UC 버클리 박사 켄트 맥도날드의 친절과 관용이 크게 감사합니다. 우리는 매우 유용한 제안에 대한 익명의 검토를 부탁드립니다. 버치 스미스 연구소는 테네시 대학에서 창업 자금을 지원합니다.

참고 : QFS 절차는 사용자에 의해 극단적 인 관심과주의를 필요로하고 우리는 해당주의 및 참고 사항 여기에 이​​러한 안전주의 사항을 강조 표시합니다. HPF 실행에 대한 1. 준비 <ol><li> 샘플 준비를 시작하기 전에 제조업체의 지침에 따라 고압 냉장고의 전원을 켭니다. NOTE :이 프로토콜에서 사용 HPF 유닛 Wohlwend 컴팩트 부 02 (도 1a)이며, HPF가 실행되기 전에 시작할 수는 시동 절차 1과 시간 반에 약 걸립니다. <ol><li> Wohlwend 소형 02 고압 냉동고에 전환. <ol><li> &quot;1&quot;을 &quot;0&quot;에서 메인 스위치를 돌려 장비에 전환합니다. </li><li> 시스템에 압축 공기를 해제합니다. </li><li> 기계에 액체 질소를 놓습니다. </li><li> 눌러 &quot;SYSTEM DRY UP&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 30 분 후, &quot;SYSTE을 눌러M DRY UP &quot;버튼을 다시. </li><li> 을 눌러 &quot;ON / OFF&quot;버튼을 악기에 전환합니다. </li><li> &quot;질소&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 버튼 &quot;IN DRIVE&quot;가 이미 켜져있는 경우에도 기계가 20 분 동안 식히십시오. </li><li> 최대 버튼에 불이 &quot;IN DRIVE&quot;. </li><li> 버튼 &quot;IN DRIVE&quot;를 누릅니다. </li><li> &quot;AUTO&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> &quot;SYSTEM READY&quot;버튼을 켜집니다. </li><li> 압력 챔버에 온도와 압력 프로브를 삽입하고 핀을 잠그고. </li><li> &quot;JET의 AUTO&quot;버튼을 누릅니다. 원하는 압력 증가 및 온도 저하가 있음이 확인 단계; 기본적으로 시운전. 온도와 압력의 급격한 증가 샤프 방울 (그림 1B) 예상된다. </li><li> 두 개 더 JET주기를 수행하십시오. </li></ol></li></ol></li></ol> Receivi에 대한 2 준비NG 냉동 샘플 <ol><li> 홀더가 완전히 (그림 1C) 적용되도록 액체 질소와 cryovial 홀더를 포함하는 절연 상자를 채우기 (안전 경고 참조). 주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. </li><li> 액체 질소 (그림 1C)에있는 알루미늄 튜브 홀더에 FS 매체를 포함하는 튜브의 적절한 수를 놓습니다. 최대 네 개의 디스크에이 프로토콜을 통해 하나의 샘플을 포함하는 각은 하나의 cryovial에 배치 할 수 있습니다. 참고 : 유리 병이 다이아몬드로 만들어진 학자 및 매우 부드러운 연필 등 뾰족한으로 표시해야합니다. <ol><li> QFS 동안 정착을 위해 아세톤 구에 1 % OSO 4와 0.1 % 우라 닐 아세테이트를 사용합니다. 액체 질소에 냉동 cryovials 및 저장소에 1.5 ㎖를 분취 량을 분배, 대량의 솔루션을 준비합니다. 참고 : OSO 4 우라 닐 아세테이트를 처리하기위한 안전 경고를 따르십시오. 참고 : OSO 4 </suB&gt;와 우라 닐 아세테이트는 위험한 화학 물질 및 폐쇄 발가락 신발, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하고있는 동안 흄 후드에서 처리되어야한다. NOTE : QFS 용 샘플을 보유하는 데 사용 cryovials은 튜브가 OSO (4)의 누출을 피하기 위해 QFS 동안 밀봉 상태로 유지되도록하여 단단한 O 링을 가져야한다. </li></ol></li><li> 붙여 넣기가 부드럽게 될 때까지 이쑤시개 나 기타 등의 악기 10 % 메탄올의 대략 동일한 볼륨과 빵 효모를 혼합하여 효모 붙여 넣기를 준비합니다. 효모 페이스트 세포 동결 방지제로서 작용하고 캐리어의 시험편 샘플의 주위의 공간을 채우기 위해 사용된다. 페이스트의 양이 샘플의 수에 의존한다; 10 개 이하의 샘플 페이​​스트 (1 ml)을 마이크로 원심 튜브에 혼합 될 수 위해. </li></ol> 샘플의 3 고압 냉동 <ol><li> 공장에서 관심의 잎 (또는 다른 조직)를 제거하고 부드럽게 denta의 조각에 배치리터 왁스 또는 다른 절삭면. 잎에서 샘플을 잘라 2.0 mm 또는 원하는 크기의 펀치를 사용합니다. 포셉 한 쌍의 부드럽게 샘플을 처리하고 가능한 한 신속하게 작동합니다. </li><li> 해부 현미경 협력 형 시험편 캐리어 0.2 mm 측면에서 잎 디스크를 배치하고 효모 페이스트를 완전히 커버. 디스크가 완전히 충전되어 있는지 확인하고, 붙여 넣기는 잘 붓 (그림 2)와 붙여 넣기를 부드럽게 처리하여 홀더의 가장자리 수준입니다. </li><li> 시편 홀더 캐리어를 놓습니다. B 형 표본 캐리어 평평한 표면 아래로 샘플을 커버. 주 : 시편 홀더가 건조하고 상온에서해야한다. </li><li> 시편 홀더에 샘플을 받아 컴퓨터에 삽입하고 1 ~ 2 초에 완료해야합니다 &quot;JET의 AUTO&quot;버튼을 눌러 냉동 사이클을 시작합니다. </li><li> 가능한 한 빨리 작업 기계에서 홀더를 제거하고 SAMP를 들고 팁을 배치르 HPF 기계의 상단에 절연 상자에 액체 질소로. 그들을 진정 액체 질소에 집게 이쌍의 끝을 담가. 참고 : 동결 후, 항공사는 단 액체 질소 냉각 집게로 처리해야합니다. 따뜻한 (실온) 집게는 종종 cryotechniques에서 실패의 원인입니다. </li><li> FS 매체를 포함하는 cryovial를 열고 상자의 측면에 뚜껑을 배치합니다. 액체 질소 냉각 포셉 쌍의 도움으로 부드럽게 디스크가 액체 질소 또는 증기 항상되도록, 시험편 홀더로부터 디스크를 제거. 액체 질소 증기에서 작업 한 사전 냉각 집게 FS 튜브를 잡고 FS 유리 병에 홀더를 배치하는 다른를 사용합니다. 뒷면에있는 FS 유리 병의 뚜껑을 나사. 하지 함정을 유리 병에 액체 질소를 수행합니다. 참고 : QFS에 대한 cryovials에는 액체 질소가 유리 병에 갇혀되지 않도록하기 위해 샘플을 전송. 액체 질소는 온난화와 어떤 trappe 동안 700 배 확대D 액체 질소는이 기간 동안 폭발의 원인이 될 수 있습니다. </li><li> 원하는 모든 샘플이 고정 될 때까지 반복 3.7에 3.1 단계를 반복합니다. 샘플의 동일한 유형을 포함하는 다수의 리프 디스크는 동일한 병에 배치 될 수있다. 시편 홀더 건조 및 동결 실행 사이 실내 온도에 가져해야합니다. 신속하게이 작업을 수행하려면, 타격 드라이어로 가열하고, 터치에 의해 그 온도를 모니터링 할 수 있습니다. </li></ol> 프리즈 교체를위한 준비 (4) <ol><li> 10 분 동안 완전하게 핵 비등 또는 정지 될 때까지 액체 질소에서 알루미늄 히터 블록 젖어. 이 일이 벌어지고있는 동안, FS 챔버 (그림 3)로 사용되는 용기의 바닥에 드라이 아이스 (1-2 ㎝)의 층을 배치합니다. 스티로폼 용기 또는 얼음 양동이 짓 눌린 드라이 아이스 펠렛 (pellet)와 함께 FS 사용할 수 있습니다. </li><li> 신속 히터 블록의 중간 행에 온도 프로브와 함께 샘플을 함유 cryovials 삽입. 반드시 그의 뚜껑FS 미디어 FS 중에 누출되지 않도록 병 나사로 단단히 조여된다. 온도를 기록 시작합니다. <ol><li> 이 튜브의 바닥에 닿을 수 있도록 cryovial의 상단을 통해 열전대를 배치하여 온도 프로브를 확인. 수지 튜브의 뚜껑을되도록 액체가 밖으로 누출 봉쇄. 각 QFS 실행의 시작 부분에 1.5 ㎖의 아세톤 튜브를 입력합니다. </li></ol></li><li> 절연 cryogloves 또는 큰 집게를 사용하여, 히터 블록으로부터 모든 액체 질소를 부어. cryovials을 부어 않도록주의하십시오. 주 : 액체 질소를 처리 할 때 사용 PPE는 cryogloves 고글을 포함. </li><li> QFS 챔버에서 드라이 아이스 층 상 튜브를 함유하는 블록을 놓는다. 블록은 튜브가 수평으로 누워되도록 배치하지만, 약간 위쪽으로 기울기되어 있는지 확인합니다. 올바른 cryovials를 사용하는 경우 누설이 없어야합니다. </li><li> FS 튜브가 적용되도록 그것을 할 필요가 없습니다 만, 드라이 아이스와 함께 QFS 챔버 팩블록의 상단을 포함한다. 챔버의 뚜껑을 놓습니다. </li></ol> 5 빠른 FS 참고 : OSO 4의 누설이 실수로 다른 예방 조치에도 불구하고 발생하는 이벤트에 흄 후드에서 QFS 실행을 수행합니다. <ol><li> 흄 후드 플랫폼 회전 진탕 QFS 챔버를 놓고 120 분 동안 125 rpm으로 회전합니다. 이 때 블록의 온도는 약 -80 ° C로 서서히 증가한다. 교반 더 나은 FS에 대한 구성 요소의 혼합을 보장합니다. 참고 : 흄 후드에서 통하고 흄 후드 도어의 위치의 배치는 QFS 절차를 통해 샘플의 일관된 온난화를 확인하기 위해 실행할 때마다 QFS에 대해 동일해야합니다. </li><li> 챔버에서 드라이 아이스를 제거하고 다른 시간 진탕 계속합니다. 참고 : 온도가 -15 ° C에서 -20 ° C로 증가 할 전망이다. </li><li> QFS 실에서 샘플 및 온도 프로브를 제거하고에 배치또 10 ~ 15 분 동안 실온에서 진탕, 때까지 실온에 도달한다. 온도 기록을 중지합니다. </li><li> FS 동안, HPF 기계의 전원을 끄십시오. <ol><li> HPF 기계 질소로 충전되는 동안, 액체 질소 탱크의 수돗물습니다. </li><li> &quot;질소&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 빨간색 &quot;PISTON DOWN&quot;빛이 소멸 될 때까지 기다립니다. </li><li> &quot;ON / OFF&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 눌러 &quot;SYSTEM DRY UP&quot;버튼을 누릅니다. </li><li> 기계에 압축 공기의 공급을 차단. </li><li> 12 시간의 최소 후 (습기의 건조를 보장하는) &quot;0&quot;에서 &quot;1&quot;부터 메인 스위치를 켜서 시스템을 해제. </li></ol></li></ol> 6 포스트 FS 처리 <ol><li> 조심스럽게 유독성 폐기물에 대한 적절한 용기에 플라스틱 전송 피펫과 장소 FS의 용지를 제거합니다. NOTE : OSO 4 및 우라 닐 아세테이트는 위험한 화학 물질폐쇄 발가락 신발, 실험실 코트와 장갑을 포함하여 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 한 상태와 흄 후드에서 처리되어야한다. </li><li> 워시 샘플 100 % 아세톤 네 번. 처음 두 세척을 수집하고 유독성 폐기물 용기에 넣습니다. </li><li> 미세 핀셋을 사용하여, 홀더로부터 조직 샘플을 제거한다. 이 작업이 완료 될 때 아세톤으로 젖은 샘플을 유지하고 파괴 샘플을 피하기 위해 매우 조심스럽게 작동합니다. 참고 : 그것은 드문 일이 아니다 그것은 실제로 효모 붙여 넣기이 시점에서 멀리 샘플에서 가을이 유용​​ 할 수 있습니다. 잎 조직은 여전히​​ 녹색 동안 효모 페이스트는 일반적으로 매우 어두운 갈색이다. </li><li> 아세톤을 함유 cryovials에서 샘플을 수집합니다. 일반적인 프로토콜에 따라 TEM에 대한 샘플 준비 (침투 및 포함)를 진행합니다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 프로토콜의 성공은 사용자에 크게 의존한다. 첫째, 고급 준비가 필요한 모든 재료가 쉽게 사용할 수 전체 HPF-QFS 실행을 완료 할 수있는 충분한 양에 있는지 확인해야합니다. 둘째, 따라서 사용자는 조직의 고유 상태의 변경을 최소화 시료 처리를 최소화하는 효율적인 방식으로 공정 간 이동 단계에서 신속하게 작동한다. 샘플은 동결하고 탈수되기 전에주의를 실수로 예를 들어, 샘?...

세포 미세 구조에 대한 지식은 몇 나노 미터 (1)의 범위에서 상세 해결할 수 전자 현미경, 주로 온다. 샘플 준비 시간과 노력이 많이 소요된다고 프로토콜을 필요로하며, 실천에서 약간의 전문 지식을 필요로 해상도 TEM에 강력에도 불구하고, 사용자 친화적으로 간주되지 않습니다. 샘플의 전통적인 고정 수지에 삽입 한 후 다음 중금속 묻 얇은 섹션을 생산하는 단면, 탈수가 포함되어 추가 처리 전에 알데히드 및​​ 산화 오스뮴의 사용을 결합했다. 그러나, 화학 고정 궁극적 여러 셀룰러 구획이 멤브레인에 영향을주는 단백질 응집 및 지질 (1)의 손실, 및 변화를 포함 아티팩트를 생성 할 수 있다고 알려져있다. 이러한 아티팩트는 주로 상온 3, 4, 5로 고정 및 탈수 느린 레이트에 기인한다. 7. HPF가 감소, 20도에서 물의 빙점을 낮추는 얼음 결정의 핵 생성 및 성장을 느리게 및 세포 성분이 본질적 6 고정화되도록 생물학적 샘플에서 물의 점도를 증가 시킨다는 것이다 밀리 초 단위로 매우 높은 압력 (210 MPA는 또는 2100 줄)에서 액체 질소의 그것과 샘플의 온도. 제대로 완료되면 HPF 세포 미세 구조에 큰 손상을 일으킬 수 있습니다 대형 얼음 결정의 형성을 방지 할 수 있습니다. HPF는 생체 (7)의 전형적인 용질 농도로 100-200 μm의 두께의 샘플을 고정하기 위해 사용될 수있다. HPF, 예를 들어 1, 7, 8을 기본 수많은 물리학에 대한 리뷰와 원칙이 있습니다. HPF 후, 샘플은 -90 낮은 온도에서 (-78.5 ° C를 배양일반적으로 몇 일 동안 산화 오스뮴과 같은 액체의 유기 용매를 함유하는 화학 고정 제의 존재 하에서 C) # 176. 이 저온에서, 샘플은 물, 유기 용매, 통상적으로 아세톤, 메탄올 또는 1, (9)에 의해 대체된다. 따라서,이 프로세스가 호출 동결 치환 (FS). 샘플을 서서히 가온하고이 시간 동안 보통 산화 오스뮴과 우라 닐 아세테이트 (9), 고정된다. 저온에서 가교 결합을 고정화 한 분자를 고정하는 장점을 갖는다. FS 따라서이 개선 된 미세 보존 결과 특히 실온에서 기존의 화학 고정에 의해 고정와 비교 우수한 품질, 항원을 더 잘 보존 샘플을 생산하고 언 바운드 세포 성분 10, 11의 손실을 감소시켰다. 대부분의 FS는 일반적으로 몇 일까지 장기간에 걸쳐 수행된다. 이것은 특히 TRU 인식물 시료 12, 13, 14에 대한 전자. 맥도날드와 웹이 개발 한 최신 프로토콜은 크게 몇 시간 15 몇 일에서 FS의 시간을 줄일 수 있습니다. 슈퍼 빠른 FS에서 (SQFS) 샘플 90 분 안에 처리되는 동안 자신의 빠른 동결 치환 (QFS) 절차에서는 FS는 3 시간에 걸쳐 실시된다. 이러한 방법에 의해 생산 된 샘플의 품질은 전통적인 FS 프로토콜에 의해 수득 된 것과 대등하다. 우리는 HPF 후 식물 시료의 하류 처리 QFS 프로토콜을 채택했다. QFS 및 SQFS 대신에 비용이 많이 드는 시판 FS 기계의 일반적인 실험 장비를 사용할 때이 시간뿐만 아니라 돈뿐만 아니라 저장 입증되었습니다. 식물 조직은 종종 TEM을 준비하는 것은 매우 도전이다. 평균적으로, 식물 세포는 세균이나 동물의 세포 하나보다 큰. 소수성 왁스 표피 두꺼운 셀 벽, 유기산, 가수 분해 및 페놀 C를 함유하는 큰 물이 채워진 액포의 존재ompounds 즉 전체 세포 부피 (16)의 90 %까지 점유 할 수 있고, 통기 공간의 존재는 심각한 시스템 (17)의 열 전도성을 감소시킨다. 또한, 식물의 경우, 샘플 두께는 거의 항상 20 μm의 화학적 고정의 사용 한계를 초과한다. 이러한 두께에서, 물의 낮은 열전도율은 시료의 중심에 동결 속도보다 더 -10,000 ° C / sec의 방지한다. 즉, 환율을 손상 육각형 얼음 형성 (낮은 밀도의 얼음 결정 및보다 큰 10-15 나노 미터)를 방지하기 위해 필요 8. 이와 함께 샘플 및 후속 FS 모두 적절한 동결 이러한 본 과제. 그럼에도 불구하고, cryofixation 식물 샘플을 고정하기위한 가장 좋은 방법입니다. 여기에서 식물 조직 샘플의 HPF-QFS위한 프로토콜이 제시된다. 이 모델 종 애기 장대에 초점을 맞추고, 또한 Nicotiana의 benthamiana와 함께 사용되어왔다. 전형적인 결과는 HPF-QFS는 SA를 생성 입증짧은 시간에 전통 HPF-FS에 필적하는 품질의 mples. 적절한 조정으로,이 프로토콜은 또한 다른 비교적 두꺼운 생물학적 시료에 사용될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1070">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:245px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">HPF02</td>
			<td>With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display&#160; of freezing parameters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">241-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Specimen carriers, P=1000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B</td>
			<td style="width:245px;">Technotrade International, Inc</td>
			<td style="width:119px;">242-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20</td>
			<td style="width:245px;">Chart</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Baker&#39;s yeast</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Tooth picks</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Thermocouple data logger EL-USB-TC</td>
			<td style="width:245px;">OMEGA Engineering Inc.</td>
			<td style="width:119px;">OM-EL-USB-TC&#160;</td>
			<td>Replacement battery purchased separately</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Temperature probe</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">34505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Heater block 12/13 mm</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Rotary shaker</td>
			<td style="width:245px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-402-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Leaf punch - Harris Uni-core 2.00</td>
			<td style="width:245px;">Ted-Pella Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Pink dental wax</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Cryogenic vials 2 mL</td>
			<td style="width:245px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">61802-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Methanol</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Blow dryer</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Dry ice</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Acetone</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:539px;">Forceps</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Several pairs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy

1940의 투과 전자 현미경 (TEM)이 생물학적 물질의 초 고해상도 이미지로 생물을 제공하고 있기 때문이다. 그러나 때문에 또한 잡티 무료 샘플의 준비 경험을 요구 힘들고 시간이 많이 소요되는 프로토콜로, TEM은 사용자 친화적 인 기술로 간주되지 않습니다. TEM 용 샘플 준비 전통적인 셀룰러 구조를 보존하는 화학 고정 제를 사용했다. 고압 동결시켜 세포 미세 구조의 완전성에 불리하다 얼음 형성을 제한하는 매우 빠른 냉각 속도를 생성하기 위해 높은 압력 하에서 생물학적 시료의 cryofixation이다. 고압 냉동 동결 치환은 현재 TEM에 대한 수지 부분에서 최고 품질의 형태를 생산하는 선택의 방법이 있습니다. 이러한 방법은 일반적으로 얇은 부분의 TEM에 대한 기존의 처리와 관련된 유물을 최소화 할 수 있습니다. cryofixation 후 샘플에 얼어 붙은 물이 액체로 대체된다낮은 온도에서 유기 용매, 공정은 동결 치환했다. 동결 대체는 일반적으로 전용, 비용이 많이 드는 장비 며칠 동안 실시한다. 최근의 혁신 대신 보통 이틀, 처리 3 시간에 완료 될 수있다. 이것은 일반적으로 침투와 단면 전에 에폭시 수지에 삽입을 포함 샘플 준비의 더 몇 일 뒤에. 여기에서 우리는 식물 샘플 고정이 시간 내에서 수행 할 수 있도록 고압 동결 빠른 동결 대체를 결합하는 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 쉽게 다른 조직 또는 유기체 작업에 적용 할 수 있습니다. 식물 조직 때문에 물이 얼음이없는 동결을 방해 화난 공간과 물이 채워진 공포의 존재의 특별한 관심사이다. 또한, 화학 물질의 정착 과정은 조직 내 깊은 곳으로 화학 물질의 침투를 방해 셀 벽으로 인해 공장에서 특히 길다. 식물 조직 따라서 partic 아르ularly 도전,이 프로토콜은 신뢰성과 최고 품질의 샘플을 생산하고 있지만.

아래에 제시 결과 HPF에 대한 Wohlwend 소형 02 (그림 1A)를 사용하여 얻어졌다. 이 기기의 하나의 중요한 이점은 표본 담체 및 그 소유자의 사용의 용이함이다. 다른기구를 사용할 때, 맥도날드 두 사용자가 다른 동결을 수행하고 FS에 전송 9 cryovials 동안 샘플을 준비하는 샘플 준비 및 HPF 번을 수행 할 것을 권장한다. 그러나 Wohlwend 캐리어 홀더가 단일 사용자가 독립적으로 (?...

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Tandem High-pressure Freezing and Quick Freeze Substitution of Plant Tissues for Transmission Electron Microscopy

Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

탠덤 고압 냉동 및 투과 전자 현미경을위한 식물 조직의 빠른 동결 교체

Since the 1940s transmission electron microscopy (TEM) has been providing biologists with ultra-high resolution images of biological materials. Yet, ...

tandem-high-pressure-freezing-quick-freeze-substitution-plant-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

16.3K 조회수.  University of Tennessee, Knoxville. Obtaining high-quality transmission electron microscopy images is challenging, especially in the case of plant cells, which have abundant large water-filled vacuoles and aerated spaces. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution greatly reduce preparation time of plant samples for TEM while producing samples with excellent ultrastructural preservation.

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated to generate a carbon/platinum &#8220;cast&#8221; intended for examination by transmission electron microscopy. Specimens are subjected to ultrarapid freezing rates, often in the presence of cryoprotective agents to limit ice crystal formation, with subsequent fracturing of the specimen at liquid nitrogen cooled temperatures under high vacuum. The resultant fractured surface is replicated and stabilized by evaporation of carbon and platinum from an angle that confers surface three-dimensional detail to the cast. This technique has proved particularly enlightening for the investigation of cell membranes and their specializations and has contributed considerably to the understanding of cellular form to related cell function. In this report, we survey the instrument requirements and technical protocol for performing freeze-fracture, the associated nomenclature and characteristics of fracture planes, variations on the conventional procedure, and criteria for interpretation of freeze-fracture images. This technique has been widely used for ultrastructural investigation in many areas of cell biology and holds promise as an emerging imaging technique for molecular, nanotechnology, and materials science studies.

Basic techniques and refinements of freeze-fracture processing of biological specimens and nanomaterials for examination by transmission electron microscopy are described. This technique is a preferred method for revealing ultrastructural features and specializations of biological membranes and for obtaining ultrastructural level dimensional and spatial data in materials sciences and nanotechnology products.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

연구

생물학

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we describe a technique for studying the supramolecular organization of photosynthetic (thylakoid) membranes within leaf samples. This is achieved by high-pressure freezing of leaf tissues, freeze-fracturing, double-layer coating and finally cryo-SEM imaging. Use of the double-layer coating method allows acquiring high magnification (&#62;100,000X) images with minimal beam damage to the frozen-hydrated samples as well as minimal charging effects. Using the described procedures we investigated the alterations in supramolecular distribution of photosystem and light-harvesting antenna protein complexes that take place during dehydration of the resurrection plant Craterostigma pumilum, in situ.

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

알아내는 주사 전자 현미경에 의해 동결 골절 잎 조직 내에서 광합성 멤브레인의 초분자 조직을 공부

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and spatial resolution on the order of ms and nm, respectively. We have developed a time-resolved electron microscopy technique, &#34;flash-and-freeze,&#34; that induces cellular events with optogenetics and visualizes the resulting membrane dynamics by freezing cells at defined time points after stimulation. To demonstrate this technique, we expressed channelrhodopsin, a light-sensitive cation channel, in mouse hippocampal neurons. A flash of light stimulates neuronal activity and induces neurotransmitter release from synaptic terminals through the fusion of synaptic vesicles. The optogenetic stimulation of neurons is coupled with high-pressure freezing to follow morphological changes during synaptic transmission. Using a commercial instrument, we captured the fusion of synaptic vesicles and the recovery of the synaptic vesicle membrane. To visualize the sequence of events, large datasets were generated and analyzed blindly, since morphological changes were followed in different cells over time. Nevertheless, flash-and-freeze allows the visualization of membrane dynamics in electron micrographs with ms temporal resolution.

We developed a novel technique in electron microscopy, &#34;flash-and-freeze,&#34; that enables the visualization of membrane dynamics with ms temporal resolution. This technique combines the optogenetic stimulation of neurons with high-pressure freezing. Here, we demonstrate the procedures and describe the protocols in detail.

플래시 및 동결 : 전자 현미경으로 막 역학을 캡처하는 소설 기법

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The contents and morphology of the secreted vesicles reflect cell behavior or physiological status, for example cell growth, migration, cleavage, and death. The exosomes&#39; role may depend highly on size, and the size of exosomes varies from 30 to 300 nm. The most widely used method for exosome imaging is negative staining, while other results are based on Cryo-Transmission Electron Microscopy, Scanning Electron Microscopy, and Atomic Force Microscopy. The typical exosome&#39;s morphology assessed through negative staining is a cup-shape, but further details are not yet clear. An exosome well-characterized through structural study is necessary particular in medical and pharmaceutical fields. Therefore, function-dependent morphology should be verified by electron microscopy techniques such as labeling a specific protein in the detailed structure of exosome. To observe detailed structure, ultrathin sectioned images and negative stained images of exosomes were compared. In this protocol, we suggest transmission electron microscopy for the imaging of exosomes including negative staining, whole mount immuno-staining, block preparation, thin section, and immuno-gold labelling.

This protocol describes the various techniques necessary for transmission electron microscopy including negative staining, ultrathin sectioning for detailed structure, and immuno-gold labelling to determine the positions of specific proteins in exosomes.

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.