This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

동결 골절 / 냉동 에칭을위한 생물 표본의 1 준비 <ol><li> 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 기존의 EM 고정 제 제제와 같은 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde) + 2 % 파라 포름 알데히드를 사용합니다. 생체 조직의 기본 고정을 수행 할 수 있습니다. 참고 : 전에 고정하지 않고 표본의 몇 가지 유형을 동결하는 것이 바람직 할 수 있지만, 보편적 인 혈액 매개 병원균주의 시편은 인간의 조직으로 구성되어 적절한 고정을 의무화. </li><li> 기본 고정에 따라, 더 이상 하나 이상의 시간 동안 0.2 M 자당으로 보충 같은 버퍼에 시편을 씻어. </li><li> 1 시간보다 더 0.1 M 인산염 완충액에서 25 % 글리세롤로 이루어진 동결 방지제 용액에 시편을 전송. </li></ol> 동결 골절에 앞서 2 냉동 및 검체의 보관 <ol><li> 적절한 크기와 시편 형상의 선택 금 또는 구리 시편 스텁이 처리되고 (그림 4 </st룽&gt;). </li><li> 미세 등급 겸자 및 / 또는 금속 시편 스텁 위에 시험편의 작은 게이지 주사기 바늘 위치 작은 조각을 사용. <ol><li> , 스티커로 시험편의 액체 함량을 감소 약간 여과지와 스터브의 가장자리에서 액체를 그려서 일관성 같은 접착제. </li><li> 단일 복제본 스텁에 조직의 마운드를 만드는 작은 게이지 주사기 바늘을 사용합니다. 이중 복제본 들어, 정확하게 스텁 위에 다른 스터브와 위치를 반전하고 샌드위치 (도 5a)을 생성 시험편 표면에 가볍게 놓는다. 이 스텁 사이에서 밖으로 표본을 누르지 마십시오. </li></ol></li><li> 액체 질소와이 절연 듀어 혈관을 입력합니다. 주 : 제 용기는 시판 실린더 (도 5b)에서 프로판 가스의 작은 부피를 액화하는 데 사용되는 작은 잘 함유 금속 포스트를 수용한다. 두 번째 선박에 대한 간단한 선박을 들고 / 파티션 스토리지입니다만민은 액체 질소에서 냉동 표본을 유지. <ol><li> 프로판 웰에 위치하는 실린더 노즐을 사용하여, 실린더 밸브를 열고 가스가 액화되는 제 용기에 잘 흐르게. 참고 :주의! 프로판은 접촉시 부상을 동결 초래할 수 있습니다, 폭발하고, 질식입니다. 그러한 사용은 낮은 온도에 대한 보호 의복을 사용하여, 또한 외부 점화원을 피하기 위해주의하면서 적절한 환기를 유지하기위한 인증 화학 후드에서 프로판을 사용합니다. </li><li> 가능한 한 빨리, 시편은 미세 학년 집게 마운트하고 신속하게 액체 질소의 제 2 유지 용기 (그림 5B)로 전송 몇 초 동안 첫 번째 용기에 액화 가스로 뛰어 픽업. </li><li> 표본이 고정되면, 준비가 될 때까지 액체 질소에서 저장소는 동결 골절 공장으로 전송합니다. 확장을 위해 큰 저장 액체 질소 듀어 병 컨테이너 스텁을 전송원하는 경우,하지만 상관 저장 스텁 해동 허용하지 않도록주의해야한다. </li></ol></li></ol> 동결 골절의 3 조작 기기 및 시료 처리 <ol><li> 황동 홀더와 챔버로 표본을로드 <ol><li> 책자 형 더블 복제 시편 홀더에 금 표본 스텁을로드 또는 액체 질소 하에서 장치를 고정하고 시료 챔버 (그림 6)에 배치 할 준비가있을 때까지 유지한다. </li><li> 챔버는 높은 진공 (약 2 × 10-6 밀리바)를 달성하고 스테이지 액체 질소 온도까지 냉각되면, 펌프를 끄지 챔버를 배기하고, 가능한 한 신속하게 시료 테이블 상에 탑재 된 시료 스텁 위치 . </li><li> 펌프를 켜고 고진공을 다시하고 마이크로톰 팔과 BRI에 표본 테이블 -100 ° C로 온도와 직접 액체 질소를 조정하는 전자 무대와 팔 온도 컨트롤을 사용하여액체 질소 온도로 겨. </li></ol></li><li> 파괴 과정 <ol><li> 액체 질소 온도에서 고진공, -100 ºC의 스테이지 온도 마이크로톰 아암을 달성하면, 원격으로하여 시편 마운트에 시험편을 파쇄 이중 복제본 시편 홀더를 열고 (동결을 fracture_movie1.mov). </li><li> 에칭 다음 골절위한 시편의 경우, 면도 마이크로톰 아암에 클램프 유지 면도날을 사용하여 (즉, 파단) 단계 3.2.1 대신 시험편의 표면 (동결을 etch_movie2.mov). </li><li> 추가 동결 에칭 공정이 수행 될 경우, 몇 분에 하나 파 단면 위에 냉각 마이크로톰 아암 위치. 참고 : 절단면의이 작전은 승화 (즉, 에칭) 물입니다. 이 기동의 효과는 FRA에 더하여, 물의 승화 진정한 세포 표면, 세포 외 기질, 및 / 또는 분자 어셈블리를 공개하는 것이다가능한 화상은 세포막의 지질 이중층을 통과 직면 해있다. </li></ol></li><li> 금속 음영 및 복제 지원 증발 전자총을 사용 <ol><li> 백금 / 탄소 전자 또는 저항 총을 활성화하고 30 °의 각도에서 골절 표면에 백금 / 탄소의 얇은 층 (약 2 nm의) 증발 할 수 있도록 - 45 °. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다. </li><li> 단계 3.3.1에서와 같이 탄소 또는 전자 총 저항을 활성화하고 복제본에 지원을 제공하기 위해 직접적으로 부하 (90도)에서 프랙 시험편 표면에 탄소 박막을 증발. 20 초 -이 문제는 보통 약 15이 필요합니다. </li></ol></li><li> 복제본의 검색 <ol><li> 복제 음영 탄소 안정화 완료되면, 진공 펌프를 해제 벤트 챔버와 시료가 탑재 기기로부터 제거한다. </li><li> 미세 등급 포셉 쌍을 사용하여 이중에서 각 금 시험편 스텁을 제거복제 책자 / 클램프 조심스럽게 자리 플레이트 (그림 7)에 물 표면에 스텁을 낮추는 전에 몇 초 동안 해동 할 수 있습니다. NOTE : 물 표면에 뜬다 접착 시험편 재료를 함유 탄소 / 백금 복제본. </li><li> 미세 와이어 루프 또는 미세 등급 집게 몇 시간에 한 50 % 황산에서 5 % 중크롬산 나트륨을 함유하는 다른 스폿 판에 전사에 의해 유지 종래의 구리 전자 현미경 그리드를 사용 복제본 책략. 참고 :이 화장실은 복제본에서 실제 생물 표본 자료를 소화. 전체 강도 가정용 표백제는 중크롬산 염 / 황산 용액 대신 할 수있다. </li><li> 소화가 완료되면, 깨끗한 물 표면으로 다시 복제본을 전송 및 표준 구리 전자 현미경 격자 상으로 검색한다. (참고 : 복제본 소화하는 동안 작은 조각으로 조각 낼 수 있지만, 심지어 아주 작은 복제본 상당한 정보를 포함 할 수 있으며, RETR해야ieved 및 검사.)가 부드러운 핸들링 년 동안 안정적으로 유지 될 것입니다 시중에서 판매하는 그리드 상자에 그리드를 지원하는 저장 복제. </li></ol></li></ol> 동결 골절 / 에칭 복제본의 4 현미경 적 검사 <ol><li> 80 kV의 - 일반적으로 50 내지 가속 전압에서의 투과형 전자 현미경의 레플리카보기. </li><li> 표준 TEM 필름 또는 고해상도 디지털 카메라와 함께 관련 이미지를 기록한다. </li></ol>

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The author has nothing to disclose.

도입 및 상용화 다음 몇 년 동안, 동결 골절 / 에칭 과정은 널리 생물학적 막 구조의 연구에 활용 하였다. 실제로, 막 구조 전문의 일부 가장 관점 동결 골절 / 에칭 제제로 얻어졌다. 이러한 연구뿐만 아니라 세포막의 구조적 조직의 이해에 기여뿐만 아니라 구조와 기능이 관련되는 방법에 대한 통찰력을 제공했다. 루틴 생​​물학적 전자 현미경의 출현은 생물학적 시료에 ?...

개념 및 생물학적 시료의 동결 골절 처리의 실용적인 응용 프로그램은 한 세기 전 반 이상 스티어 (1)에 의해 소개되었다. 초기 장치는 작업 자체에 포함 된 유닛 하나에 서로 다른 구성 요소를 충당. 원래 장치는 개질 및 원격 조작, 고진공의 유지를위한 중요한 요구를 수용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 기기로 정제하고, 탄소 및 금속의 증발은 투과형 전자 현미경 (도 1 및도 검진 적합한 복제본을 생성시켰다 2). 전형적인 장비는 시료 테이블과 마이크로톰 팔 regulable 액체 질소 처리량을 갖는 (그림 1)과 높은 진공 챔버로 구성되어 있습니다. 챔버는 또한 시료 스테이지 90 ° 각도 plati위한 다른 위치에서 탄소 증발을 안정화 개의 전자총 번을 수납45 ° (그림 2) - 각도 조절, 일반적으로 15 °에 그림자 NUM / 탄소. 장치의 전원이 진공 펌프를 작동하기 위해 적용되며, 전자는 패널 온도 조정 및 전자총 제어를 조절한다. 원래 시험 및 세포막의 분석 및 그들의 전문이, 3 기술로서 더욱 인기를 얻고 골절 동결 바이러스의 개선 된 이미징을 달성하기위한 수단으로 생각. 사실,이 절차는 세포와 조직과 이러한 연구의 대부분은 세포 및 분자 생물학 4-9 고전적인 기여로 서의 구조 / 기능의 관계를 해명에 통합되었습니다. 동결 골절 기술의 개발을위한 주요 목표와 이론적 근거는 종래 생물학적 전자 현미경에 사용되는 화학 물질과 정착 처리에서 도출 전자 현미경 관찰 아티팩트 해상도를 제한하는 것이었다. 여기서의 목표는 화학을 제한하는 것정착 충분한 속도로 자주 얼음 결정 생성 등의 동결 아티팩트를 제한하기 위해서 동결 방지제의 존재 하에서 시험편을 동결하고. 최근,이 기술은 나노 입자와 나노 물질의 검사를위한 분자 생물학 및 재료 과학 연구자들의 관심의 부활을 발견했다. 골절을 동결하고 동결 에칭 이미지 입체 문자를 나타내고 때로 주사 전자 현미경으로 오인한다. 그러나, 동결 골절 제제는 투과 전자 현미경에 의해 검사하는 것으로 고해상도 형태 학적 연구에 큰 기여들은 세포막의 구조 / 기능 요소의 독특한 표현이다. 냉동 처리는 골절 및 / 또는 글리세롤과 같은 동결 방지제 처리제를 이용하여 얼음 결정을 제한하기에 충분한 속도로 세포와 조직을 동결에 의해 개시된다. 표본은 다음 진공 및 담당자 파단 아르리카는 골절 표면에 탄소와 백금의 증발에 의해 생성된다. 원래 시편은 표준 EM 표본 그리드에 검색되는 복제본에서 소화된다. 동결 골절 화상의 또 다른 일반적인 오해들은 세포 표면을 묘사한다는 것이다. 동결 골절의 기본 전제는 생체막가 파괴 과정 (그림 3)에 의해 지질 이중층을 통해 분할된다는 것입니다 그러나. 생체막에이 과정이 골절면, 세포에 인접한 막의 이분자 전단지의 절반을 계시 세포질, PF-면에 인접 멤브레인의 절반의 구성을 보여준다 하나, 하나를 얻을 적 환경, EF-얼굴입니다. 트루 세포 표면 동결 골절 이미지로 표현했지만 파괴 절차에 따라 동결 에칭 이후 추가 단계가 사용되는 경우에만 표시되지 않는다. 효과적으로 표면 detai을 공개하는 이전 파단 시험편을 에칭하기 위해서는리터는 표본은 빠른 속도와 unetchablecryoprotectant없이 고정해야합니다. 기본 기능을 드러내는 골절 시험편의 표면으로부터 물의 에칭 시험편 채 상기 스테이지 사이의 온도 차이를 생성 시험편 스테이지 위에 냉각 마이크로톰 아암과 표면으로부터 승화 물을 일으키는 냉각 마이크로톰 아암을 위치시킴으로써 달성된다. 물이 동결 에칭 기동 중에 골절 시험편의 표면으로부터 승화 될 경우, 실제의 세포 표면, 세포 외 기질, 세포 골격 구조, 분자 어셈블리의 양태는 높은 해상도로 밝혀 질 수있다. 따라서 동결 골절 및 에칭을 정지하면 교체 규정하지 않지만 오히려 후자는 어느 특정 연구의 요구에 따라 필요하거나 바람직하지 않을 단계별 과정을 반영한다. 골절 다음 동결 / 동결 에칭 절차, 파 단면이 지시 evapora을 실시복제에 대한 지원과 영상 대조를 제공하기 위해 탄소와 백금의 코트를 포지티브,. 백금 / 탄소 촬상 증발 단방향 또는 회전 될 수 있고, 저항 또는 전자총 중 하나에 의해 달성된다. 알려진 각도, 일반적으로 30 °에서 단방향 그림자 - 45 °는 특정 형태 계측 학적 계산을 수행하기에 유용하다. 깊은 에칭 대상이 된 표본은 일반적으로 그림자가 회전하고이 표본의 결과 이​​미지는 사진으로 평가를 위해 반전된다. 과거뿐만 아니라 동결 골절 / 동결 에칭 기술의 본 목적은 종래보다 투과 전자 현미경 절차와 관련된 아티팩트 시험편 화학 고정 및 처리를 제한 할 수있다. 그러나,이 기술 및 N, 입체 내용을 부여함으로써 생물학적 물질 과학에서 형태 계측 데이터의 수집을 용이하게하는 기능에 실질적인 이점을 제공한다anotechnology 표본. 골절 동결 및 동결 에칭 절차는 복잡하고 다면적이며, 그 응용 프로그램의 일부 측면은 사용자 정의됩니다. 이 프레젠테이션 방법의 주요 특징의 조사 뷰를 제공하며, 리더가 특정 요구에 대한 연구 과정을 상세 해결하고 정의하기 위해 광범위한 프로토콜 번역 10, 11로 지칭된다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

자연 표본, 일반적으로 생물 또는 나노 재료, 골절, 냉동 및 탄소 / 백금 &quot;캐스팅&quot;투과 전자 현미경에 의한 검사 대상을 생성하기 위해 복제된다 동결 골절 / 동결 에칭 프로세스에 대해 설명합니다. 시료는 액체 질소가 고 진공 하에서 냉각 온도에서 시편의 후속 파쇄와 종종 얼음 결정의 형성을 제한하는 cryoprotective 에이전트의 존재 ultrarapid 동결 속도로 실시된다. 결과 절단면 복제 및 캐스트에 표면을 세 차원 세부 사항을 부여 각도에서 탄소와 백금의 증발에 의해 안정화된다. 이 기술은 세포막과 전문 분야의 조사를 위해 특히 계몽 입증했다 및 관련 세포의 기능을 세포 형태의 이해에 크게 기여하고있다. 이 보고서에서 우리는 수행하기위한 장비 요구 사항 및 기술적 프로토콜을 조사동결 골절, 관련 용어 및 파괴 평면의 특성, 동결 골절 이미지의 해석에 대한 기존의 절차에 대한 변화 및 ​​기준. 이 기술은 널리 세포 생물학의 많은 지역에서 미세 구조 조사에 사용되는 분자, 나노 기술에 대한 새로운 이미징 기술 등의 약속을 보유하고, 재료 과학 연구되고있다.

동결 골절 화상 해석의 핵심 전제는 골절면이 규칙 PF - 얼굴 (플라즈마 골절면)와 EF-얼굴 (세포 외 골절면) (그림에 의해 호출이 골절의 얼굴을 부여하는 세포막의 지질 이중층을 통과한다는 것입니다 3). PF-얼굴 셀 EF-얼굴의 세포질에 인접 멤브레인 지질 이중층의 절반 엑스트라 셀룰러 인접 세포막 지질 이중층의 절반이다. 동결 골절 기술은 막 구조물의 조사에 특히 유?...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다.

생물 전자 현미경에서 동결 골절 / 동결 에칭의 기본 기술 요소

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.1K 조회수.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  기본 기술과 투과 전자 현미경에 의한 검사에 대한 생물 표본 및 나노 물질의 동결 골절 처리의 개선이 설명되어 있습니다. 이 기술은 미세 기능과 생체막의 전문을 공개 및 재료 과학 및 나노 기술 제품에 미세 수준의 차원과 공간 데이터를 얻기위한 바람직한 방법이다. 

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Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

연구

생물학

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

분열 효모 성적 라이프 사이클의 현미경

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

해양 tubeworm 인 라이브 광학 및 전자 현미경 기술을 사용하여 석회화 이벤트의 특성

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

고압 냉동, 전자 레인지를 이용한 콘트라스트 향상, 그리고 볼륨 이미지에 대 한 포함 하는 최소한의 수 지에 의해 생물학 견본 준비

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

The CryoAPEX Method for Electron Microscopy Analysis of Membrane Protein Localization Within Ultrastructurally-Preserved Cells

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise subcellular localization of proteins is thus important for answering many biological questions. The quest for a robust label to identify protein localization combined with adequate cellular preservation and staining has been historically challenging. Recent advances in electron microscopy (EM) imaging have led to the development of many methods and strategies to increase cellular preservation and label target proteins. A relatively new peroxidase-based genetic tag, APEX2, is a promising leader in cloneable EM-active tags. Sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) has also advanced in recent years with the advent of cryofixation by high pressure freezing (HPF) and low-temperature dehydration and staining via freeze substitution (FS). HPF and FS provide excellent preservation of cellular ultrastructure for TEM imaging, second only to direct cryo-imaging of vitreous samples. Here we present a protocol for the cryoAPEX method, which combines the use of the APEX2 tag with HPF and FS. In this protocol, a protein of interest is tagged with APEX2, followed by chemical fixation and the peroxidase reaction. In place of traditional staining and alcohol dehydration at room temperature, the sample is cryofixed and undergoes dehydration and staining at low temperature via FS. Using cryoAPEX, not only can a protein of interest be identified within subcellular compartments, but also additional information can be resolved with respect to its topology within a structurally preserved membrane. We show that this method can provide high enough resolution to decipher protein distribution patterns within an organelle lumen, and to distinguish the compartmentalization of a protein within one organelle in close proximity to other unlabeled organelles. Further, cryoAPEX is procedurally straightforward and amenable to cells grown in tissue culture. It is no more technically challenging than typical cryofixation and freeze substitution methods. CryoAPEX is widely applicable for TEM analysis of any membrane protein that can be genetically tagged.

This protocol describes the cryoAPEX method, in which an APEX2-tagged membrane protein can be localized by transmission electron microscopy within optimally-preserved cell ultrastructure.

초구조적으로 보존된 세포 내 막 단백질 국소화의 전자 현미경 분석을 위한 CryoAPEX 방법

Key cellular events like signal transduction and membrane trafficking rely on proper protein location within cellular compartments. Understanding precise ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.