이 작품은 로우 랜드 주니어 펠로우 프로그램에 의해 지원됩니다. 크리스 스톡스 주문 제작, 컴퓨터를 이용한 압력 제어 설정, 박사 다이앤 Schaak의 개발에 그의 도움을 : 저자는 하버드 로우 랜드 연구소의 과학자들과 직원에게 감사의 말씀을드립니다 생물학적 시료 처리에 대한 그녀의 입력, 윈필드 힐에 대한 전기 설치, 박사 Alavaro 산체스 개발 압력 설정에 필요한 기계 배관 부품 가공에 대한 흐름 cytometer, 스콧 Bevis, 케니 스펜서 돈 로저스에 대한 액세스 권한을 부여합니다. 미세 유체 주인은 하버드 대학 나노 시스템을위한 센터 (CNS)에서 제작 하였다.

1 셀 준비 <ol><li> 접시 1 × 10 10 % (v / v) 소 태아 혈청과 1로 보충 Leibovitz의 L-15 중간에 조직 배양 용 T75 플라스크 당 10 ㎖의 부피 전이성 유방암 세포주 MDA-MB-231의 5 세포 / ml % 페니실린 - 스트렙토 마이신. </li><li> 0 % CO 2 환경과 37 ° C에서 가습 배양기에서 MDA-MB-231 세포를 품어. </li><li> 2 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA로 세포를 처리함으로써 이일 파종 후 실험 수확 세포 및 성장 배지 8 ㎖에 첨가함으로써 트립신의 활성 효소를 불 활성화. </li><li> 5 × 105 세포 / ml의 최종 농도 (칼슘 및 마그네슘 2 +없이 DPBS, 1X) 둘 베코 인산염 완충 식염수를 200 × g 및 재현 탁에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포 펠렛. </li></ol> 2 장치 설계 및 제작 참고 : 마스크, 마스터 몰드 날조와마이크로 채널 클로징 처리는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 미세 주조법이 일반 실험실 벤치 탑상에서 수행 될 수있는 동안 클린 룸 안에서 실시하여야한다. <ol><li> AutoCAD를 그림 1에 나타낸 바와 같이 미세 유체 장치를 설계합니다. 이 장치는 (L = 7mm W = 40 μm의, 그리고 H = 70 μm의) 여러 주입 포트, 거친 필터와 두 개의 평행 한 직선 직사각형 관성 중심 채널 입구로 구성되어야합니다. 개별 직선 채널은 알루미늄 전극 구멍을 통해이와 떨어져 800 μm의 배치 5 일렉트로 챔버 (W C = 400 μm의)로 구성되어 있습니다. 두 횡 방향으로 인접하는 일렉트로 챔버 음극 용 구멍을 공유한다. 두 개의 직선 채널은 일렉트로 지역의 하류에있는 콘센트에 병합합니다. </li><li> LinkCAD를 사용하여 GDSII 파일에 마이크로 패턴 CAD 파일을 변환합니다. 빈 5 &quot;× 5&quot;포토 마스크에 미세 패턴을 작성레이저 마스크 라이터. 제조 업체의 프로토콜에 따라 마스크를 개발한다. 참고 : 마스크 개발 프로세스는 포토 레지스트 현상, 크롬 에칭 및 레지스트 제거를 포함한다. 대안 적으로, 마이크로 패턴을 고해상도 투명도에 인쇄 (&gt; 20,000 DPI)를 타사 메이커로부터 구입하고, 포토 마스크로 사용될 수있다. 포토 마스크에 최종 마이크로 기능은 네가티브 포토 레지스트의 극성이 일치하도록 투명해야한다. </li><li> 70 μM의 최종 두께를 갖도록 2000 rpm에서 4 인치 실리콘 웨이퍼 상에 네거티브 포토 레지스트를 스핀 코트 표준 소프트 리소그래피 기술 (23)을 사용하여 장치 설계의 주형을 제조. </li><li> 95 ° C에서 20 분 동안 네가티브 포토 레지스트와 웨이퍼를 프리 베이킹. </li><li> 웨이퍼와 마스크를 연락 마스크 얼 라이너를 사용하여 80 초 동안 UV 소스 (17.4 엠제이 / cm 2)에 노출. </li><li> SU-8 개발에 4 분 동안 노출 된 웨이퍼를 개발한다. </li><li> 측정표면 프로파일로 미터를 사용하여 개발 된 포토 레지스트 두께. </li><li> 제 (실리콘 엘라스토머 키트) 경화 엘라스토머 1 비율 및 PDMS 복제본을 생성하는 주형에 부어 혼합물 : 엄격 10 섞는다. 30 분 동안 주조 엘라스토머를 탈기하고 2 시간 동안 70 ° C의 오븐에서 탈기 엘라스토머 주형을 경화. </li><li> 핀 바이스를 사용하여 입구, 출구 및 전극 삽입을위한 금형 및 펀치 구멍에서 마이크로 패턴과 경화 된 PDMS 복제를 박리. NOTE : 핀 바이스의 통상 절삭 날 직경 단단히 대신 PEEK 튜빙 (32 분의 OD &quot;) 및 알루미늄 전극 (0.029의 OD&quot;)를 유지하기위한 충분한 0.76 mm이어야한다. </li><li> 각각 75 W, 500 mTorr로의 고주파 전력 및 산소 분압에서 7 초간 산소 플라즈마 클리너로 처리 된 유리 슬라이드에 결합 PDMS 복제본으로 둘러싸인 미세 유체 채널을 생성. </li></ol> 3 흐름 실험 <ol><li> 삽입알루미늄 전극 (0.029 &quot;OD) 및 출구 PEEK 튜빙 (32 분&quot;미세 구멍을 통해 지정된 장소에 OD)는 (그림 3B 참조). </li><li> 알루미늄 전극에 고전압 짧은 구형파 펄스를 발생하기위한 18 담당 전기 기기를 연결 PDMS 몰드에 흐르는 용액과 접촉하는 (도 3c 참조). 참고 :이 장비는 펄스 발생기 및 자체 내장 된 고전압 앰프로 구성한다 (18). </li><li> (도 3a 참조) 세포 및 생체 분자와 네 개의 50 ml의 원심 개별적 DPBS를 함유하는 튜브, 용액을 준비하고, 공기 유량 제어 시스템에 연결된 각각의 바이알 홀더에 각각 끼운다. 18 </li><li> 미세 유체 장치의 각 입구 구멍에 유리 병 홀더에서 유입 PEEK 튜브를 연결합니다. </li><li> 저런 전기를 갖기 위해 100 V로, 구형파 펄스 V의 크기를 설정LD 강도, E = V / L 전자, 전기 천공 챔버 걸쳐 0.7 kV로 / cm 동등. NOTE : 여기서, L 전자는 양극과 음극이 흐르는 용액과 접촉하는 두 점 사이의 거리 (도 1 참조). </li><li> 40 PSI에 압력 조절기를 설정합니다. NOTE :. 단일 수동 조절 질소원 균일 모든 샘플 튜브를 가압하기 위해 사용되며, 고속 매니 폴드 적시 맞춤식 LabVIEW 소프트웨어를 사용하여 각각의 용액 포트를 활성화하기 위해 이용되는 18 </li><li> 밸브 제어의 경우, 밸브 러너 레이블 주문 제작 LabVIEW 소프트웨어를 열고 운영한다라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 실행을 클릭합니다. </li><li> 해당하는 각 밸브 아이콘을 클릭하여 밸브를 켭니다. 참고 :이 활성화 될 때 밸브의 아이콘이 녹색으로 변합니다. 활성화 된 아이콘을 클릭하면 비활성화하고 밸브를 닫습니다. 닫힌 밸브 아이콘이 회색으로 설정해야합니다. </li><li> (DPBS 저수지에 밸브를 열고즉., 1.5 분 동안 안정한 세포 트래핑 와류 발생에 필요한 주요 흐름 속도로 세정액). </li><li> 30 초 (즉, 셀 - 포착 공정)를위한 전기 천공 챔버에서 트랩 세포에 세포 용액으로 세척 용액으로부터 활성 용액 포트 스위치. </li><li> 용액 스위칭 단계 동안 파쇄 흐름을 보장하기 위해 셀 - 포착 단계 이전에 10 초 동안 동시에 장치를 통해 모두 세탁 셀 솔루션을 흐른다. 참고 :이 간단한 공동 흐름 단계는 각 솔루션 전환 단계를 반복해야합니다. </li><li> 세척 포트 켜고 비 오염 포집 세포를 제거하기 위해 20 초 동안 세척 장치. </li><li> 관심 장치로 (3000 다 중성 및 음이온 덱스 트란 분자 또는 1.5 밀리그램 / 70000 다 중성 덱스 트란 분자 ml의 0.2 ㎎ / ㎖)의 제 분자를 함유하는 용액을 주입한다. </li><li> 즉시 주사 후 5 쇼트 펄스 (Δt를 2 초 간격으로 30 밀리 초 =) 적용분자 용액 및 오실로스코프를 사용하여 실시간으로 적용되는 전기 펄스의 크기 및 지속 기간을 모니터링한다. </li><li> 3.10만큼 추가 분자의 수와 같은 단계를 반복 배달 할 수 있습니다. 각 분자 납기 후 분자 용액에 100 초 동안 세포를 배양한다 (100)의 과잉 물질을 제거하기위한 세척 용액으로 세척 장치. </li><li> 5 이하 PSI 작동 압력을 낮춤으로써 하류 분석 용 96 - 웰 플레이트에서 세포를 릴리스. 참고 : 100 셀 솔루션의 약 100 ㎕의 각 릴리스에서 수집됩니다. </li><li> 실험은 유동 세포 계측법을위한 충분한 세포를 수집하는 3.16 세 시간을 통해 3.9 단계를 실행합니다. </li><li> 228 × g에서 5 분 동안 처리 된 세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 초과 형광 분자를 포함하는 상층 액을 제거합니다. </li><li> 유동 세포 계측법 분석을 위해 DPBS 세포를 재현 탁. </li><li> 분자 U에 대한 흐름 cytometer에 로드셀효율성 분석 ptake. </li></ol>

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처리량 및 다중 분자 전달 효율의 새로운 병렬화 일렉트로 플랫폼, 10 배 향상된 기능을 통해 이전에 개발 된 단일 챔버 시스템이 제공하는 모든 장점에 부가하여 달성되었다. 18 이전 가능한 장점은의 (ⅰ) 전처리 정제를 포함 생존 능력 향상을위한 균일 한 크기 분포, (ⅱ) 정확한 분자량 및 개별 투여 량 조절, 및 (ⅲ) 낮은 동작 전류와 표적 세포. 그들은 분자량, 공액 형광 유형 및 전하의 ...

최근, 세포 분자의 세포 내 전달을 용이하게하는 전기 펄스의 사용은 포유 동물 세포를 조작 매력적인 수단이되었다. 일 또한 일렉트로이라고하는이 과정은, 가역적으로 액세스하는 본래 세포막 투과성 분자를 허용 세포막을 permeabilizes 세포의 세포 적 환경이다. 거의 모든 분자 일렉트로를 이용한 세포의 모든 종류의 막으로 임시 만들어진 기공을 통해 세포질 내로 도입 될 수 있기 때문에, 기술이보고 된 것으로, 더욱 재현성 보편적으로 적용하고, 바이러스 - 매개 화학을 포함하는 다른 방법에 비해보다 효율적 세포 생존은 그대로 유지하면서, 광학 접근법. 2-3이 기술은, 형광 물질을 도입하는 약물 4 5 핵산 6-7을 이용하고있다. 이러한 이점을 감안할 때, 일렉트로는 일반적인 노동으로 채택되었다DNA 형질 atory위한 기술, 생체 내 유전자 치료 8 세포 접종 연구. 성공적인 일렉트로 필요한 전계 강도가 밀접 셀의 직경과 상관하기 때문에 종래의 전기 천공 시스템은 동시에 대형화와 이질 샘플 실용적인 효율 및 생존 가능성을 달성하는 것은 여전히​​ 그러나 어렵다. 더욱이, 이러한 시스템은 다수의 분자 양의 정밀한 제어가 벌크 스토캐스틱 분자 전달 프로세스에 대한 의존도로 인해 전달되는 것을 허용하지 않는다. 9는 이러한 문제를 해결하기 위해, 많은 그룹은, 저급 CORPORATION에서 전압의 이점을 제공하고, 미세 유체 일렉트로 플랫폼 개발 더 형질 감염 효율, 세포 사망의 큰 감소, 및 복합 분자를 제공하는 능력. 10-13 이러한 장점은 그 전극 피치 마이크로 전기 천공 시스템의 작은 풋 프린트에 의해 가능하게되었다길이 극적 성공적인 전달을 위해 필요한 전압을 감소시키는, 서브 밀리미터이다. 더욱이, 이들 마이크로 일렉트로 시스템은 전달 효율을 향상하면서 감소 된 세포 사망을 산출, 생성 된 열을 방출 빠르게 균일 한 전계 분포를 달성 할 수있다. 추가적으로 이러한 마이크로 투명 재료 사용률 프롬프트 파라미터 변경에 대한 전기 천공 과정 시츄 관찰에 있습니다. 2,12을 그러나 정확한 투여 량 제어 및 연구 및 치료 적 응용, 6 신흥 필요한 분자 - 및 세포 - 의존 파라미터 제어를, 14-16는 여전히 해결되지 못한 상태로 남아있다. 이 작업은 순차적으로 표적 세포의 미리 선택된 동일한 집단에 여러 분자를 전달할 수있는 미세 유체 와류를 이용한 전기 천공 시스템을 제공한다. 균일 한 크기 분포를 가진 세포는 이전에보고 된 실리콘을 사용하여 이전에 전기 천공 법 (electroporation)에 격리되어제 &#39;선택적 트래핑 메커니즘. 17-18 균일 한 크기 분포, 적은 편차 일렉트로 효율 및 달성 하였다 주어진 전계 강도 당 강화 가능성을 갖는 바이. 19 또한, 연속 마이크로 와류를 사용하여 포획 세포를 교반을 통해 분자의 균일 한 전달 허용 결과와 일치하여 전체 세포질은, 이전에,이 시스템은 일반적으로 생물학적 인 응용에 이용 분자의 넓은 범위에 적용될 수 있음을 입증하기 위해. 다른 와류 이용한 일렉트로 플랫폼을 사용하여 (20)을보고로 전달 된 분자량 광범위한 고분자 전이성 유방암 세포. 또한, 실시간 프로세스 모니터링의 도움으로,이 작품은 주로 확산 매개. 14 대 전기 매개되고, electrporation 동안 분자 전달의 메커니즘에 관한 오랜 논쟁에 종지부를 찍을 더 많은 증거를 제공 </sup&gt; 다른 전기 천공 시스템과는 달리,이 플랫폼 고유 일렉트로의 정확한 멀티 분자 전달, 고분자 전달 효율, 최소의 세포 사망, 크기 및 전달 분자의 전하의 넓은 범위뿐만 아니라 실시간 시각화 결합 된 장점을 제공한다 과정. 이러한 기능을 감안할 때, 개발 된 일렉트로 시스템은 일렉트로 분자 전달 메커니즘에 대한 깊이있는 이해를 필요로하는 세포 리 프로그래밍 연구, 6,14,21-22 약물 전달 응용 프로그램 10,19 및 애플리케이션을위한 다양한 도구로 실제적인 가능성이있다.

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	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:475px;">MDA-MB-231 cancer cell line</td>
			<td style="width:297px;">American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td style="width:119px;">HTB-26</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Leibovitz&#8217;s L-15 Medium</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">10-045-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:297px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:475px;">Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:297px;">Cellgro, Mediatech, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">21-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Trypsin</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Flow Cytometer easyCyte HT</td>
			<td style="width:297px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">0500-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Oxygen Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:297px;">Technics Micro-RIE</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dektak 6M surface profiler</td>
			<td style="width:297px;">Veeco</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">KMPR 1050</td>
			<td style="width:297px;">Microchem</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td style="width:297px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Compressed Nitrogen gas</td>
			<td style="width:297px;">Airgas</td>
			<td style="width:119px;">NI 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">High Pressure Regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td>6162K22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Downstream regulator</td>
			<td style="width:297px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">4000K563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">high-speed 3/2way-8 valve manifold</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Inline Check Valve</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">CV3320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:475px;">5/32&#34; OD x 3/32&#34;ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td>PU-156F-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/4&#34; OD X 0.17&#34; ID Polyurethan tubes</td>
			<td style="width:297px;">Pneumadyne</td>
			<td style="width:119px;">PU-250PB-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/16&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Festo</td>
			<td style="width:119px;">P1533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">1/32&#34; PEEK tubings</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P1569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">PEEK tubing unions</td>
			<td style="width:297px;">Idex Health and Science</td>
			<td style="width:119px;">P881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Pulse Generator</td>
			<td style="width:297px;">HP</td>
			<td style="width:119px;">8110A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Aluiminum Wire</td>
			<td style="width:297px;">Bob Martin Company</td>
			<td style="width:119px;">6061 ALUM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">oscilloscope</td>
			<td style="width:297px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">DSO3062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">T75 culture flask</td>
			<td style="width:297px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82050-862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 3000 MW, Anionic</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Tetramethylrhodamine, 70,000 MW, Neutral&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D1819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:475px;">Dextran, Texas Red, 3000 MW, Neutral</td>
			<td style="width:297px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">D3329</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microscale vortex-assisted electroporator for sequential molecular delivery

물리적으로 세포에 비 - 투과 외인성 분자 프로브를 도입하기위한 아주 강력한 기술이기 때문에 전기 천공은, 과거 몇 년 동안 증가 주목을 받아왔다. 이 작업은 정밀한 분자 종속 매개 변수 컨트롤과 함께 포유 동물 세포에 여러 분자 전달을 수행 할 수있는 마이크로 유체 일렉트로 플랫폼을보고한다. 균일 한 크기 분포와 세포를 분리하기위한 시스템의 능력은 주어진 전계 강도 당 전기 천공 효율 적은 편차를 허용; 따라서 샘플 생존력을 향상. 또한, 그 공정 시각화 기능 효율 향상을위한 반응계에서 프롬프트 분자 전달 파라미터 조정을 허용 실시간 형광 분자 흡수 과정의 관찰을 허용한다. 보고 된 플랫폼의 광대 한 능력을 보여주기 위해, 서로 다른 크기와 전기 요금과 거대 분자 (예를 들면, 덱스 트란은 3000 및 70000 다의 MW로)했다테스트 된 모든 분자 높은 전달 효율 (&gt; 70 %)로 전이성 유방암 세포로 전달. 개발 플랫폼은 온 - 칩 기술은 일렉트로 유리할 수있다 연구 분야의 확장에 사용 가능성을 증명했다.

개발 병렬 미세 electroporator 전이성 유방암 살아있는 세포로 다양한 크기 및 전하와 거대 분자를 전달. 성공적인 전달 분자는 질적 인 시츄 electroporation하여 선회 세포의 형광 강도의 변화를 모니터링함으로써 결정과 유세포 분석을 통해 정량 측정에 의해 확인되었다. 4A가 처리 된 세포의 90 %가 중성 70000 다 덱스 트란 통풍 관 것을 보여준다. 통계적인 분석을 위해, ?...

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Microscale Vortex-assisted Electroporator for Sequential Molecular Delivery

미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움.

마이크로 소용돌이를 이용한 순차 분자 전달을위한 Electroporator을

Electroporation has received increasing attention in the past years, because it is a very powerful technique for physically introducing non-permeant ...

microscale-vortex-assisted-electroporator-for-sequential-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.4K 조회수.  Harvard University.  미세 유체 와류를 이용한 일렉트로 플랫폼은 정확하고 독립적 인 투여 량 제어와 동일한 세포 집단에 여러 분자의 순차적 전달을 위해 개발되었다. 시스템의 크기에 기초하여 목표 셀 정제 단계 이전 일렉트로 분자 전달 효율 및 처리 된 세포의 생존 능력을 향상시키는 데 도움. 

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Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

연구

생체공학

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

피부는 DNA 백신 배달을위한 새로운 접근 방식으로 문신

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which facilitate the functional assessment of the seeded cells. To that end, microscale cantilever technology offers a platform with which to measure the contractile functionality of a range of cell types, including skeletal, cardiac, and smooth muscle cells, through assessment of contraction induced substrate bending. Application of multiplexed cantilever arrays provides the means to develop moderate to high-throughput protocols for assessing drug efficacy and toxicity, disease phenotype and progression, as well as neuromuscular and other cell-cell interactions. This manuscript provides the details for fabricating reliable cantilever arrays for this purpose, and the methods required to successfully culture cells on these surfaces. Further description is provided on the steps necessary to perform functional analysis of contractile cell types maintained on such arrays using a novel laser and photo-detector system. The representative data provided highlights the precision and reproducible nature of the analysis of contractile function possible using this system, as well as the wide range of studies to which such technology can be applied. Successful widespread adoption of this system could provide investigators with the means to perform rapid, low cost functional studies in vitro, leading to more accurate predictions of tissue performance, disease development and response to novel therapeutic treatment.

Utilization of Microscale Silicon Cantilevers to Assess Cellular Contractile Function In Vitro

This protocol describes the use of microscale silicon cantilevers as pliable culture surfaces for measuring the contractility of muscle cells in vitro. Cellular contraction causes cantilever bending, which can be measured, recorded, and converted into readouts of force, providing a non-invasive and scalable system for measuring contractile function in vitro.

마이크로 실리콘 캔틸레버의 이용은 세포 수축 기능을 평가하기 위해<em&gt; 체외</em

The development of more predictive and biologically relevant in vitro assays is predicated on the advancement of versatile cell culture systems which ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Delivery remains the main challenge for the therapeutic implementation of small interfering RNA (siRNA). This protocol involves the use of a multifunctional and biocompatible siRNA delivery platform, consisting of arginine and polyethylenimine grafted porous silicon microparticles.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Biofunctionalized Prussian Blue Nanoparticles for Multimodal Molecular Imaging Applications

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, complementary imaging techniques. These imaging agents facilitate the real-time assessment of pathways and mechanisms in vivo, which enhance both diagnostic and therapeutic efficacy. This article presents the protocol for the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles (PB NPs) - a novel class of agents for use in multimodal, molecular imaging applications. The imaging modalities incorporated in the nanoparticles, fluorescence imaging and magnetic resonance imaging (MRI), have complementary features. The PB NPs possess a core-shell design where gadolinium and manganese ions incorporated within the interstitial spaces of the PB lattice generate MRI contrast, both in T1 and T2-weighted sequences. The PB NPs are coated with fluorescent avidin using electrostatic self-assembly, which enables fluorescence imaging. The avidin-coated nanoparticles are modified with biotinylated ligands that confer molecular targeting capabilities to the nanoparticles. The stability and toxicity of the nanoparticles are measured, as well as their MRI relaxivities. The multimodal, molecular imaging capabilities of these biofunctionalized PB NPs are then demonstrated by using them for fluorescence imaging and molecular MRI in vitro.

This protocol describes the synthesis of biofunctionalized Prussian blue nanoparticles and their use as multimodal, molecular imaging agents. The nanoparticles have a core-shell design where gadolinium or manganese ions within the nanoparticle core generate MRI contrast. The biofunctional shell contains fluorophores for fluorescence imaging and targeting ligands for molecular targeting.

멀티 모달 분자 이미징 애플리케이션을위한 Biofunctionalized 프 러시안 블루 나노 입자

Multimodal, molecular imaging allows the visualization of biological processes at cellular, subcellular, and molecular-level resolutions using multiple, ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

마이크로 스케일 슐 리렌 기술에 의해 미세 유체 소자 믹싱 비균질성 분석

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Mesenchymal Stromal Cell Culture and Delivery in Autologous Conditions: A Smart Approach for Orthopedic Applications

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on potential biohazard and inflammation risks exerted by xenogeneic nutrients for their culture. Human derivatives or recombinant materials are the first choice candidates to reduce these reactions. Therefore, culture supplements and materials of autologous origin represent the best nutrients and the safest products.
Here, we describe a new protocol for the isolation and culture of bone marrow hMSCs in autologous conditions &#8212;&#160;namely,&#160;patient-derived serum as a supplement for the culture medium and fibrin as a scaffold for hMSC administration. Indeed, hMSC/fibrin clot constructs could be extremely useful for several clinical applications. In particular, we focus on their use in orthopedic surgery, where the fibrin clot derived from the donor&#39;s own blood allowed effective cell delivery and nutrient/waste exchanges. To ensure optimal safety conditions, it is of the utmost importance to avoid the risks of hMSC transformation and tissue overgrowth. For these reasons, the approach described in this paper also indicates a minimally ex vivo hMSC expansion, to reduce cell senescence and morphologic changes, and short-term osteo-differentiation before implantation, to induce osteogenic lineage specification, thus decreasing the risk of subsequent uncontrolled proliferation.

Culturing human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) with autologous serum, reduces the risks of rejection by xenogeneic material and other negative effects. It also allows for the recovery of a subset of mesodermal progenitors, which can deliver fresh hMSCs. Embedding hMSCs in an autologous fibrin clot enables easy handling and effective surgical implantation.

중간 엽 기질자가 조건에서 세포 배양 배송 : 정형 외과 응용 프로그램에 대한 스마트 접근

Human Mesenchymal Stromal Cells (hMSCs) are cultured in vitro with different media. Limits on their use in clinical settings, however, mainly depend on ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

순차적 3D-3D 등록을 이용한 4차원 CT 분석

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...