 : 1 부피비를, 예를 들면, 드라이 아이스 및 아세톤 400 ㎖를 200 ㎖) 흄 후드. (- 50 ml의 약 30) 내부 헥산 - (250 ml의 볼륨 150) 작은 비커를 놓습니다. (서리가 큰 비커의 외부에 표시 될 때까지, 약 10 분) 냉각 믹스 기다립니다. </li><li> 슈퍼 Cryoembedding 중간 (SCEM)로 표시 cryomold의 ¾을 채우 그들은 완전히 그들이 금형의 가장자리를 만지지 않도록주의하면서 몰입 될 때까지 조심스럽게 내부의 뼈를 배치합니다. 큰 집게로 바로 헥산의 표면을 만져 금형의 바닥 비커에 cryomold를 개최합니다. <ol><li> SCEM 동결의 바깥 쪽 가장자리하자 (불투명도로 표시를,이 약 15 초 소요). 그런 다음 완전히 헥산으로 금형을 삭제하고 FRE을하자2 분 - 1 EZE. 냉동 샘플을 꺼내 셀로판 포장 한 후 알루미늄 호일 (건조되는 샘플을 보호하고 빛에 대한 노출을 피해야). 냉동 절편 때까지 -80 ° C에서 보관. </li></ol></li><li> 대퇴 뼈의 냉동 절편을 위해 열심히 조직에 대한 표준 마이크로톰 및 마이크로톰 블레이드를 사용합니다. </li><li> -24 ° C에서 마이크로톰의 샘플 및 블레이드 온도를 설정합니다. 샘플을 절단하기 전에 약 15 분 동안 마이크로톰 안에 앉아 보자. <ol><li> SCEM 또는 최적의 절단 온도 OCT () 매체와 금속 시료 홀더에 샘플 블록을 수정합니다. 블록 필요한 경우의 방향을 조정합니다. 뼈가 완전히 열릴 때까지 샘플을 잘라 내고 골수 볼 수 있습니다. 7 μm의 단면 두께 (첫 번째 섹션 폐기) 조정합니다. </li><li> 사슴 가죽 커버 나무 주걱을 사용하여 샘​​플 블록의 상단에있는 끈적 끈적한면 카와 모토 테이프의 조각을 수정. 이어서, 시료를 절단하고 단면이되도록 테이프를 켜상부 측에 위치. 집게를 사용하여 슬라이드 글래스에 테이프를 전송합니다. 스카치 테이프로 슬라이드 글라스에 테이프를 고정합니다. </li></ol></li><li> 섹션 적어도 30 분 동안 건조 시키 및 사용 때까지 -80 ° C에 저장합니다. 그들이 함께 스틱 것을 피하기 위해 하나의 슬라이드 사이에 스페이서 플라스틱 슬라이드 상자에 흠 및 마운트 해제 슬라이드를 저장합니다. 스테인드 및 장착 된 슬라이드는 4 ° C에서 최대 일주일 판지에 슬라이드 폴더에 저장할 수 있습니다. </li></ol> 3. 이미지 모음 <ol><li> 일반적인 면역 프로토콜 9 항에 해동 얼룩 저온부. 예 : 핵 염색, 조직 무결성을 나타낼 4 &#39;, 6-diamidino-2 염산염 페닐 인돌 (DAPI)을 포함한다. 참고 : 얼룩, 예를 들어, RFP에 대한 기질 세포 (안티 - RFP - 비오틴 항체 및 스트렙 타비 딘 - 알렉사 형석 555), 쥐 안티 주요 기본 단백질 (MBP) 항체 및 안티 쥐 알렉사 형석 647 항체와 얼룩 호산구를 시각화 , B 세포안티 κ 경쇄 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC) 및 항 λ1 경쇄-FITC 항체 랫트 항 - B220 - 알렉사 형석 594 항체 및 PC를 (염색 과정의 세부 사항은도 9에 기재되어있다). </li><li> 스테인드 섹션을 탑재합니다 섹션에 fluoromount 한 방울을 넣고 조심스럽게 기포의 형성을 방지하는 동안, # 1 유리 커버 슬립 커버. 그 후, 염색에 적합한 레이저 라인을 갖추고 악기 레이저 스캐닝 공 초점 현미경을 수행합니다. </li><li> 간질 세포는 다음과 같은 설정을 적용 Wimasis 도구를 사용하여 골수 조혈 세포의 자동화 공동 지역화 분석 이미지를 기록하기 위해 : <ol><li> 20 배 대물 렌즈와 708.15 X 708.15 ㎛,보기의 필드를 사용합니다. 자동화 된 분석을 위해, 비교 결과를 유지하기 위해 2048 X 2048 픽셀 (PX)에서 일관된 모든 이미지의 크기를 유지한다. </li><li> 예를 들어, (간질 구조에 대한 하나의 채널을 기록, </em&gt; 561 nm의 레이저 라인), 핵에 대한 하나의 채널 (예를 들어, DAPI, 405 ㎚)과이자의 조혈 세포 (추가 채널 예를 들어, 3 채널, 호산구, B 세포와 PC 용 488/594/633 ㎚). </li><li> 4 16 평균 회선을 사용하여 이미지를 기록. 이상적으로, 하나의 인접한 이미지를 취함으로써 전체 대퇴골 부분을 커버한다. 대안 적으로, 골수 (골간뿐만 아니라 성장판)의 다양한 영역들에서 인접하지 않은 사진을 촬영. 참고 : 인접 이미지 (중복 영역에서 세포의 반복 분석을 피하기 위해) 사이의 중복을 생성하지 않도록주의하십시오. </li></ol></li><li> 현미경 이미지 파일 포맷으로 이미지를 저장. 확인하고, 필요한 경우, 이미지 뷰어 / 분석 소프트웨어의 모든 채널에 대한 대비를 조정합니다. </li><li> 이미지 파일 당 수출 3 .JPG 파일 : DAPI 채널 (빨강 / 녹색 / 청색 (RGB) 형식으로, 노란색으로 구분 거짓 색상), 기질 채널에 대한 하나 .jpg 파일 (그레이 스케일)과 하나 .JPG 하나 .jpg 파일 파일 포함조혈 세포에 대한 채널 (3 채널 최대, RGB 형식, 예를 들어, FITC (PCS, 거짓 색상 : 녹색) / 알렉사 형석 594 (B 세포, 거짓 색상 : 블루) / 알렉사 형석 647 (호산구, 거짓 색상 : 적색)) . </li></ol> 4. 자동 이미지 분석 <ol><li> 영상 분할, 공동 현지화 및 지역 분석 (토론 참조)의 정량을 수행하기 위해 이미지 분석 도구를 사용합니다. </li><li> Wimasis 도구를 사용하는 경우 다음과 같이 진행합니다 : <ol><li> 밑줄과 화상의 종류를 나타내는 숫자가 뒤에 동일한 파일 이름으로 이미지 당 3 .JPG 파일 세트 업로드. </li><li> 조혈 세포와 .jpg 파일에 대한 _1를 사용하여, 기질 채널에 대한 .jpg 파일에 대한 DAPI 채널 _3을위한 .jpg 파일에 대한 _2. Image1_1.jpg (조혈 세포), Image1_2.jpg (DAPI 채널) 및 Image1_3.jpg (기질 채널) 예를 들면 다음과 같습니다. 고객 계정을 통해 이미지를 업로드합니다. </li><li> 세포 연락처 정량각각의 필드를 클릭하여 셀 접촉 도구를 선택합니다. 세포 주변 정량, 셀 주변 도구를 선택하고 (세포 &#39;가장자리에서 측정) μm의에서 선호 주변 반경을 입력합니다. </li><li> 결과를 다운로드합니다. 주 : 결과 요약에 더하여, .JPG의 조혈 세포 및 검출 된 객체의 경계를 가진 기질 채널을 나타내는 파일 강조뿐만 아니라 모든 이미지에 대한 측정을 포함하는 단일 .CSV 파일로 제공되어 .CSV 파일 그 업로드 된 모든 이미지에 대한 데이터가 포함되어 있습니다. </li></ol></li><li> 접촉으로부터 측정 예 대표 결과에 나타낸다 기질 세포 또는 다른 조혈 세포 유형을 접촉시키는 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수와 접촉 (조혈 세포 (적색, 녹색 또는 청색의 셀)의 주파수를 결정 그림 4). 주파수를 결정하기 위해, 화상에 의해 주어진 접촉 당 카운트 분할총 셀은 이미지 당 계산합니다. <ol><li> 개별 쥐 실험을 위해, 하나의 마우스에 대한 사진의 총 접촉 카운트를 합산하고 사진의 총 세포 수의 합으로 나누어 이들을. </li></ol></li><li> 단계 4.3 (에 기재된 근방 측정으로부터, 간질 세포 및 / 또는 다른 조혈 세포 유형에 바람직 근방 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수로부터 선택된 거리에 적색, 녹색 또는 청색 셀의 주파수를 결정 또한 참조 대표 결과, 그림 4). </li></ol> 임의의 골수 위치 5. 시뮬레이션 <ol><li> 분석 골수 조직 학적 영상에 임의의 셀 위치 결정의 시뮬레이션을 실행하기 전에, 미리 다음 파일을 준비 : 세포 접촉 도구 DAPI 채널에 대한 원래 .JPG 파일과 원래 .JPG 파일에 의해 제공되는 단일 .CSV 파일 간질 채널. </li><li> 수행하기 위해서일련의 이미지에 배치 시뮬레이션 (예를 들어, 하나의 대퇴 섹션의 모든 이미지), 하나의 폴더에 모든 원본 .JPG 파일 (_1, _2와 _3)와 대응하는 하나의 .CSV 파일을 수집합니다. 참고 : 임의의 골수 세포의 위치 결정을위한 시뮬레이션 도구의 요청에 따라 사용할 수 있습니다. </li><li> 박스 &quot;자동로드 이미지 데이터를&quot;확인, 시뮬레이션 도구를 시작합니다. 주 : 프로그램 .csv 파일에서 세포 수 및 평균 기포 크기를 자동으로 판독 할 것이다. 이 값은 &quot;셀 번호&quot;와 &quot;셀 크기 AVG&quot;(그림 5A)에 대한 상자에 표시됩니다. </li><li> .CSV 파일, 즉, 이름에 공통 요인에 대한 공통 태그를 입력합니다. 회분식 시뮬레이션 표기 화상 세트의 수를 입력한다. </li><li> (파일 이름 끝 _3과) 기질 채널에서 발생하는 .jpg 파일을로드합니다. </li><li> DAPI 채널로부터 마스크를 생성하기위한 설정 입력 : <ol><li> 상자를 &quot;확인? 마스크를 적용 &quot;(10) (- 255 범위 0)에 바이너리 마스크로 DAPI 이미지를 변환하는 임계 값을 설정합니다. </li><li> 확인란을 선택합니다 &quot;팽창?&quot; &quot;? 8 비트&quot;상자를 선택하고 5 픽셀로 팽창의 등급을 설정합니다. &quot;/ 침식? w&quot;확인란을 선택합니다. </li><li> 시뮬레이션 이미지의 분석에 사용 근방 반경 (이웃 반경)에 대한 원하는 값을 입력한다. (픽셀 스케일링 XY : 0.346 μm의) 2,048 X 2,048 픽셀의 크기 708.15 X 708.15 μm 인 이미지의 경우, 29 PX 10 μm의에 해당합니다. </li></ol></li><li> 확인란을 선택합니다 &quot;오오 츠를 사용?&quot;간질 구조를 자동으로 감지 오츠의 알고리즘 (17)를 사용합니다. 주 :이 접촉 부근 툴에 의해 사용되는 동일한 알고리즘이다. 기록 된 화상과 시뮬레이션 화상의 자동 분석에 동일한 이미지 분할 알고리즘을 이용하여 유사한 데이터를 유지하기 위해 중요하다. </li><li> 아칸소 조혈 세포에 대한 설정을 입력전자는 원형 모양으로 시뮬레이션. 참고 : 적색, 녹색, 청색 세포의 세포 수를 직접합니다 (5.6 단계) .csv 파일에서로드됩니다. <ol><li> 적색, 녹색, 청색의 픽셀 셀의 평균 직경을 계산하는 시뮬레이션 툴을 사용한다. 이미지 당 총 세포 수로 나눈 PX의 이미지의 각 세포 유형의 총면적 단일 셀의 평균 면적을 결정한다. 수식을 이용하여 디스크의 반경을 계산하는 평균 면적을 사용한다. 평균 직경을 결정하기 위해 반경 두배. </li></ol></li><li> 오브젝트 세그멘테이션 기능을 포함하는 이미지 분석 소프트웨어로 분석 세포 유형의 세포 크기 분포를 측정한다. 모든 조혈 세포 유형 (18 및도 5b)에 대한 σ를 결정합니다. 주 : 기록 셀의 셀 크기 분포는 자동화 된 이미지 분석에 의해 측정되지 않기 때문에, 실제의 분포로 근사 가우스 분포를 사용한다. t의 폭그 분포 곡선은 σ에 의해 설명되고, 다양한 세포 유형에 대해 상당히 상이 할 수있다. (자세한 내용은 그림 5B 참조). <ol><li> 정지 화상 분석 툴에 의해 전체 셀로서 인식 작은 개체를 설명 PX의 직경이 측정에서, &quot;셀 크기 컷&quot;을 결정한다. </li></ol></li><li> 그래픽 사용자 인터페이스 (그림 5A)에 각각의 상자에 매개 변수를 입력합니다. <ol><li> PX에 직경으로, 차단 셀 크기, 즉, 시뮬레이션에서 허용 최저 셀 크기를 입력한다. </li><li> (단계 5.9)에서, 적색, 녹색 및 청색 셀 대 셀 크기 분포의 시뮬레이션 (PX)에서 σ를 입력한다. </li><li> 하위 섹션 &quot;마스크 세포&quot;의 &quot;삭제&quot;확인란을 선택합니다. 이 마스크의 출입 금지 영역이 적어도 하나의 픽셀 겹치면이 설정 프로그램이 새로운 셀에 대한 위치를 선택한다. 세포의 중복을 피 &quot;확인란을 선택? ̶1; 하위 섹션 &quot;셀 배제&quot;에. </li><li> PX 두 세포의 중심 간의 최소 허용 거리를 입력한다. 참고 : 최소 거리는 녹화 된 영상에서 결정해야합니다. 잘못 측정 된 최소 거리를 기록하고 시뮬레이션 이미지의 비교에 대한 편견 / 인공 결과로 이어질 것입니다. </li><li> 오버랩 중심 중심으로부터 최단 거리에 의해 정의되는 경우 100 %의 최대 오버랩 영역을 설정. </li><li> 1000 반복에 대한 시뮬레이션 도구를 설정합니다. </li><li> 확인란을 선택합니다 &quot;자동 저장 세포를?&quot;.rect 파일 (텍스트 형식)으로 배치의 각 이미지의 모든 반복에 대한 모의 객체의 좌표를 저장합니다. 확인란을 선택합니다 &quot;자동 저장 이미지를?&quot;시뮬레이트 된 각 이미지의 .TIFF 파일을 저장합니다. 저장된 파일에 대한 공통 태그를 입력합니다. 주 : &quot;? 자동 저장 셀&quot;옵션을 실제 시뮬레이션 IMA를 저장할 때와 비교하여, 시뮬레이션 실행 시간 및 전체 데이터 크기를 줄일GES. .rect 파일은 직사각형으로 모의 셀의 좌표를 저장하고 필요에 따라서 시뮬레이션 이미지로 변환 할 수있다. </li></ol></li><li> &quot;실행 시뮬레이션&quot;을 클릭하여 시뮬레이션을 시작합니다. 주 : 시뮬레이션 도구가 자동 반복 시뮬레이션의 각 세트에 대해 적색, 녹색, 청색 및 간질 세포와, 적색, 녹색 및 청색 셀의 평균 접촉 횟수와 근방 카운트 포함한 모든 이미지의 1000 시뮬레이션을위한 .csv 파일을 생성 . 또한, 모든 값, 표준 편차 (STD)과 평균의 표준 오차 (SEM)과 1,000 시뮬레이션의 평균이 제공됩니다. </li><li> 연락처 주파수와 1,000 시뮬레이션 이미지 중 하나 세트의 주변 주파수 평균을 결정합니다. 이를 위해, 이미지 당 기록 된 세포 수에 의한 평균 연락처 및 주변 수를 나눕니다. 촬영 된 이미지의 자동화 된 공동 현지화 분석 결과에 주파수를 비교한다. </li><li> 적절한 쓰레딩 적용분석 (19)에 따라 stical 방법은 (그림 7, 우리는 양측 Wilcoxon signed rank test를 사용). </li></ol>

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).</li><li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells.">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li><li>MacQueen, J. 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Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li><li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li><li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euclidian+distance+mapping.">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).</li><li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive.">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li><li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow.">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li><li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells.">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li><li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice.">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche.">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands.">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li></ol>

Juan Escribano Navarro is affiliated with Wimasis GmbH, Munich, Germany. The other authors have no conflicts of interest to declare.

현대 광학 묘화 법의 진보에도 불구하고, 데이터의 조직 학적 분석은 여전히​​ 종종 적절한 정량 도구와 방법의 부족 또는 관심사 작은 영역에 집중 편향된 분석에 의해 방해된다. 여기에 제시된 시너지 효과는 이미지 전체 골수 영역을 커버 분석, 자동 분할 및 다양한 조혈 및 간질 세포 유형, 공동 현지화 분석의 물체 인식, 새로운 관례가 제공하는 비 무작위로 발생하는 접점의 마지막 유효성...

인해 광학 현미경 이미지 등을 포함한 최근의 급속한 기술 발전에, 조직 전체의 문맥 내에서 세포의 분석은 면역학 점점 접근되고있다. 서스펜션에서 단일 세포의 특성은 세포 및 분자 기능을 이해하는 귀중한 불가결 방법을 나타냅니다. 그러나, 그들의 (마이크로) -anatomical 환경 내 세포의 분석은 면역 반응의 개발과 같은 복잡한 공정에서 공동 다양한 세포 유형 간의 상호 작용을 이해하는 데 필수적이다. 현미경 학자, 이미지의 정 성적 정보를 획득하는 것이 상대적으로 용이하지만, 그것은 부분적으로는이 분야의 분석 방법은 화상 획득 가능한 것과 비교 뒤쳐져 있다는 사실, 이들 데이터를 정량화 할 과제로 남아. 많은 연구자들은 여전히​​ 시간 소모적 그들의 조직학 이미지에서 수동 세포 카운팅에 의존따라서 다른 평가자 사이에 바이어스를 도입하고 다른 그룹에 의해 복제를 방해. 때때로, 하나의 대표 이미지는 하드 독자가 이러한 경우의 통계적 관련성을 판단 할 만들기, 책에서 휴대 전화 위치 또는 공동 현지화에 문을 강조하기 위해 선택된다. 함께 화상 데이터의 전체 정보 콘텐츠가 거의 이용되지 않는다는 사실과, 이는 더 빠르고 편견 광범위한 조직 학적 방법이 이미지를 분석 할 필요성을 강조한다. 골수는 성인 척추 동물의 조혈 기관으로 중요한 기능 회복에 걸리는 복잡한 조직이다. 조혈 세포 1,2 출생지와 B 림프구의 발달 3 중요한 역할 외에, 또한 면역 반응 개시 4 성숙한 재순환 B 세포 5 지원되는 사이트로서 작용한다. 난을 유지하는 외에, 그 역할면역 메모리를 구성하는 세포의 여러 종류가 6-9이 존재하는 것으로 밝혀졌다으로 mmunological 메모리는 점점, 지난 10 년간 평가되고있다. 복잡한 조직 골수의 구조와 기능 사이의 관계는 여전히 애매 남아있다. 이러한 T 및 B 세포 영역으로 매크로 구획으로 구성되어 차 림프 기관과는 달리, 골수 맑은 매크로 구획화 없다. 지금까지 골수에서 별개의 구획 골 피질 또는 혈관의 근접에 의해 정의된다. 이러한지지 줄기 세포, B 세포 또는 장수 형질 세포 (PC와 같은 면역 기억 세포 집단 (유지), CD4 + 및 개발 등의 처리의 수에 대한 골수의 다양한 상주 간질 세포 집단의 중요성 CD8 + 메모리 T 세포)는 명확 골수 미세 구획화 어느 정도가 있음을 나타낸다. <p클래스 = &quot;jove_content은&quot;&gt; 이러한 관찰은 특정 기능 골수 (셀 유지 보수, 다양한 단계에서 B 세포 개발 및 면역 메모리의 유지 보수 줄기)를 전문으로하는 별개의 microanatomical 틈새 시장의 개념으로 이어졌다. 서로 다른 기능을 수행 틈새 사이에서 이질성의 어느 정도있을 것 같습니다 있지만, 이러한 CXC-케모카인 리간드 12 (CXCL12) 또는 인터루킨 7 (IL-7) 등의 기질 세포에 의해 생성되는 몇 가지 요소는 매우 중요 구성 요소 이러한 틈새 시장 (10)의 여러. 골수에서 시각화 및 간질 세포의 특성 때문에 가늘고 긴 돌기 확장 골수에 걸쳐 네트워크를 형성하는 자신의 형태 적 특징에 곤란하며, 해당 마커의 부족 기질 아 집단을 구별하기. 이러한 틈새가 자신의 세포 및 분자 compositio에 대한 공통적 인 특징을 공유 어느 정도는 아직까지 명확하지 않다n 및 요소는 특정 틈새 시장 고유의 렌더링합니다. 간질 세포 이외에, 조혈 세포 유형은 틈새의 적어도 일부 특정 신호들을 제공함으로써 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 분명히, 틈새 조성물의 복잡성은 동일계에서의 분석이 필요하고, 면역학 및 혈액학는 세포 성분 사이의 공간적 관계를 분석하여, 예를 들어 골수 마이크로 아키텍처를 확대하는 것이 점점 더 중요 해지고있다. 여기에, 전략은 제시 자동화 및 편견 방법으로 골수 세포 공동 현지화 및 이웃 관계를 정량화한다. 형광 기질 세포 및 비 형광 조혈 세포, undecalcified 뼈, 전체 뼈를 덮는 공 초점 화상의 취득으로부터 조직 학적 단면의 제조뿐만 아니라, 셀룰러 (C)의 자동화 된 이미지 분석, 키메라 마우스의 생성을 포함하는 형질 상세한 플로오 - 현지화 및 시뮬레이션 툴에 의해 임의의 위치에서의 검증 / 차별 (그림 8)을 제공한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1864">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1200px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Neomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">N6386 SIGMA</td>
			<td>Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Ursovit AD3EC</td>
			<td style="width:145px;">Serumwerke Bernburg</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,&#160; 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">P4333&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;&#160;&#160; H3375&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">D602-0100</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade)</td>
			<td style="width:145px;">Science Services</td>
			<td style="width:155px;">15713</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">D(+)-Sucrose</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">4621.1</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Dry ice</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Acetone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma.Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">179124 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Hexane</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">208752 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek cryomolds (standard)</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4557</td>
			<td>25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td>&#160;www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s SCEM embedding medium</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryosection preparation kit&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryofilm type 2C(9)</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">3052835</td>
			<td>L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13&#34;), thickness: 0.25 mm (0.01&#34;);www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">600-406-379</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Alexa Fluor 555 streptavidin</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">S-32355</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-MBP</td>
			<td style="width:145px;">J. and N. Lee</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">goat anti-rat-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">A-21247</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-B220 - Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">mouse anti-l1 light chain -FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-k light chain - FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542 SIGMA</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:145px;">DAKO</td>
			<td style="width:155px;">S3023</td>
			<td>www.dako.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm)</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">H875.2</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:145px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">48311-703</td>
			<td>www.vwr.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Automated image analysis tools for bone marrow</td>
			<td style="width:145px;">Wimasis, Munich</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VC2012 Runtime</td>
			<td style="width:145px;">Microsoft</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Simulation tool for random cell positioning</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from us, upon request</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:365px;">Image analysis software with image segmentation functions</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fiji image analysis software&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification of hematopoietic cell &#8211; stromal cell interactions in histological images of undecalcified bone

초점 현미경은 골수 같은 복잡한 조직 내에서 여러 종류의 세포 편재 분석위한 선택 방법이다. 많은 경우에 따라서 레이터 의존적 바이어스를 도입하고 자간 신뢰성을 감소의 위험을 담지 수동 계산에 의존하지만, 셀룰러 편재 및 정량 분석​​이 어렵다. 세포 유형은 그 발생 빈도의 차이가 특히 강하게 또한, 임의 위치로부터의 결과 두 셀 간의 공동 지역화 여부를 판단하는 것이 곤란하다. 여기서, 골수 세포 공동 편재 편견 정량 방법이 도입된다. 프로토콜은 골수를 포함한 전체 뮤린 긴 뼈의 조직 학적 섹션을 획득하기 위해 사용되는 샘플 제조뿐만 아니라, 염색 프로토콜과 고해상도 화상의 취득을 설명한다. 조혈 및 비 hemat의 인식에서 스패닝 분석 워크 플로우이들 셀 사이의 직접적인 접촉의 정량화 2 차원 (2D) 골수에서 이미지 opoietic 세포 유형이 제공된다. 이것은 또한 특정 세포 유형을 둘러싸 세포 미세 환경에 대한 정보를 얻기 위해, 이웃 분석을 포함한다. 두 종류의 세포 공동 지역화 랜덤 셀 위치의 단순한 결과 또는 셀 간의 우선 연결을 적용할지 여부를 평가하기 위해, 조혈뿐만 아니라 간질 세포의 경우,이 가설을 시험하기에 적합하다 시뮬레이션 도구이며, 사용. 이 방법은 골수에 한정되지 않으며, 조직 학적 데이터의 재현성, 정량 분석​​을 허용하기 위해 다른 조직으로 확장 될 수있다.

카와 모토 테이프 방법 undecalcified 뼈의 저온부를 절단 골간뿐만 아니라 함께 골단 영역 모두에서 전체 뼈 여전히 광물 뼈에 부착 내막 영역의 골수, 손상 부분으로 절단되도록 그들의 소주 골의 고밀도 (도 1). 섹션들의 핵 염색 제조에 작은 균열이 완전히 회피 될 수 없지만, 동맥 정현파의 구조뿐만 아니라, 실질의 망상 네트워크를 그대로 유지하는 것이 알 수있다. <p class="jove_conte...

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

11.4K 조회수.  German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute. A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce mutations that potentially lead to cancer. The use of an enzymatic assay to quantify stem cell mutations in the X-linked glucose-6-phosphate dehydrogenase gene has been previously reported.1 This method requires the preparation of frozen sections and incubation of the sectioned tissue with a reaction mixture that yields a blue color if the cells produce functional glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) enzyme. If not, the cells appear whitish. We have modified the reaction mixture using Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) medium in place of polyvinyl alcohol. This facilitates pH measurement, increases solubilization of the G6PD staining components and restricts diffusion of the G6PD enzyme. To demonstrate that a mutation occurred in a stem cell, the entire crypt must lack G6PD enzymatic activity. Only if a stem cell harbors a phenotypic G6PD mutation will all of the progeny in the crypt lack G6PD enzymatic activity. To identify crypts with a stem cell mutation, four consecutive adjacent frozen sections (a level) were cut at 7 &#181;m thicknesses. This approach of making adjacent cuts provides conformation that a crypt was fully mutated since the same mutated crypt will be observed in adjacent sections. Slides with tissue samples that were more than 50 &#181;m apart were prepared to assess a total of &#62;104 crypts per mouse. The mutation frequency is the number of observed mutated (white) crypts &#247; by the number of wild type (blue) crypts in a treatment group.

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

연구

발생학

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly gained attention because they do not pose any ethical or moral concerns. Current methods to isolate MSCs from UC yield low amounts of cells with variable proliferation potentials. Since UC is an anatomically-complex organ, differences in MSC properties may be due to the differences in the anatomical regions of their isolation. In this study, we first dissected the cord/placenta samples into three discrete anatomical regions: UC, cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP). Second, two distinct zones, cord lining (CL) and Wharton&#39;s jelly (WJ), were separated. The explant culture technique was then used to isolate cells from the four sources. The time required for the primary culture of cells from the explants varied depending on the source of the tissue. Outgrowth of the cells occurred within 3 - 4 days of the CPJ explants, whereas growth was observed after 7 - 10 days and 11 - 14 days from CL/WJ and FP explants, respectively. The isolated cells were adherent to plastic and displayed fibroblastoid morphology and surface markers, such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, similarly to bone marrow (BM)-derived MSCs. However, the colony-forming efficiency of the cells varied, with CPJ-MSCs and WJ-MSCs showing higher efficiency than BM-MSCs. MSCs from all four sources differentiated into adipogenic, chondrogenic, and osteogenic lineages, indicating that they were multipotent. CPJ-MSCs differentiated more efficiently in comparison to other MSC sources. These results suggest that the CPJ is the most potent anatomical region and yields a higher number of cells, with greater proliferation and self-renewal capacities in vitro. In conclusion, the comparative analysis of the MSCs from the four sources indicated that CPJ is a more promising source of MSCs for cell therapy, regenerative medicine, and tissue engineering.

Here, we present a protocol for the dissection of human umbilical cord (UC) and fetal placenta sample into cord lining (CL), Wharton&#39;s jelly (WJ), cord-placenta junction (CPJ), and fetal placenta (FP) for the isolation and characterization of mesenchymal stromal cells (MSCs) using the explant culture technique.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

각 막 조직 공학:는 생체 외에서 의 모델 인간 각 막의 실질 신경 상호 작용

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

부착 세포 배양에서 시간 경과 형광 현미경 검사 법에 의해 단백질 저하의 단일 셀 정량화

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...