이 프로젝트는 (AJB 및 LGA, R01 AI076246에 대한) 건강 NIAID의 국립 연구소에 대한 보조금에 의해 부분적으로 지원되었다. 살모넬라 균 돌연변이 수집은 부분적으로 국민 건강 보조금 연구소 (MM를 들어, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 및 R01 AI075093-01) HAP, R21에 대한 부분적으로 건강 보조금의 국립 연구소에 의해, (에 의해 지원되었다 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). 우리는 복제 도금 및 컬렉션의 돌연변이를 확인하기위한 스테 Prowollik 감사합니다.

1 쥐과 대 식세포 RAW264.7 세포 배양 <ol><li> 낮은 통로 번호 뮤린 대식구 세포 성장을 10 % 소 태아 혈청이 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)에서 T-75 세포 배양 물 플라스크 벤트 필터 모자 RAW264.7 (ATCC ® 번호, TIB-71) (FBS) , 0.5 % 탄산 수소 나트륨, 1 %, 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 100 배 비 필수적인 아미노산 (NEAA). </li><li> 세포를 플라스크에서 60~80% 합류점에 도달하면, 세포를 수확 셀 스크레이퍼를 사용 hemacytometer에서 셀 카운트 및 세포 농도를 계산한다. </li><li> 세포를 재현 탁하고 신선한 세포 DMEM 배지에서 2.5 × 105 / ㎖로 세포 농도를 희석한다. 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 5 × 104 세포를 함유하는 세포 DMEM 배지 200 μl를 플레이트에 다 채널 피펫을 사용한다. </li><li> 각 살모넬라 균주의 네 우물 플레이트. 한 세트에 세 개의 분리 된 판을 설정식세포 침공 분석의, 각각 &quot;협회&quot;, &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시합니다. </li><li> 대식 세포가 우물의 바닥에 부착 할 수 있도록 37 ° C ON에서 5 % CO 2 배양기에서 접시를 놓습니다. </li></ol> 살모넬라 야생형과 돌연변이의 제조 2 <ol><li> 식세포 RAW264.7 세포를 제조 당일에, (야생형의 단일 콜로니 (WT) 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리엄 14028s, 루리아 - 베르 타니에 DinvA 변이체, DphoP 변이체, 원하는 시험 돌연변이 균주 및 배양들을 골라 LB) 브로스는 적절한 항생제로 보충. 10 돌연변이 균주 (DinvA 돌연변이 및 DphoP 돌연변이가 각각 침략과 세포 내 복제 결함)를 테스트하기 위해 식세포 침입 분석의 각 세트를 사용합니다. </li><li> 의 37 ° C에서 14 시간 동안 박테리아 성장둥근 바닥 튜브에 느슨하게 덮인 14 ㎖의 폴리 프로필렌에 5 ㎖의 LB 액체 배지에 각각 220 rpm에서 haking. LB 국물이 우리의 경우, 돌연변이 균주의 대부분은 카나마이신에 내성 적절한 항생제를 포함, 50 μg / ml의 </li><li> 다음 날, 220 rpm에서 진탕 추가로 4 시간 동안 1시 50분의 비율 LB 브로스의 일반 5ml에 살모넬라 균주의 배양 ON의 각 하위 문화. </li><li> 분광 광도계에 OD 각 세균 배양의 600 값을 읽고, 각 읽기는 살모넬라 균의 병원성 섬 - 1 타입 III 분비 시스템 침공 (SPI-1 TTSS) 유전자 발현을 최적화하기 위해 0.6-1.2 범위해야합니다. </li><li> 한 OD의 수식을 사용하여 (600) = 7.5 × 10 8 CFU 다음, 박테리아의 농도를 추정 신선한 DMEM 세포 배양 배지에서 5 × 106 CFU / ml의 농도로 희석 박테리아 / ㎖. </li></ol> 96 웰 배양 플레이트에서 3 침공 분석 <ol><li> 세 96 웰 CEL 제거리터 문화 CO 2 배양기에서 접시와 씻어 각 웰 1X PBS 버퍼 200 μL로 한 번. </li><li> PBS 세척하고 완전히 제거한 후, 각 웰에 200 ㎕의 균 DMEM 배지 (상기 참조)를 추가한다. 이 감염의 각 웰과 다양성 (20) (MOI)에서 1 × 10 6 살모넬라 균 세포에서 발생 : 1. </li><li> 다음 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 번호판 (0시)를 교체, 10 분 동안 밀폐 된 캐리어에 1,000 XG에 번호판을 원심 분리기. 각 균주의 경우, 적어도 네 중복 우물을 설정합니다. </li><li> 30 분 후, 인큐베이터에서 접시를 제거하고 연결되지 않은 박테리아를 제거하는 1X PBS 200 μL로 3 회 씻는다. </li><li> 세척 후, 차후 치료를 위해 &quot;협회&quot;로 표시된 판을 저장합니다. 주문 t의 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;로 표시된 플레이트의 각 웰에 100 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가오. 세포 외 살모넬라 균을 죽일 추가 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에 플레이트를 돌려줍니다. </li><li> , 대식 세포 수를 기록하기 위해 각 균주로부터 잘 감염을 저장 한 10 분 동안 1 % 트리톤 X-100을 포함하는 1X PBS 200 ㎕를 사용하여 &quot;관련&quot;플레이트에 웰의 나머지 취급. 트리톤 솔루션은 대식 세포를 용해 및 관련 살모넬라 균을 발표 할 예정이다. </li><li> 각 웰에서 수확 살모넬라 및 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 배치합니다. 각 웰에서 수확 된 샘플에 900μl 1X PBS로 3 10 배 희석액을 수행 소용돌이는 각 희석 사이에 수행된다. </li><li> 하나 LB (WT) 또는 LB 칸 (돌연변이) 접시에 세 번째 희석, 10 -3, 플레이트. 적절한 살모넬라 균주 이름, 희석 수, 시각 및 날짜 판을 레이블을 지정합니다. </li><li> 셋째 희석 튜브를 볼 텍싱 한 후, 한천 및 반복 (F)의 표면 상에 10 ㎕의 샘플을 조제5 방울의 총에 대한 우리의 시간. 5 ~ 10 μL은 페트리 접시 플레이트 (7)에 균등하게 떨어진다 공간으로해야합니다. </li><li> 방울 후, 한천에 스며을 통해 판을 켜고 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 하룻밤 배양한다. </li><li> 10 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA를 포함하는 150 μL의 1XPBS와 대 식세포의 계산을 위해 저장 우물을 처리합니다. </li><li> 트립신 후, 1.5 ml의 에펜 도르프 튜브에 넣습니다 식세포와, 트립신 / EDTA 용액을 중화 FBS의 50 μL로 치료 0.4 % 트리 판 블루와 세포를 염색하고 hemacytometer를 사용을 통해 점수. </li><li> 한 시간 보육이 경과하면 CO 2 배양기에서 &quot;침략&quot;과 &quot;복제&quot;판을 제거하고, &quot;단계 3.4&quot;로 각 잘 씻는다. </li><li> &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 추가 처리에 대한 &quot;침략&quot;판을 저장합니다. </li><li> 10 μg / ml의 겐타 마이신을 함유하는 DMEM 배지 200 μl를 추가&quot;복제&quot;플레이트 배지에서 세포 살모넬라의 간극을 유지한다. 추가로 22.5 시간 동안 5 % CO 2 배양기 37 ° C에 접시를 돌려줍니다. </li><li> 다음 날, 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 &quot;복제&quot;플레이트를 분리하고, 각 씻어 아니라 &quot;3.4 단계&quot;와 &quot;단계 3.6-3.12&quot;로 취급합니다. </li><li> 마지막으로, 37 ° C 배양기에서 하룻밤 배양 한 후 한천 플레이트를 제거하고 세균 콜로니의 수를 점수. </li><li> 좋은 식민지 분포는 식민지 10 ~ 100, 각 지점은 약 2 식민지 20, 그것은 한 자리에서 20 개 이상의 식민지가 있다면 점수 어려울 것 포함해야한다. 필요에 따라 개수가 너무 낮거나 너무 높으면, 시료 replate 높거나 낮은 희석 10 배. </li></ol> (4) 데이터 분석 <ol><li> 도금에 기초하여 각각의 판의 CFU (ML 당 콜로니 형성 단위)를 계산볼륨 및 희석 배수. </li><li> 각 균주로부터 기록 된 대식 세포 수 당 살모넬라 통해 식세포의 개수를 확인. </li><li> 각각 연관 셀, 침윤 또는 복제하기위한 적어도 3 개의 독립적 인 실험에서 대식구 당 CFU의 기하 평균을 계산하고, 상대적인 값을 WT로 더욱 정규화. </li><li> WT에 대한 각각의 변형을 비교하여, 각각의 스튜던트 t -test 의해 협회, 침윤 및 복제에 대한 데이터를 분석하고, P 값에 의해 유의성을 결정한다. </li></ol>

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

We have nothing to disclose.

겐타 마이신 보호 분석법 널리 숙주 세포 내부의 세포 내 박테리아 병원균의 침입 및 복제를 연구하는 데 사용되며, 특히 그 내습 감염 하나를 설정하기위한 필수 공정이다 살모넬라와 같은 병원체를 연구하는데 중요한 생물학적 도구이다. 살모넬라 연구 커뮤니티의 표준 겐타 마이신 보호 분석은 24 웰 배양 접시 5에서 구현된다. 48 또는 96 웰 플레이트의 사용...

Nontyphoidal 살모넬라 균은 모든 척추 동물의 장내 질환의 중요한 원인이됩니다. 인간의 살모넬라증은 최고 세균성 식중독 질병 일 중 하나입니다. 자신의 동물 호스트와 살모넬라 균의 상호 작용을 뒷받침하는 분자 메커니즘의 특성은 주로 감염의 조직 문화와 동물 모델에서 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움 (STM)의 연구를 통해 달성된다. STM-호스트 상호 작용에 대한 통찰력을 확보하는 것은 우리가 살모넬라 균은 생존과 숙주 세포 내부에 성장하는 방법을 이해하는 데 도움이됩니다. 이러한 상호 작용을 연구의 첫 번째 과제는 호스트와 병원체 모두에서 가능한 한 많은 참여 요인을 파악하는 것입니다,하지만, 이러한 노력은 주로, 동시에 두 개의 독립적 인 복잡한 생물학적 시스템 즉, 호스트 및 살모넬라 균을 다루는 중요한 문제로 막혀, 생리 학적 조건 하에서. 또한, 큰 repert살모넬라 균의 oire 잠재적 호스트 상호 작용에 관여하는 요인을 인코딩 호스트 유전자는 이러한 문제를 해결하기 위해 높은 처리량 생물 플랫폼이 필요합니다. 수정, 표준화 된 분석은 가능성이 살모넬라 -host 상호 작용에 관여하는 유전자의 큰 세트를 검사하기 위해 개발 된 높은 처리 용량 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형. 겐타 마이신 보호 분석은 1973이 개발되었지만, 첫째 철저하게 1994 3,4에 Elsinghorst에 의해 설명되었다. 지금은 살모넬라 5,6 포함한 생체 많은 세포 내 세균성 병원체를 공부하기위한 표준 도구가되었습니다. 내면화 된 세균은 진핵 세포 (3)를 통과 할 수 겐타 마이신 등 일부 항생제에 의해 살해되지 않도록. 이 현상을 이용하여, 겐타 마이신 보호 분석법은 세포 (BA)의 생존 및 성장을 측정cterial 병원균. 감염 동안 세 개의 이벤트, 즉 진핵 세포 침윤 및 복제와 관련하여, 감염, 겐타 마이신 처리하고, 또한 배양 (도 1) 사이의 시간 간격에 따라 세포 내 박테리아 병원균에 대해 평가 될 수있다. 진핵 세포주는 호스트 병원체 상호 작용 연구에 대한 중요한 동물 모델보다 덜 복잡하며 생리적 환경을 제공한다. 겐타 마이신 보호 분석은 STM-호스트 상호 작용을 연구하는 적절한 플랫폼이지만, 24 - 웰 배양 접시에있는 표준 분석은 낮은 처리량을 갖는다. 생체 데이터 셋의 전산 분석은 약 300 호스트 유전자 제품 (게시되지 않은 데이터)와 상호 작용 할 것으로 예상되는 149 살모넬라 균의 유전자 산물을 확인했다. 겐타 마이신 표준 보호 분석법 효율적 돌연변이 숫자를 표현형 능력이 없다. 와 T에서이온, 겐타 마이신 보호 분석은 이론적으로도 단일 세균의 침입을 감지 할 수 있습니다. 다른 시간에 반복되면이 때문에 고유 감도, 원시 데이터는 기술적 차이에 민감하다. 내부 통제 및 정상화 후 상대 데이터 프레 젠 테이션 결과의 의미 해석에 필수적이다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 변성 표준화 겐타 마이신 보호 분석은 테스트 능력을 향상하고 정밀도를 높이기 위해 개발되었다. 다음의 상세한 프로토콜은 96 - 웰 배양 접시 및 뮤린 RAW264.7 대 식세포 세포주를 사용하여 개질 겐타 마이신 보호 분석을 수행하기 위해 도시되어있다. 24 웰 배양 접시에서 표준 프로토콜에 비해 수정 된 프로토콜은 다음과 같은 장점이있다 : 1) 96 - 웰 배양 접시를 사용하여 충분한 통계적인 힘을 가진 내부 양성 및 음성 컨트롤을 포함하여 phenotyped 할 10 가지 돌연변이 균주를 허용을;돌연변이 균주가 동일 배양 접시에서 동시에 시험 때문에 2) 결과의 편차가 현저하게 감소된다; 운전자의 피로를 줄이는 동시에 3) 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시킨다. 마지막으로, 24 - 웰 배양 접시에 비하여 96 - 웰 배양 접시에 웰당 이하 숙주 세포 우려 프로토콜 최적화 및 표준화를 통해 해결 하였다. 요약하면, 대 식세포에서 체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 복제에 변경됨 표준화 분석은 정밀도 향상과 작업자의 피로를 감소시키면서 높은 처리 능력을 달성한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

살모넬라 종은 인수 공통 병원균과 인간과 가축 한 식품 매개 질환의 주요 원인이다. 살모넬라 -host 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해 살모넬라 감염의 분자 기전을 규명하는 것이 중요하다. 겐타 마이신 보호 분석은 높은 처리량 검사가 RAW 264.7 쥐의 대 식세포를 사용하여 호스트 상호 작용에 살모넬라 엔테 혈청 형 티피 뮤 리움의 삭제 돌연변이의 역할을 정의 할 수 있도록 적응했다 식세포에서 살모넬라 협회, 침략과 복제를 표현형.이 프로토콜에서 분산을 야생형 및 돌연변이 균주 여러 동일 배양 접시에서 동시에 테스트 할 수 있기 때문에 측정에서 크게, 표준 프로토콜에 비해 감소된다. 멀티 채널 피펫을 사용하면 처리량을 증가시키고, 정밀도를 향상시킨다. 또한, 우려가 적은 호 사용에 관한96 - 웰 배양 접시에 웰당 성 세포를 해결 하였다. 여기서, 대 식세포를 사용하여 시험 관내 변형 된 살모넬라 침윤 분석의 프로토콜이 성공적으로 연관, 침윤 및 세포 내 복제 38 개인 살모넬라 결실 돌연변이 표현형을 사용 하였다. 체외 표현형은 일부는 이후 동물 모델에서 생체 내 표현형에있는 것이 확인되었다되게됩니다. 따라서, 수정 된, 표준화 된 분석은 높은 처리량이 세균 숙주의 상호 작용을 연구하기 위해보다 광범위하게 이용 될 수있는 대 식세포에서 살모넬라 협회, 침윤 및 복제 표현형.

데이터가 수정 된 탐식 세포 침공 분석을 기반으로 꾸몄다 후 대표적인 결과 (그림 2)를 참조하십시오. 데이터 복제 팔에 대한 결함이있는 것으로 알려진 다섯 가지 변종, WT, ΔinvA, ΔphoP, 돌연변이, 그리고 침략에 대한 결함이있는 것으로 알려진 돌연변이 B. Δ INVA, 및 ΔphoP을 포함, 실험 유효성을 평가하기 위해 양성 대조군으로 사용됩니다 . 실제로, 변성 ?...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다.

표현형 높은 처리량 분석<em&gt; 살모넬라 엔테</em&gt; 티피 뮤 리움 협회, 침략, 그리고 대 식세포에서의 복제

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K 조회수.  Texas A&M University.  체외 표현형 살모넬라 또는 다른 세균성 협회, 침윤 및 높은 처리량과 식세포에서 복제에 높은 처리량 분석이 개발되었다. 방법은 호스트 병원체 상호 작용에서의 침범 위해 살모넬라 유전자 녹아웃 돌연변이 균주를 평가하기 위해 사용 하였다. 

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An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

연구

면역학 및 감염병학

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

감염 프로토콜<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt;와<em&gt; 살모넬라 티피 뮤 리움 (Salmonella typhimurium)</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

공포 성 대 세포질의 정량화<em&gt; 살모넬라</em&gt; 차동 투과성으로하여 기본 대 식세포에서

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

작은 분자의 높은 처리량 스크리닝 적합한 형광 계 분석 림프구

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

높은 처리량을 지원 분석은 대식 세포 계대에 대한 약물 효능을 평가하기<em&gt; 결핵균</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...