종양 관련 대식세포는 종양 미세 환경에서 중요한 역할을 합니다. 종양 세포에 있는 다른 유전 돌연변이가 대식세포 모집에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것은 암 환자를 위한 개인화한 처리를 디자인하기 위한 중요합니다. 이 분석법은 시험관 내 종양 세포와 대식세포 사이의 상호 작용을 평가하는 쉽고 강력한 방법을 제공합니다.
이 분석체는 종양 세포와 체외내의 다른 면역 세포 사이의 상호 작용을 평가하기 위해 수정될 수 있다. 이 절차를 시작하려면 20 분 동안 섭씨 37도에서 수조에 배치하여 혈청없는 줄기 세포 매체를 따뜻하게하십시오. 70%에탄올로 조직 배양 후드 표면을 살포하고 종이 타월로 분무된 표면을 닦아냅니다.
다음으로 중간 및 세포 분리 용액 병을 70%에탄올로 분사하고 종이 타월로 닦아냅니다. 청소된 병을 조직 배양 후드로 옮킨다. 종양 세포를 검색하고 조직 배양 후드로 옮춘다.
매체를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 씻으세요. 그런 다음 플라스크에 세포 분리 용액 의 2 밀리리터를 추가합니다. 두건을 아래로 플라스크를 설정하고 종양 세포가 반올림되었는지 확인하기 위해 매 분마다 확인합니다.
일단 종양 세포가 둥글게 되면, 부드럽게 세포가 분리하는 것을 돕기 위하여 플라스크의 쪽을 누릅니다. 그 후, 혈청이 없는 셀 배지의 파이펫 8밀리리터를 플라스크로 들어가고 파이펫을 세 번 위아래로 섞어 섞는다. 이 셀 서스펜션을 15밀리리터 원심분리기 튜브와 원심분리기로 200배, 섭씨 4도에서 5분간 전달합니다.
상체를 흡인합니다. 그런 다음 PBS의 10 밀리리터에서 세포를 씻어 서 3 ~ 5 번 파이펫을 섞습니다. 원심 분리는 200 배 g와 5 분 동안 섭씨 4도에서 세포를 원심 분리합니다.
수퍼내티퍼를 흡인시키고 혈청이 없는 배지의 10밀리리터에서 세포를 재분리한다. 파이펫을 3~5회 위아래로 섞어 섞습니다. 이 셀 서스펜션의 마이크로리터 10을 Trypan Blue 용액의 10 마이크로리터와 혼합합니다.
다음 파이펫 10 트리판 블루와 셀 혼합물의 마이크로 리터 는 카운트 슬라이드로, 살아있는 세포 수를 정량화하기 위해 자동 셀 카운터를 사용합니다. 혈청이 없는 세포 배지를 사용하여 밀리리터당 5번째 세포로 세포 밀도를 2.5배 10배로 조절한다. 그런 다음 세포의 2 밀리리터를 6웰 배양 판의 각 우물로 시드합니다.
동시에 세럼이 없는 줄기 세포 배지의 2밀리리터만으로 6개의 우물을 준비합니다. 그 후 6웰 플레이트를 섭씨 37도에서 24시간 동안 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 먼저 70 %에탄올로 조직 배양 후드 표면을 분사하고 종이 타월로 분무 된 표면을 닦아냅니다.
다음으로 중간 및 세포 분리 용액 병을 70%에탄올로 분사하고 종이 타월로 닦아냅니다. 청소된 병을 조직 배양 후드로 옮킨다. 이 후 인큐베이터에서 6웰 플레이트를 검색합니다.
조건부 미디어를 15밀리리터 멸균 원심분리기 튜브에 조심스럽게 피펫하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 세포 분리 용액0.5 밀리리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 넣고 종양 세포가 반올림한 경우 매 분마다 확인합니다. 일단 종양 세포가 둥글게 되면, 부드럽게 세포를 분리하는 것을 돕기 위하여 접시의 쪽을 누릅니다.
종양 세포 유지 보수 배지의 다음 파이펫 2.5 밀리리터는 혼합하기 위해 세 번 위아래로 파이펫으로 한다. 세포를 15 밀리리터 멸균 원심분리기 튜브로 옮기다. Trypan Blue 용액의 10 마이크로리터와 세포의 10 마이크로리터를 혼합하고 이 혼합물의 10 마이크로리터를 카운팅 슬라이드로 옮킨다.
자동 세포 카운터를 사용하여 살아있는 세포의 수를 정량화하고, 세포 수에 따라 조건부 된 매체의 부피를 조정하기 위해 하룻밤 사이에 37섭씨에서 배양된 혈청 없는 줄기 세포 배지를 사용합니다. 0.45 마이크로미터 필터를 통해 조건부 미디어를 필터링하고 조건부 미디어를 얼음 위에 놓습니다. 먼저 IMDM 배지를 섭씨 37도에서 20분간 따뜻하게 해보시다.
70%에탄올로 조직 배양 후드를 청소하고 배지병을 청소하고 이전에 설명한 대로 후드로 운반한다. 다음으로 MV-4-11 세포의 플라스크를 후드로 옮킨다. 파이펫 10 밀리리터 의 세포는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로.
Trypan Blue와 자동 셀 카운터를 사용하여 이전에 설명한 대로 살아있는 세포의 수를 정량화합니다. 그런 다음 세포를 200 배 g에서 5 분 동안 섭씨 4도에서 원심 분리합니다. 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 PBS의 10 밀리리터로 세포를 씻으세요.
원심분리기는 다시 200배, 섭씨 4도에서 5분간 다시 원심분리기를 사용한다. 수퍼나탄을 흡인하고, 밀리리터당 100만 개의 세포의 최종 세포 밀도에서 IMDM 배지에서 세포를 재분리한다. 먼저 필요한 재료를 실온으로 가져옵니다.
각 삽입에 준비된 MV-4-11 셀의 250 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 24웰 플레이트의 하부 챔버에만 조건부 배지 또는 배지의 400 마이크로리터를 추가하여 트리플리케이트에 샘플을 추가합니다. 섭씨 37도에서 4시간 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다.
그런 다음 동일한 내부 벽에 삽입을 부드럽게 탭하고 삽입을 폐기합니다. 부드럽게 혼합 하는 우물에 세포를 피펫 세 번. 이 세포 현탁액의 225 마이크로리터를 형광 측정에 적합한 검은 벽 96웰 플레이트의 우물로 옮기.
그 후 CyQUANT 염료를 4배 리시스 버퍼로 1~75의 비율로 희석합니다. 소용돌이를 짧게 하고 용액을 회전시다. 이 용액의 75 마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
형광판 판독기를 사용하여 형광을 읽고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. 이 연구에서는, 체외 분석은 종양 대식세포 상호 작용을 연구하기 위하여 이용됩니다. 형광 값이 높은 샘플은 조건부 미디어가 대식세포를 모집할 수 있는 높은 용량을 가지고 있음을 나타냅니다.
실험적 필요에 따라 추가 컨트롤을 포함할 수 있습니다. 예를 들어, 중화 항체를 사용하여 조건부 된 매체를 치료하여 대식세포 화학요법을 폐지하고 동일한 방식으로 수행 할 수 있습니다. 또한 조건부 미디어에 추가 케모키네를 추가할 수 있으며 이는 긍정적인 제어 역할을 합니다.
다른 세포 모형이 다른 속도로 증가할 수 있기 때문에 이 분석에 대한 세포 수 차이를 통제하는 것이 중요합니다. 생체 내 결과의 생체 내 확인은 매우 중요합니다. 하나는 마우스로 종양 세포를 주입하고 결과를 확인하기 위해 유동 세포, 면역 염색 및 CyTOF를 사용하여 종양을 분석 할 수 있습니다.
