우리는 토론 마티아스 S. 딕, 롤랜드 F. DREIER과 세바스찬 RUHL을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 SNSF 교수 PP00P3_139120 / 1 PB에 대학 바젤의 프로젝트 보​​조금 ID2153162에 의해 지원되었다

살모넬라 균을 mCherry가 발현 1. 디기 토닌 분석 (분석 FACS 기반) <ol><li> 준비 박테리아 주 : 플라스미드 (PFPV가 rpsM 프로모터하에 mCherry을 코딩)에서 mCherry 발현 살모넬라 야생형 SL1344은 (스트렙토 마이신 내성)이 분석에 사용된다. mCherry의 구성 적 발현에 의해 변경되지 세균 증식 식세포 16 (데이터는 보이지 않음). <ol><li> 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 μg의 / ㎖) 및 암피실린 (100 ㎍ / ml의 mCherry 발현 벡터)와 보충 LB 배지 3 ㎖에 감염되기 전에 변형 일일 접종. </li></ol></li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 24 웰 플레이트에 시드 야생형 BMDMs / 웰 주 식세포 배지 1 ㎖에가 (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS, 열 - 불 활성화 된 56 ° C, 30 분간으로 보충 ), 1 % HEPES, 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L 글루타민, 10 % L929 상등액 (대 식세포 콜로니 자극 인자 (M-CSF로부터의 조정 배지) L929 세포를 제조). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. 컨트롤 (표 1)로 사용 된 우물로 된 커버를 추가합니다. </li><li> 37 ℃ 배양기에서 밤새 인큐베이션하고 세포를 5 % CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> 투과성으로 </td><td colspan="3"> 염색 </td></tr><tr><td></td><td> 유리 커버 슬립 </td><td> 살모넬라 </td><td> 디기 토닌 </td><td> 사포닌 </td><td> 안티 살모넬라 </td><td> 안티 Calnexin </td><td> 안티 PDI </td></tr><tr><td> A1 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (샘플) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (NO 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (완전 투과성으로 제어) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (calnexin에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (스테인드) PDI에 대한 </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (PDI에 대한 염색) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 표 1 : 살모넬라, 투과성으로하고, 염색과 이후의 감염 24 웰 형식의 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)에 대한 도금 방식 * 프로토콜 1 프로토콜이 완료되어 있는지 여부에 따라 다릅니다.. <ol start="3"><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 하룻밤 문화에 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 리터로 측정되는 것을 보장분광 광도계의 inear 범위. </li><li> ml의 당 살모넬라 균의 농도를 계산한다. 하나의 OD600은 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <ol><li> BMDMs에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물 (B1-B3, C1-C3)에 대 식세포 매체의 1 ML을 추가합니다. 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신과 세포 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 0.1 ㎎ / ㎖ 젠타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml에 추가세포 외 박테리아를 죽일. 모든 셀들이 동일한 방식으로 처리되도록, 짝수 비감염 컨트롤에, 모든 웰에 추가 젠타 마이신. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 모든 우물 일반 DMEM의 1 ml의 2 배 세척 (미리 예열 37 ° C까지)와 대 식세포 매체로 교체 10 ㎍ / ml에 포함 (37 ° C로 미리 예열) &#160; 겐타 마이신은 남아있는 세포 외 박테리아의 성장을 방지합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 작업 농도 버퍼 주식을 필터와 KHM에 희석50 μg의 디기 토닌 / ㎖의. 또한, 버퍼 KHM, KHM에서 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 1/500, 안티 calnexin에 FITC (CSA-1-FITC)에 커플 항 살모넬라 항체 0.1 % 사포닌 용액을 조제 버퍼는 3 % BSA로 보충. </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. A3 우물의 A5과 B3에 사포닌과 B2 / C2 또는 KHM 버퍼 / C3 (표 1에 따라) - KHM 버퍼를 제거하고 웰스 (A1)에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼에 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가합니다. 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> 적절한 우물에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 -FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖) KHM 버퍼를 제거하고 추가 (그림 1 </st룽&gt; 표 1). 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. </li><li> 1 mL의 PBS로 1X 세포를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 감염된 세포 (웰스 A1 - A5) : FACS 분석 <ol><li> 워시 세포는 PBS로 3 배 및 0.1 % 트리톤을 포함하는 얼음처럼 차가운 PBS 0.5 mL를 넣어. 세포 집합체를 헤어 셀 스트레이너 캡 5 ㎖ 외과 튜브에 전송합니다. 얼음에 샘플을 유지합니다. </li><li> 외과의 샘플을 분석 할 수 있습니다. 완전히 투과성이 컨트롤을 사용하여, 총 순방향 기반 박테리아 제 및 측면 산란 (FSC / SSC)를위한 게이트를 설정하고 mCherry 신호 (610 ± 20 nm의 나노 필터). </li><li> 다음, 세포질 박테리아 게이트 (FITC + mCherry +)와 액포 박테리아 (FITC-, mCherry +) (그림 3)을 설정하기 위해 충분히 투과성이 아닌 투과성이 컨트롤을 사용하여 총 세균 집단의 FITC 신호를 분석 할 수 있습니다. </li><li> 게이트 설정으로, 시료를 분석 및 대 세포질의 비율을 결정제조사의 프로토콜에 따라 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 액포 박테리아. </li></ol></li><li> 감염되지 않은 투과성으로 컨트롤 (우물 B1 - B3, C1 - C3) : 현미경 <ol><li> 정착 <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 이차 항체 염색. <ol><li> PBS에 적합한 형광 물질에 결합 이차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 얼룩 투과성으로 컨트롤 사포닌 0.1 % 3 % BSA 완전히 Permeabilize 하시려면 세포로 보충. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 공 초점 FLUO을 사용하여 40X 또는 63X 배율에서 컨트롤 된 커버 분석rescence 현미경. 투과성으로 일한 경우, digitonin- 사포닌 투과성이 세포와 PDI는 사포닌 투과성이 세포 (그림 4) 만 염색 모두에 대한 비 투과성이 세포 염색, Calnexin 염색이 없어야합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 레이블이없는 살모넬라 (현미경 기반 분석) 2. 디기 토닌 분석 <ol><li> O / N 문화에 대한 박테리아를 준비합니다. <ol><li> 레이블이없는 살모넬라 야생형 SL1344 접종 (스트렙토 마이신 내성) 37 ° CO / N에서 통에 스트렙토 마이신 (90 ㎕ / ml)이 첨가 된 LB 배지 3 ㎖에 감염 1 일 전. </li><li> 감염 세포를 도금. <ol><li> 1.25 × 105 세포의 밀도로 멸균 된 유리 커버 슬립을 함유하는 24 웰 플레이트에 시드 BMDMs / 웰 식세포 배지 1 ㎖ (DMEM은 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS와 디 보완, ​​56 ° C를 보충에,30 분), 1 % HEPES, 1 % L 비 필수 아미노산 (NEAA), 1 % L- 글루타민 및 10 % 상등액 L929). 표 1에 따른 종자 우물은 개별 조건을 설명합니다. </li><li> 37 ℃ 세포 배양기에서 O / N을 부화 및 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 감염 박테리아를 준비. <ol><li> 다음날, PBS에 문화 1:10 희석 PBS 만 제어에 대한 외경 (600)를 측정하여 O / N 문화에서 살모넬라 균의 농도를 결정한다. 이것은 OD 600 분광 광도계의 선형 범위에서 측정되는 것을 보장한다. </li><li> 밀리리터 당 살모넬라 균의 농도를 결정합니다. (1)의 OD (600)는 1 × 109 박테리아에 대응한다. </li><li> 1.25 × 106 세포 / ㎖의 살모넬라의 농도에 도달 할 식세포 배지에서 세균을 희석. </li></ol></li><li> 살모넬라 균과 세포의 감염. <oL&gt; <li> 모든 우물에서 매체를 제거합니다. 감염되지 않은 제어 우물에 일반 식세포 매체의 1 ML을 추가 (B1 - B3, C1 - C3). 웰스 A1에 살모넬라 균 현탁액 1 ML을 추가 - A5는 셀 당 10 세균의 감염 (MOI)의 다양성에 도달 할 수 있습니다. </li><li> 감염을 동기화하기 위해 37 ° C에서 300 XG에 15 분 동안 플레이트를 원심 분리기. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 겐타 마이신 외 살모넬라 균을 죽이는. <ol><li> 1 시간 후 감염에, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 모든 우물에 세포 외 박테리아를 죽일 1 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신을 포함하는 대 식세포 매체의 0.1 ml를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세포를 세척. <ol><li> 2 시간 게시물 감염에서 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 10 μg의 / ㎖를 포함하는 신선한 식세포 매체의 1 ml의 각 웰 배를 씻어 방지하기 위해 겐타 마이신남아있는 세포 외 박테리아의 성장. 37 ℃ 배양기에서 플레이트를 이동시켜, 5 % CO 2. </li></ol></li><li> 세제 및 항체와 신선한 버퍼를 준비. <ol><li> 다만 분석 원하는 시점 전에 1 밀리그램 / KHM 완충액 ㎖ (110 mM의 아세트산 칼륨, 20 mM의 HEPES, 2 mM의의 MgCl 2, 7.3의 pH)에서의 디기 토닌 신선한 스톡 용액을 제조 하였다. 주식 필터 및 50 μg의 / ㎖의 작업 농도 KHM 버퍼에 희석 디기 토닌의. </li><li> 또한, KHM 완충액 0.1 % 사포닌 용액을 준비 살모넬라 항 -FITC (CSA-1는 0.1㎍ / ㎖) KHM 완충액 1/100에서 1/100 또는 항 PDI에서 안티 calnexin이 보충 된 3 % BSA (항체 농도 재료 표 참조). </li></ol></li><li> 세포 투과성으로. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거하고 세척 우물은 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 (37 ° C로 미리 예열) 배. KHM 버퍼를 제거하고 0.25 ㎖의 일반 KHM 버퍼를 추가웰스 A1에 디기 토닌과 우물 A4와 B1 / C1, KHM 버퍼 - A3 및 B2 / 사포닌과 C2 또는 KHM 버퍼 웰스 A5과 B3에 / C3 (표 1 항). 모든 우물이 KHM 버퍼의 0.5 ㎖로 3 배 씻어 즉시 실온에서 정확히 1 분 동안 품어 (37 ° C로 미리 예열). </li></ol></li><li> 차 항체 염색. <ol><li> KHM 버퍼를 제거하고 적절한 우물 (그림 2, 표 1)에 차 항체 솔루션 (염소 항 살모넬라 CSA1-FITC, 250 μL / 웰, 0.1 μg의 / ㎖)를 추가합니다. 37 ℃ 배양기에서 15 분 동안 플레이트를 인큐베이션, 5 % CO 2. 1 ml의 PBS로 세척 배. </li></ol></li><li> 고정. <ol><li> PBS를 제거하고 PBS에 PFA 4 %의 250 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 우물은 1 ml의 PBS로 2 배 세척 및 정착을 해소하기 위해 10 분 동안 PBS 0.1 M 글리신의 250 μl를 추가합니다. 워시 웰 PBS 1 ㎖로 2 배. </li></ol></li><li> 합계감염된 샘플의 살모넬라 균 염색. <ol><li> 물로 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 함께 PBS와 배를 커버 슬립 및 안티 CSA1 항체 샘플 배양을 1 시간 동안 (염소 항 CSA1는 0.1 ㎍ / ml의 마우스 항 - LPS는 0.1 μg의 / ㎖으로 잘 작동) 사포닌 0.1 % / 3 % BSA와 함께 PBS에서 RT에서. </li><li> 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 세척 배. 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 0.1 % 사포닌 / 3 % BSA와 PBS에 선택의 형광에 결합 된 보조 항 염소 항체로 샘플을 품어. </li><li> 워시는 1 ml의 PBS로 3 배를 커버 슬립과 DAPI (1.5 μg의 / ml)로 매체를 장착에서 분석 된 커버를 탑재합니다. </li></ol></li><li> 현미경 분석. <ol><li> 세포질 살모넬라 (양의 항 살모넬라 -FITC) 총 살모넬라 (더블 플러스) (그림 5)를 계산하여 공 초점 현미경으로 데이터를 수집. 투과성으로 컨트롤을 보여해야합니다 비 투과성이 세포 Calnexin들에 대한 염색을디기 토닌 - 투과성이 세포와 사포닌 투과성이 세포 PDI 염색에 대한 이닝 (그림 4). 웰스 A4와 A5는 살모넬라 오염에 대한 내부 통제를 제공합니다. </li></ol></li></ol></li></ol>

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R., Schlegel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+orientation+of+the+human+papillomavirus+type+16+E5+oncoprotein.">Membrane orientation of the human papillomavirus type 16 E5 oncoprotein.</a> J Virol. 84, 1696-1703 (2010).</li><li>Keller, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+measurements+of+vacuolar+rupture+caused+by+intracellular+pathogens.">Single cell measurements of vacuolar rupture caused by intracellular pathogens.</a> J Vis Exp. , e50116 (2013).</li></ol>

We have nothing to disclose.

차동 투과성으로 분석하고 액포 구획과 세포질 사이의 세균성 병원균의 세포 내 분포를 정량화 할 수있는 쉽고 강력한 방법입니다. 같은 분석은 Francisella novicida 2,4와 시겔 flexneri (12) 박테리아에 성공적으로 사용되어왔다. 많은 세포 내 병원체 변경하거나 호스트 endomembrane 구조를 수정하기 때문에, 디기 토닌의 투과성으로의 견고성은 개별적으로 결정되어야 할 것이...

세균 세포 내 병원체를 직접 숙주 세포의 세포질 또는 전문 액포 구획 중 하나에 복제. 감염의 초기 단계에서 대부분의 병원균 (예 : 대 식세포) 또는 능동적으로 비 식세포로 자신의 흡수를 촉진하여 전문화 된 세포에 의한 식균 작용에 의해 내재화를 얻는다. 식세포에서 phagosome 정상적으로 포식 입자 소화 degradative 구획을 형성 리소좀과 융합한다. 이러한 Francisella novicida 또는 시겔 flexneri 같은 전문 세포질 박테리아는 phagosome의 파열을 유도하여 phagosomal 저하를 탈출 이후 세포질 2,3로 탈출. 이는 액포 파열 2-4을 촉진 이펙터 단백질을 주입 Francisella 병원성 섬 (FPI) 또는 시겔 flexneri T3SS, 같은 독성 관련 메커니즘을 필요로한다. 숙주 세포의 세포질 기능일반적 병원체의 존재를 인식하고 5 시그널링 선천성 면역을 유도 보존 패턴 인식 수용체의 수. 또한 xenophagy, 자식 작용의 항균 형태 세포질을 입력 세균을 저하 할 수있다. 박테리아 세포질 통상 잘 무딘 또는 다른 전략을 사용하여이 반응을 회피하도록 구성되어있다. 예를 들어, Francisella 호스트 인식을 피하기 위해 LPS를 수정하고 시겔은 분비 이펙터 단백질 6,7를 사용하여 자식 작용 모집을 방지 할 수 있습니다. 리소좀 저하를 탈출하는 또 다른 전략 모델 액포 병원체 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움에 의해 고용되어, 그 후 살모넬라 티피 무리 움라고도합니다. 살모넬라 균은 세포 내 틈새 시장에 초기 phagosome 개조 이펙터를 주입하는 T3SS를 사용, 살모넬라 공포 (SCV) 함유 8,9. 호스트 경로의 연속 조작이다필요는 공포에 지질 및 기타 영양소를 보충하여이 공포를 유지합니다. 실제로, 살모넬라 SIFA 돌연변이 액포 안정성을 유지하는 데 실패하고 선천성 면역 경로와 자식 작용 모집 (8)의 활성화를 초래 감염 후 시간 이내에 숙주 세포의 세포질을 입력한다. 살모넬라 공포 성 탈출 연구하다 세포 유형에 따라 다양하고, 여러 가지보고 상피 세포에서도 WT 살모넬라 세포질 10 SCV 및 hyperreplicate 벗어날 수 있다는 것을 보여 주었다. 최근 보고서는 액포 병원균의 선천성 면역 검출도 인식하고 병원체 함유 액포 (PCVs) 11 ~ 14를 불안정하게 할 수있는 호스트의 능력에 달려 있음을 보여준다. 호스트 또는 박테리아 모두 유전자형 액포와 세포질 구획 사이의 세포 내 박테리아의 분포에 영향을 미칠 수 있음을 감안할 때, 그것은 액포 대들의 수를 정량화하는 것이 필요하다세포질 박테리아. , 이후 가장 실험 셋업에서 숙주 세포는 다른 세포 내 구획에서 여러 박테리아를 가질수이어서 하나 이상의 박테리아로 감염되고, 기술은 단일 박테리아의 수준을 정량화 허용하는 필요하다. (또한 phagosomal 보호 분석라고도 함) 차동 투과성으로는이 해상도 2,4,10,12를 제공합니다. 분석은 그대로 액포 막 잎 세제 디기 토닌와 숙주 세포 혈장 막의 선택적 투과성으로 기반으로하며, 따라서 항체의 선택적 박테리아 세포질 염색을 허용한다. 여기에서 우리는 차동 투과성으로를 사용하여 세포질과 액포 살모넬라 균의 정량이 프로토콜을 제공합니다. 이 방법의 원리는 그림 1에 설명되어 있습니다 : 골수 유래 대 식세포 (BMDMs)은 정지상이 살모넬라 균을 mCherry 발현에 감염된다. 고정상 살모넬라 균은 T가 필요그들이 활성 그렇지 NLRC4의 inflammasome을 인식하고 BMDMs 15의 신속한 세포 사멸 (pyroptosis)를 유도 할 것이다 T3SS SPI-1의 발현을 하향 조절하기 때문에 O 사용될. 세포를 세척하고 1 분간의 디기 토닌를 50㎍ / ㎖로 처리하여 감염에 이어. 세포를 다시 세척하고, 즉시 세포질에 접근 박테리아 마크 FITC 결합 항 살모넬라 항체와 함께 배양한다. 단계의 세포가 용해되어 추가 세척 및 mCherry + (액포)과 FITC + / mCherry + (세포질) 박테리아의 비율 후 FACS에 의해 결정된다. 우리는 또한 더 형광 단백질 발현 균주를 사용할 수는 (그림 2)없는 경우에 사용할 수있는이 방법의 적응을보고합니다. 추가 단계는 세포 투과성이 완전히 고정되는 FITC 표지 후에 도입된다. 그 후 모든 박테리아는 항 살모넬라 항체 및 해당 이차 항체로 염색된다. DETection은 다음 대신 FACS 분석의 현미경으로 이루어집니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5628</td>
			<td>50ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>mpbio</td>
			<td>219998380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Acetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>791733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td>
			<td>KPL</td>
			<td>01-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Salmonella CSA-1</td>
			<td>KPL</td>
			<td>02-91-99-MG</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Calnexin</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-860D</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-PDI</td>
			<td>Enzo Lifesciences</td>
			<td>SPA-890</td>
			<td>1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield mounting medium</td>
			<td>Vectorlabs</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Rabbit antibody-488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11070</td>
			<td>1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710-49</td>
			<td>100ug/mL and 10ug/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Promega</td>
			<td>H5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Amimed</td>
			<td>5-13K00-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM700 Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>imaging done at 63x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection mCherry 610 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS Fortessa</td>
			<td>BD technologies</td>
			<td></td>
			<td>detection FITC 530 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of cytosolic vs. vacuolar salmonella in primary macrophages by differential permeabilization

세포 내 세균 병원체는 세포질 또는 전문 병원체 함유 액포 (PCVs)에 복제 할 수 있습니다. 세포질에 도달하기 위해, 시겔 flexneri 및 Francisella novicida 같은 박테리아는 phagosome의 파열을 유도 할 필요가있다. 대조적으로, 살모넬라 티피 무리 움 살모넬라 함유 액포 (SCV)라고도 액포 구획에 복제. 그러나 특정 살모넬라 돌연변이 SCV 무결성을 유지하는 데 실패함으로써 세포질로 방출된다. 세균의 하나의 레벨에 액포 박테리아 대 세포질의 비율은 phagosome 보호 분석법으로 알려진, 미분 투과성으로하여 측정 할 수있다. 접근 방식은 세제 디기 토닌의 재산의 사용이 선택적으로 콜레스테롤을 결합 할 수 있습니다. 세포막 다른 세포막 이상의 콜레스테롤을 포함하고 있으므로, 디기 토닌는 세포 막을 남기고 선택적으로 세포막을 Permeabilize 하시려면하는데 사용될 수있다그대로. 형광 마커 단백질 (예 중에서도 mCherry)를 발현하는 병원체 간략히, 다음의 감염, 숙주 세포의 세포막을 함유 디기 토닌 완충액으로 짧은 인큐베이션으로 투과성이있다. 세포를 세척하고 배양 한 다음 선택의 세균에 대해 유도 (원하는 형광 물질에 결합) 일차 항체 (예, 항 -FITC 살모넬라) 다시 세척한다. 도장이 박테리아가 사용되는 경우, 부가적인 단계가있는 모든 막을 투과 가능하며 모든 박테리아에는 해당 항체로 염색 할 수있다. 염색 후, 액포와 세균의 세포질 비율은 단일 또는 이중 양성 이벤트를 카운트하여 FACS 또는 현미경에 의해 정량화 될 수있다. 여기에서 우리는 박테리아 살모넬라 티피 무리 움이 기술의 사용을위한 실험적인 세부 사항을 제공합니다. 이 분석의 장점은 다른 분석 달리, 그것이 단일 bacte의 수준 정량을 제공한다는 것이다RIA, 현미경으로 분석 한 경우, 소정의 셀에서의 세포질과 액포 박테리아의 정확한 숫자를 제공한다.

도 1 및도 2는도 1 및 프로토콜이 프로토콜은 프로토콜의 중요한 단계 및 수득 한 결과를 나타내는 디기 토닌에 기재된 분석법의 회로도를 도시한다. 3 FACS 전형적인 결과를 나타낸다. 긍정적이고 부정적인 컨트롤은 mCherry + / FITC- 박테리아 (액포 살모넬라) 및 mCherry + / FITC + 박테리아 (세포질 살모넬라 균)의 게이트를 설정하는 데 사용됩니다. 이들 게이트에 근거...

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Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

quantification-cytosolic-vs-vacuolar-salmonella-primary-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

10.8K 조회수.  University of Basel. We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

연구

면역학 및 감염병학

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. Transfection with siRNA and plasmid DNA is an efficient tool for studying their function, but transfection of macrophages is not a trivial matter. Although many different approaches for transfection of eukaryotic cells are available, only few allow reliable and efficient transfection of macrophages, but reduced cell vitality and severely altered cell behavior like diminished capability for differentiation or polarization are frequently observed. Therefore a transfection protocol is required that is capable of transferring siRNA and plasmid DNA into macrophages without causing serious side-effects thus allowing the investigation of the effect of the siRNA or plasmid in the context of normal cell behavior. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently transfecting human THP-1 macrophages and monocytes with high cell vitality, high transfection efficiency, and minimal effects on cell behavior. This approach is based on Nucleofection and the protocol has been optimized to maintain maximum capability for cell activation after transfection. The protocol is adequate for adherent cells after detachment as well as cells in suspension, and can be used for small to medium sample numbers. Thus, the method presented is useful for investigating gene regulatory effects during macrophage differentiation and polarization. Apart from presenting results characterizing macrophages transfected according to this protocol in comparison to an alternative chemical method, the impact of cell culture medium selection after transfection on cell behavior is also discussed. The presented data indicate the importance of validating the selection for different experimental settings.

This protocol presents an efficient and reliable method to transfect human THP-1 macrophages with siRNA or plasmid DNA by electroporation with high transfection efficiency while maintaining high cell vitality and full macrophage capacity for differentiation and polarization.

Nucleofection에 의해 인간의 THP-1 대 식세포의 고효율 형질

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV-1 감염 라이브 차 인간 대 식세포에서 측정 Phagosome 마이그레이션 및 속도

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

유동 세포 계측법에 의해 쥐의 신장에서 대 식세포의 표현형 특성

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought serious public safety concerns. Among the risk factors, antibody-dependent enhancement (ADE) poses the most significant threat, as the recent re-emergence of the Zika virus (ZIKV) is primarily in areas where the population has been exposed and is in a state of pre-immunity to other closely related flaviviruses, especially dengue virus (DENV). Here, we describe a protocol for quantifying the effect of human serum antibodies against DENV on ZIKV infection in primary human cells or cell lines.

We describe a method to evaluate the effect of pre-existing immunity against dengue virus on the Zika virus infection by using human serum, primary human cells, and infection quantification by quantitative real-time polymerase chain reaction.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...