저자는 그녀의 뛰어난 기술 지원을 인애 볼터을 감사드립니다. VGAT - 금성 형질 전환 쥐 박사에 의해 생성되었다. 박사 A. 미야 와키에서 제공 PCS2-비너스를 사용하여 Y. 야나가와, M. 히라 바 야시와 국립 생리 과학 연구소, 오카자키, 일본 Y. 가와구치.

윤리 정책 : 모든 절차와 동물 유지 관리 기관 지침에 따라 수행되었다, 독일어 동물 복지법, 유럽 이사회 (European Council) 동물의 보호에 관한 지침 609분의 86 / EEC 및 지방 자치 단체 (베를린, T-0215​​ / 11에서 가이드 라인 ) 급성 - 해마 조각의 1 준비 <ol><li> 대뇌 피질의 억제의 interneurons 13의 대부분을 레이블 vGAT 프로모터, 아래의 형광 비너스 / YFP의 단백질을 발현, (17-24일 이전) 형질 전환 쥐를 가져 가라. 쥐의 목을 벨. 신속 carbogenated, semifrozen (95 %, O2 / 5 % CO 2) 자당 기반 인공 뇌척수액 (자당 ACSF, 그림 1A)로 뇌 (&lt;40 초)을 해부하다. </li><li> , 램프 및 515 방출 필터를 LED 고글의 쌍에 장착 nm의 505 비너스 / YFP 형광에 대한 해부 쥐의 뇌를 평가합니다. </li><li> 피질과 cereb의 정면 셋째 제거ellum; 모든 메스, 반구를 구분합니다. 이전 14 설명한 바와 같이, 뇌를 붙 평평한 표면을 제공하기 위해 피질의 등 표면을 제거합니다. </li><li> vibratome에 해마 형성의 횡단면 (300 μm의) 잘라 반구가 semifrozen로 묶어야한다, 자당 ACSF (그림 1B) 14 carbogenated. 주동이 피질, 중뇌 및 뇌간의 추가 영역을 제거합니다. carbogenated 35 ºC에 가온 자당 ACSF를 포함하는 잠긴 유지 챔버에 각각의 조각을 전송합니다. </li><li> 따뜻하게 ACSF를 입력 마지막 조각의 시간에서 30 분 동안 35 ºC에서 복구하기 위해 조각을 둡니다. 신진 대사를 활성화하고 잘라 신경 세포 프로세스의 재 밀봉을 용이하게하기 위해이 작업을 수행합니다. 그런 다음 저장 (그림 1C) 실온에 전송할 수 있습니다. </li></ol> 2 제작 및 녹음 피펫의 충전 <ol><li> 푸(세포 내 라벨링) 0.1 % biocytin를 포함하는 세포 내 솔루션 : 여과 가득 때 2-4 MΩ의 피펫 저항이 달성 될 수 있도록 유리 모세관에서 LL 패치 피펫 (0.2 μm의 주사기 필터, 기공 크기). 그 성분의 저하를 방지하기 위해 얼음에 냉장 세포 내 솔루션을 유지합니다. </li><li> 농도 (; 솔루션 목록을 보려면 E R (의 Cl-) = -61 MV) - 생리 학적 관련성이 낮은 염소를 포함하는 용액과 시냅스 후 전류의 식별을 위해 패치 피펫을 채 웁니다. </li><li> 농도 (E R (의 Cl-) = - 쌍 녹음 시냅스 수용체 매개 반응을 확인하기 위해, 저 칼슘 버퍼 시냅스 송신기 릴리스와의 간섭을 방지하기 위해 용량뿐만 아니라 4 배 높은 염소를 같은과 세포 내 용액으로 패치 피펫을 채울 -20 MV)는 신호대 약리 RESP의 정확한 평가를 가능 관측 IPSCs 5 점을 개선하기 위해onsiveness. 농도 IPSC 동역학 (15)을 변경할 수 있습니다 - 염소를 변경하는 것이 있습니다. </li></ol> FS-INS에서 3 전 세포 패치 클램프 녹음 <ol><li> ACSF을 Carbogenate하고 (또한 흡입 라인,도 2a를 통해 기록 챔버로부터 제거 ACSF) 연동 펌프를 이용하여, 상기 기록 챔버로 관류 시스템을 통해 피드. 기록에 대비하여 설정에 대한 모든 장비의 전원을 켭니다. </li><li> 기록 챔버에 슬라이스를 전송하고 실크의 단일 섬유와 중독 백금 반지와 장소에서 개최합니다. CA1의 지층 (STR). pyramidale 모두 STR 2 피펫으로 액세스 할 수 있도록 시야를 통해 수직으로 실행되도록 슬라이스를 배치합니다. radiatum 및 STR. oriens 동시에 (그림 2C 및 4A). </li><li> (32 ~ 34 ° C) 기록을 설정으로 챔버를 놓고 carbogenated의 관류를 시작하고 따뜻하게50-10 ㎖ / 분의 유속으로 CSF. </li><li> 40X 대물 배율 IR-DIC 광학 아래 슬라이스 품질을 평가하고, 디스플레이 상에 보여 CCD 카메라로 시각화. 라운드 적당히 대조 CA1 피라미드 세포 (CA1의 PC)의 다수 STR에서 알 수 있으면 좋은 슬라이스 품질을 가정한다. 부드럽고 가볍게 크레이터 표면 (그림 2C) 아래 20 ~ 30 μm의 깊이에서 pyramidale. 품질이 낮은 조각은 고르지 슬라이스 표면과 매우 대조, 수축 또는 팽창 세포의 큰 숫자를 포함합니다. </li><li> 또는 STR 근처 큰 다극 세포체와 비너스 / YFP (그림 2B)를 표현하는 것과 같은 표면 형광 조명 아래 추정 FS의의 interneurons을 확인합니다. pyramidale. 합리적으로 깊은 순서대로 조각 (50 ~ 100 μm의 그림 2C) 내에서 셀을 선택 더 나은 자신의 형태 무결성을 유지합니다. </li><li> headstage에 피펫 홀더에 기록 전극을 장착; 다음 응용 프로그램LY 튜브 라인을 통해, 낮은 정압 (20 ~ 30 밀리바). 조각의 표면에 피펫을 내리고, 약간 선택된 뉴런의 중심 오프셋. </li><li> 이전에 (14, 16)을 설명하고 또한 2D 및 2E 피규어 참조로 전체 셀 녹음 구성을 얻습니다 <ol><li> 셀을 대상 : 70 ~ 80 밀리바에 압력을 높이 빠르게 단지 선택된 셀 (그림 2 차원, 3 위)의 소마 위 슬라이스를 통해 피펫을 낮 춥니 다. </li><li> 셀을 접근 : (위, 그림 2D) 그것에 &quot;딤플&quot;를 생산하는 세포막에 피펫을 누릅니다. 이웃하는 셀들의 biocytin 라벨링을 방지하기 위하여,이 단계를 신속하게 수행한다. </li><li> 기가 옴 씰을 만들기 : 피펫에 20mV의 전압 명령을 적용 동시에 압력을 해제합니다. 기가 옴 씰 (1-50 GΩ, 그림 2D, 아래쪽 및 그림 2E 가운데) typic동맹은 신속하게 개발하고 있습니다. 일단 전압 지령으로 전위 예상 쉬고 막 (전형적으로 -70과 -60 MV)를 적용, 밀봉. </li><li> 패치 돌파 : 밀봉 일단 부압의 짧은 펄스와 멤브레인 패치 파열; 따라서 전체 셀 구성 (도 2E, 아래) 달성. </li></ol></li><li> 전체 - 세포의 커패시턴스 및 직렬 저항 (R의 S)를 보상. R의 120 분까지 정상적으로 5 ~ 20 MΩ하고 안정적이다. 돌파구에 막 전위 (V M)가 -50 MV보다 비극성 화되면 세포를 포기; R S는 30 MΩ보다 초기에 큰; 기록에 걸쳐 20 % 이상 또는 R S 변화. </li><li> (250 pA의 그림 2 층 맨 -250)에 전류 펄스를 탈분극하는 하이퍼의 가족 (전류 클램프 모드에서) 자신의 반응에 의해 FS 기능을 확인합니다. FS 기능은 상대적으로 V M을 (일반적으로 -50 t 분극이있다오 -60 MV), 짧은 막 시정 (&lt;20 밀리 초) 및 주파수에서 활동 전위의 기차 (APS)와 전류 주입을 탈분극 500 pA의 응답&gt; 100 Hz에서 11 (그림 2 층 바닥), 현저하게되는 CA1의 PC (그림 2 층 중앙)에서와는 다른. </li></ol> (4) 세포 외 전기 자극 GABA B R 매개 응답을 연상 <ol><li> STR의 경계에 슬라이스에서 :; 시냅스 유발 반응을 관찰하기 위해 세포 외 자극 전극 (0.1 ~ 0.3 MΩ 저항이 M NaCl로 가득 패치 피펫)을 배치합니다. radiatum 및 STR. lacunosum-moleculare은. 자극 아티팩트 (그림 3A)을 세포에 직접 전기 자극을 방지하고 최소화하기 위해 소마에 전극 200 ~ 300 μm의 측면을 배치합니다. </li><li> 자극 전극을 배치하면, 전체의 셀의 기록을 구하는선택한 셀은 3.9 절 (그림 3B)에서와 같이 전류 클램프 모드에서 생리 학적 표현형을 평가합니다. </li><li> 전압 클램프 (V의 M -65 MV)에 기록 된 신경 세포와 함께,에서 시냅스 축삭의 전기 자극을 제공하는 50 V (~ 500 μA 효과적인 자극) 절연 정전압 자극기를 사용하여 20 초마다. 하나의 자극을 사용하여 (100 마이크로 초 기간, 그림 3C, 상단)은 GABA B 형 R 매개 IPSCs을 관찰하고, 큰 송신기 릴리스를 생산하는 (200 Hz에서) 여러 자극의 기차와 인터리브. </li><li> 고립 monosynaptic IPSC (중앙 상단 그림 3C)를 공개 :; 목욕은 이온 성 글루타메이트 수용체 길항제 (D-AP5 [50 μM] NMDA 수용체 DNQX [10 μM] AMPA 수용체)을 적용한다. 또한 GABA R 차단제의 응용 프로그램과 함께 GABA B R 매개 IPSC를 분리 (gabazine [10 μM] 그림 3C 중간 리터된 ower). </li><li> GABA B 이후의 응용 프로그램 CGP-55845 [5 μM] (그림 3C 낮은 회색이 밑에)에 의해 R이 매개되는 등의 결과 천천히 바깥쪽으로 전류 (확장 그림 3C 낮은를) 확인 </li></ol> FS-IN 및 CA1 PC를 결합 시냅스의 5 페어 녹음 <ol><li> 아래에 설명 된대로 시냅스 결합 IN과 PC 쌍 사이에 수행 동시 녹음과 억제 성 시냅스 전달의 GABA B R 매개 시냅스 컨트롤을 평가합니다. </li><li> 먼저, (섹션 3에서와 같이) 시냅스 interneuron의 전 세포 기록을 설정하고 FS 표현형 (도 4a)를 확인한다. </li><li> 그런 다음 이웃 CA1 PC (20 ~ 100 μm의 거리, 그림 4A)를 패치와 AP를 유도하기 위해 (전류 클램프 모드에서 개최) 시냅스 IN에 전류 펄스 (1 밀리 초 기간, 1-5 nA의 진폭을) 탈분극 간단한 초과 임계를 적용합니다. 시냅스의 공동 경우nnection은 전압 클램프에서 개최 된 CA1 PC에서 IPSCs에서 IN 결과에서 AP를 (약 80 % R의 S 보상) 존재한다. </li><li> 필요한 경우 연결이 발견 될 때까지, 상기 컴퓨터 &amp; CA1로부터 새로운 기록 전극과 기록을 채운다. </li><li> 연결이 설정되면, 단일 시냅스 응답과 동적 거동을 모두 평가하기 위해 시냅스 FS-IN에서의 AP 쌍을 유도. 50 밀리 초 간격 (그림 4B)와 2 바꿀만한 자극의 전형적인 쌍 펄스 프로토콜을 사용합니다. </li><li> 기준 조건에서 제어 흔적을 수집합니다. 그런 다음, 따라서 완전히 수용체 매개 효과를 차단하려면 길항제 CGP-55845 (5 μM) 다음 GABA B의 R을, 활성화, 관류 ACSF에 선택적 GABA의 B R 작용제 바클로 펜 (10 μM)을 적용한다. 각 약물의 조건 (그림 (b) 및 C)의 정상 상태시 ~ 50 트레이스를 수집합니다. </li><li> 기록이 완료되면, 찍으 형성함으로써 신체 멤브레인을 밀봉전자 아웃 패치 : 천천히 V-클램프에 세포체에서 피펫을 철회하고 R의 S가 증가함에 따라, MV -40 V의 M을 줄일 수 있습니다. 외부 아웃 패치의 형성을 촉진하기 위해이 작업을 수행; 다음 화장실에서 피펫을 제거합니다. </li></ol> 전기 생리 특성의 6 분석 <ol><li> 참고 : 다른 소프트웨어 패키지의 무리가 전기 생리 데이터의 취득에 사용할 수 있습니다. 여기서, WinWCP는 자유 스트래스 전기 생리학 소프트웨어 패키지에서 윈도우 프로그램은 최대 16 개의 아날로그 입력 채널에 기록 된 디지털 신호 (10)의 출력을 허용하는 데 사용된다. </li><li> 로우 패스 필터 20 kHz에서 모든 5-10 kHz에서 데이터 및 샘플. </li><li> 오프라인 분석 제품군을 생리 학적 데이터를 분석 할 수 있습니다. 참고 : Stimfit,이 경우에 사용되는 파이썬 쉘을 포함하는 오픈 소스 소프트웨어 패키지; 그러나, 다른 대안을 용이 대신 사용될 수있다. <ol><li> 수동 막 페이지 분석기록 뉴런의 roperties, 막 전위를 휴식에서, 현재의 클램프에 인수했다. </li><li> 기록의 시작에서 기록 된 반응의 기준선 평균 쉬고 막 전위를 측정한다. </li><li> 작은 과분극 전류 펄스 (≤ -50 PA)에 전압 응답에서, 옴의 법칙을 사용하여 입력 저항을 계산합니다. 잡음 비율, 평균 경로가 여러 개에 신호를 향상시킬 수 있습니다. 참고 : 우리의 예는 일반적으로 10 ~ 50 개인 스윕의 평균입니다. </li></ol></li><li> 과분극 작은 전류 펄스에 응답하여 감쇠 곡선을 단지 수 피팅에 의해 일정한 겉보기 막 시간을 추정한다. </li><li> 임계 값, 진폭 (임계 피크) 및 기간 (반 높이에서 측정 폭) 전류 펄스를 탈분극 임계 수준에 의해 유발을 결정하는 활동 전위 파형을 분석 할 수 있습니다. </li><li> GABA B R에게 전압 클램프 녹음에서 매개 IPSCs을 분석합니다. 필터에서 오프라인을 추적500 Hz에서 (가우시안 필터) 및 (적어도 10 트레이스의 평균)의 GABA B의 R 매개 반응의 피크 진폭과 지연 시간을 평가한다. </li><li> 피크와 앞의베이스 라인 사이에서 측정 GABA R-매개 IPSCs의 피크 진폭의 변화와 같은 기능의 억제 출력에 GABA B의 루피의 효과를 감지합니다. 제어주기 및 모든 약물 시대의 정상 상태에 대한 ≥50 흔적에서 평균 진폭을 계산합니다. </li></ol> 7 시각화 및 면역 세포 화학 FS-기능 <ol><li> 녹화 후, 4 ℃에서 0.1 M 인산염 완충액 (PB, 산도 = 7.35) O / N로 4 % 파라 포름 알데히드에 담가 조각을 수정. </li><li> 필요한 조각을 처리하기 전에 최대 1 ~까지 일주일 동안 PB로 전송 및 저장 할 수 있습니다. </li><li> 자유롭게 신선한 PB 및 이후 0.9 %의 NaCl 0.025 M PB 씻으 조각 (PBS, pH가 7.35). </li><li> FO 조각을 차단, 비특이적 결합 항체를 줄이기 위해10 % 정상 염소 혈청 (NGS), 0.3 % 트리톤-X100 PBS에서 만든 NaN이 3, 및 0.05 % (막 Permeabilize 하시려면하는 세정제)를 함유하는 용액에 RT에서 R 1 시간. </li><li> PBS에 NaN이 세 5 % NGS, 0.3 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 용액에 희석 방지 PV 단일 클론 마우스 항체를 사용, 태양 광 표현에 레이블을 지정하려면. 4 ° C (12) 2-3 일 동안 일차 항체를 품어. 철저하게 PBS에서 조각을 씻어. </li><li> 형광 항 마우스 이차 항체를 적용 (예 : Alexafluor-546.) 바이오틴 결합 단백질 스트렙 타비 딘과 함께, 형광 색소에 결합 (예를 들어, Alexafluor-647); 및 PBS에 희석 NaN의 3 3 % NGS, 0.1 % 트리톤 - X100, 0.05 %를 함유 한 용액에서 배양하고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 대충 2-3 PB에 린스가 PBS에 따라 2 ~ 3 배 조각을 씻어. 유리 슬라이드에 슬라이스를 마운트합니다. 붕괴 슬라이스를 방지하기 위해 300 μm의 한천 스페이서를 사용합니다. fluores와 커버 슬립 조각네일 바니쉬 %를 장착 매체와 인감. </li></ol> 8 이미징 및 시각화의 재건 FS-기능 <ol><li> 적절한 레이저 라인 (다이오드 레이저 Alexafluor-647에 대한 635 nm의 흥분 fluorochome 기자와 함께, 주사 공 초점 현미경을 사용하여 조각을 시각화, 금성 Alexafluor-546 PV에 대한 표시와 아르곤 488 또는 515 nm의 헬륨 - 네온 543 nm의 / YFP). </li><li> 전체 셀의 Z-스택을 생산하는 (20X 목표를 사용하여, 일반적으로 0.5 μm의 단계) 적절한 Z-해상도에서 이미지를 가져 가라. 다중 스택은 일반적으로 이미지에 디지털 피지 / ImageJ에 소프트웨어 (그림 5A)를 사용하여 오프라인 스티치 할 수있는 전체 셀을해야합니다. </li><li> 반자동 추적 방법을 사용하여 스티치 이미지 스택에서 셀을 재구성 (피지 / ImageJ에 소프트웨어 패키지 17 단순 돌기의 추적기 플러그인을 그림 C). </li><li> 마지막으로, I의 PV-면역 반응성을 평가높은 개구 수 대물 렌즈 nterneuron (60X 규소 침지, NA = 1.3). PV의 체세포 세척이 너무 강한 경우 소마의 이미지, 근위 수상 돌기 근위 축삭, 또는 대안 축삭 터미널을 확인합니다. 면역 라벨이 biocytin 표지 구조 (그림 5B)에 부합하는 것으로하면 세포는 태양 광 발전에 대한 면역 간주됩니다. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+enhancement+shown+by+whole-cell+recordings+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices.">Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices.</a> Nature. 346, 177-180 (1990).</li><li>Vida, I., Bartos, M., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shunting+inhibition+improves+robustness+of+gamma+oscillations+in+hippocampal+interneuron+networks+by+homogenizing+firing+rates.">Shunting inhibition improves robustness of gamma oscillations in hippocampal interneuron networks by homogenizing firing rates.</a> Neuron. 49 (1), 107-117 (2006).</li><li>Neu, A., F&#246;ldy, C., Soltesz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+origin+of+CB1-dependent+tonic+inhibition+of+GABA+release+at+cholecystokinin-positive+basket+cell+to+pyramidal+cell+synapses+in+the+CA1+region+of+the+rat+hippocampus.">Postsynaptic origin of CB1-dependent tonic inhibition of GABA release at cholecystokinin-positive basket cell to pyramidal cell synapses in the CA1 region of the rat hippocampus.</a> Journal of Physiology. 578 (1), 233-247 (2007).</li><li>Baude, A., Bleasdale, C., Dalezios, Y., Somogyi, P., Klausberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoreactivity+for+the+GABAA+receptor+alpha1+subunit,+somatostatin+and+Connexin36+distinguishes+axoaxonic,+basket,+and+bistratified+interneurons+of+the+rat+hippocampus.">Immunoreactivity for the GABAA receptor alpha1 subunit, somatostatin and Connexin36 distinguishes axoaxonic, basket, and bistratified interneurons of the rat hippocampus.</a> Cerebral Cortex. 17, 2094-2107 (2007).</li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

우리는 기능적으로 시험 관내 및 morphologically- neurochemically 식별 된 신경 세포의 특성을 전기 생리 학적 및 해부학 적 기법을 결합하는 방법을 설명; 특히 대뇌 피질의 억제 기능의 다양한 종류. 절차의 주요 측면은 다음과 같습니다 잠재적 인 (1) 사전 선택; (2) 세포와 뉴런 기록 시각화; 그리고 마지막으로 (3) 기록 기능의 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석. 이러한 연구는 특히 PV 인을 해결 하였?...

해마 신경 회로 긴 인해 인간 및 설치류 모두에서 학습 및 기억에 중요한 역할뿐만 아니라 공간적 내비게이션으로 해부학 및 생리학, 모두에 대하여, 강한 조사의 대상이되어왔다. 마찬가지로, 해마의 눈에 띄는하지만, 간단한 층류 조직이 지역 대뇌 피질 네트워크의 구조 및 기능적 특성을 다루는 연구가 선호 될 수 있습니다. 해마 회로는 흥분성 주요 세포 (&gt; 80 %)와 작은 (10 ~ 20 %) 만 억제의 interneurons 1-3의 매우 다양한 집단으로 구성되어있다. 의 interneurons 빠른 이온 성 GABA 수용체에 역할을 자신의 축삭 터미널에서 γ-아미노 낙산 (GABA) (GABA 루피) 느린 대사 GABA의 B 수용체 (GABA B의 R을) 발표 4. 이러한 억제 자극 메커니즘을 상쇄하고 주체 세포의 흥분성을 조절하고, 따라서적외선 타이밍과 방전의 패턴입니다. 그러나,의 interneurons에서 방출 GABA는 주요 세포뿐만 아니라, 자신의 interneurons 5,6에뿐만 아니라 역할을합니다. 사전 및 시냅스 후 수용체는 interneuron의 여러 유형 중 피드백 규제와 억제 상호 작용을 중재. interneuron 네트워크에서 선택된 억제 메커니즘은 다른 주파수 7에 특히 진동의 발생 및 인구 활동 패턴의 형성에 중심이 될 것으로 믿어진다. 전체 세포 패치 - 클램프 녹음은 고유 특성과 신경 세포의 시냅스 상호 작용의 시험에 대한 잘 확립 된 방법이다. 그러나, interneuron 유형의 높은 다양성으로 인해, 억제의 interneurons의 조사가 기록 된 세포의 엄격한 확인이 필요합니다. 해마 interneuron 유형은 별개의 형태 학적 특징 및 신경 화학적 마커의 발현, 결합 해부학 적 및 면역 조직 화학적 전자에 의해 특징으로xamination 정확한 interneuron 6,8,9 아이덴티티를 결정하는 수단을 제공 할 수있다. 본 논문에서는 느린 GABA B의 특성을 허용 단일 신경 세포 나 시냅스 결합 쌍에서 전체 세포 패치 - 클램프 녹음이 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 한 후, 세포 내 라벨과 결합 된 실험적인 접근 방식을 설명 수용체가 확인의 interneurons의 억제 효과를 중재. 예로서, 우리는 시냅스 대상 소마 근위 수지상 innervates 및 &quot;빠른 스파이크&quot;(FS)에 의해 특징된다 interneuron의 하나의 주요 유형, 소위 &quot;바구니 세포&quot;(BC)의 서브 세트, 초점 칼슘 결합 단백질 parvalbumin (PV) 10, 11의 패턴 밀도가 세포체 층을 포함 축삭, 표현을 방전 시키십시오. 이들의 interneurons 큰 시냅스 억제 전류뿐만 아니라, 눈에 띄는 사전을 표시GABA B R 활성화 (12)에 응답하여 자신의 시냅스 출력의 시냅스 변조. 여기에 설명 된 기술들의 조합이 다른 식별 된 신경 세포 유형의 다양한 극한 또는 시냅스 메카니즘을 조사하기 위해 동일하게 잘 적용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

GABA 성 억제의 interneurons은 뇌의 신경 회로 내에서 중심 역할을한다. 의 interneurons는 신경 세포의 인구 (10 ~ 20 %)의 작은 부분 집합을 포함하지만, 자신의 다양한 기능을 반영, 생리 학적 및 신경 화학적 이질성의 높은 수준을 보여줍니다. 따라서,의 interneurons의 조사가 중요한 조직 원리에 대한 통찰력과 신경 회로의 기능을 제공합니다. 그러나, 이것은 개별 interneuron 종류의 선택 및 식별을위한 통합 및 해부학 적 생리 학적 접근을 요구한다. interneuron 특정 마커의 발기인에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 동물의 급성 뇌 조각에서 기록 전체 세포 패치 클램프, 대상 및 electrophysiologically 특정 interneuron 유형의 고유 및 시냅스 속성을 특성화 할 수있는 효율적인 방법을 제공한다. 세포 내 색소 표지와 결합이 방법은 사후 MO로 확장 될 수있다rphological 및 면역 조직 화학적 분석, 기록 된 신경 세포의 체계적인 식별을 가능하게한다. 이러한 방법은 피질 뉴런의 다양한 유형의 기능성에 관한 과학적인 문제의 넓은 범위에 맞게 맞춤화 될 수있다.

제공되는 슬라이스 품질이 모두 CA1 PC와 FS 인 최소한의 어려움을 달성 할 수에서 기록, 상당히 좋은 것입니다. vGAT 발기인 13에서 비너스 / YFP을 표현 형질 전환 쥐 라인은 명백하게 FS-INS, 또는 실제로 수익 증권을 식별하지 않습니다. 그러나 및 STR 주변 기능에서 녹음. pyramidale, FS 인의 농도는 일반적으로 높은 일이고, FS 기능 (도 2B)를 선택할 확률이 높은 ?...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다.

Morphologically- 및 Neurochemically 확인 된 해마의 interneurons에서 전체 세포 패치 클램프 녹음

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K 조회수.  Charité Universitätmedizin.  대뇌 피질의 네트워크는 억제의 interneurons의 작지만 다양한 설정에 의해 제어된다. 의 interneurons의 기능 조사 그러므로 표적으로 기록하고 엄격한 확인이 필요합니다. 세포 내 라벨, 사후 형태 학적 및 면역 조직 화학적 분석 신경 세포의 단일 또는 시냅스 결합 쌍에서 전체 셀 녹음을 포함하는 통합 접근 방식은 여기에 설명한다. 

비디오: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

모터 신경 세포의 이점 패치 클램프 레코딩과 Zebrafish의 대상 골격근

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

적외선 신경 자극의 메커니즘을 조사하는 전체 세포 패치 클램프

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

배아 Zebrafish의 MAUTHNER 세포에서 패치 클램프 녹음

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

흑색질 도파민 뉴런의 Somatodendritic 도메인에서 세포 내 패치 클램프 녹음

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Channelrhodopsins에서 이온 선택성의 전기 생리 학적 결정을위한 전체 셀 패치 - 클램프 기록

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

청각 Brainstem 응답 및 출생 후 쥐에 외부 머리 세포 전체 셀 패치 클램프 기록

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...