이 프로젝트는 바덴 - 뷔 르템 베르크, 독일에 유럽 사회 기금에 의해 투자되었다.

필수 DNA 시퀀스를 코딩 포함하는 플라스미드 1. 확대 술 (CDS) <ol><li> 사전 따뜻한 실온으로 변환 키트에 포함되어 SOC 배지, 37 ° C, 100 ㎍ / ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트. 42 ° C의 물을 욕조를 평형. </li><li> 화학적 구성 요소 E. 중 하나 유리 병을 해동 얼음에 대장균. </li><li> 화학적 성분의 E. 바이알 내로 CDS 함유 플라스미드 1-5 μL (100 ng의 10 페이지)를 첨가 대장균과 부드럽게 섞는다. 피펫 팅하여 세포를 혼합하지 마십시오. 플라스미드를 추가 한 후, 부드럽게 튜브를 눌러 섞는다. </li><li> 30 분 동안 얼음 혼합물을 품어. </li><li> 열 충격 E. 흔들림없이 물을 욕조에 42 ° C에서 30 초 동안 대장균. </li><li> 2 분 동안 얼음에 병을 놓습니다. </li><li> E.에 예열 SOC 매체의 250 μl를 추가 대장균은 세균 배양기에서 37 ° C에서 1 시간 동안 300 rpm에서 수평으로 박테리아를 흔들어. </li><li><html> 100 μL와 미리 예열하는 LB 아가 플레이트에 변환 믹스 150 μl를 확산 판을 반전 하룻밤에 37 ° C를 품어. </li><li> 콜로니가 표시되고 나면, 100 ㎍ / ㎖의 앰피 실린 5 ㎖의 LB 배지를 함유하는 15 ㎖의 배양 관에 각각 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종. 문화가 늦게 로그 또는 고정 단계가 될 때까지 300 rpm에서 진탕 37 ° C에서 하룻밤을 품어. </li><li> 형질 전환 된 E.의 장기 저장 용 콜라이, 피펫 cryovial으로 100 % 글리세롤 75 μl를. 세균 배양 (냉동 주식이 25 % 글리세롤을 포함한다)의 225 μl를 추가, 잘 섞는다 및 -80 ° C에서 cryovial를 저장합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 플라스미드 정제 키트를 사용하여 필요한 CDS를 함유하는 플라스미드를 분리. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 플라스미드 농도를 결정한다. </li><li> 20 μL의 분량을 준비하고 오랜 시간 동안 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol>플라스미드 삽입물 _title &quot;&gt; 2. 증폭 및 중합 효소 연쇄 반응에 의해 폴리 T 꼬리의 추가 (PCR) <ol><li> 참고 : PCR을 이용하여 증폭 시험 관내 전사 (IVT), 여기에 관심있는 CDS, eGFP는 대한 DNA 템플릿을 구하십시오. 동시에, 120 티미 딘 (T)의 폴리 T-꼬리는 T (120) 확장자 역 프라이머를 사용하여 삽입에 추가됩니다. 이에 의해, 생성되는 mRNA IVT 후 정의 된 길이의 폴리 A-꼬리를 얻었다. </li><li> 표 1에서 설명하는대로 PCR 혼합물을 준비합니다. </li><li> 완전히 반응 혼합물을 섞는다. NOTE : PCR 생성물은 4-5 IVT 반응에 사용될 수있다. IVT 용 DNA 템플릿 량을 증가시키기 위해, PCR 혼합물의 총 체적이 증가 될 수있다. 몇몇 PCR 튜브 각각 함유하는 100 ㎕의 PCR 혼합물을 PCR 생성물의 충분한 수율을 확보 할 수있다. </li><li> PCR 열 순환기에 튜브를 놓고 PCR 사이클링 프로토콜 (표 2)를 사용하여 PCR을 실행. </li><li> P는 정리20 ㎕의 뉴 클레아 제 -없는 물을 사용하는 DNA는 제조업체의 지침에 따른 용출 및 PCR 정제 키트를 이용하여 CR 반응. </li><li> 분광 광도계를 이용하여 DNA 농도를 측정한다. 참고 : 감지 DNA 농도가 약 300 ㎍ / ㎖의입니다. 따라서, 예상 총량은 ~ 6 μg의이어야한다. 다른 단백질에 대한 DNA의 양은 CDS의 길이에 따라 달라질 수 있으며, 플라스미드의 양은 PCR, 프라이머 어닐링 온도 및 싸이클 횟수에 사용. </li><li> 오랜 시간 동안 -20 ° C에서 DNA 동결 또는 IVT 직접 사용. </li></ol> 3. 조정 단계 : PCR 제품의 품질 <ol><li> DNA 겔 전기 영동에 의해 PCR 산물의 품질을 확인. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 젤 상자에 젤을 부어 콤을 설정하고 젤 응고 될 때까지 약 1 시간을 기다립니다. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 12 μL의 총 부피의 2 μL 6 배 로딩 버퍼 80-10,000 염기쌍의 DNA 사다리의 2 μL (200 NG) 및 PCR 제품의 200 NG를 각각 섞는다. </li><li> 조심스럽게 아가로 오스 겔의 우물에 DNA 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여, 1 시간 동안 100 V에서 아가 로스 젤을 실행합니다. </li><li> 이미징 시스템 (도 2)의 DNA 밴드를 시각화. </li></ol> 4. 시험 관내 전사 (IVT) <ol><li> NOTE는 : PCR 후, 플라스미드 인서트 증폭 및 폴리 T 꼬리 첨가된다. IVT 동안, 유전 정보는 DNA에서 RNA로 전사된다. 생성 된 mRNA의 성적 증명서는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용됩니다. </li><li> 의 RNase D와 작업 영역과 피펫을 청소오염 제거 솔루션입니다. 반응이 RNases와 혼합의 자주 사용하는 PCR 깨끗하고 무균 이중 필터 피펫 팁과 오염을 최소화하기 위해 장갑을 변경합니다. </li><li> 표 3에 기재된 바와 같이 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 준비한다. </li><li> 와동에 의해 철저하게 NTP / 캡 아날로그 혼합물을 혼합하고 짧게 스핀 다운. </li><li> 표 4에 기재된 바와 같이 IVT 반응 혼합물을 조립한다. </li><li> 부드럽게 피펫 팅 아래에 의해 철저하게 IVT 반응 혼합물을 섞는다. 이어서 튜브의 하단에 혼합물을 수집 짧게 PCR 튜브를 원심 분리기. </li><li> 써모에서 3 시간 동안 37 ° C에서 품어. 참고 : 최적의 배양 시간이 삽입 주어진 템플릿의 전사 효율의 길이에 따라 달라집니다. 짧은 삽입 (NT &lt;500)의 경우, 더 긴 배양 시간이 유리할 수있다. 경시 실험을 최대 수율을위한 최적의 배양 시간을 결정하기 위해 행해질 수있다. 따라서, exampl를 들어, IVT 반응을 설정즉, 1, 2, 3, 4, 6 시간, 밤새 인큐베이션하고 mRNA의 양을 결정한다. eGFP는 mRNA의 생성에 대한 시험 관내 전사의 동력학은도 3에 도시된다. </li><li> , 주형 DNA를 제거 IVT 반응 혼합물에 DNase의 1 μL (2 U / μL)를 추가하려면, 잘 혼합하고 37 ℃에서 15 분을 품어. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 40 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. NOTE : 검출 된 RNA의 농도는 약 1500 ㎍ / ml 일. 따라서, 예상 총량은 ~ 120 μg의이어야한다. 다른 단백질 합성의 mRNA 양 CDS의 길이와 IVT 사용되는 PCR 산물의 양에 따라 다를 수있다. </li></ol> 남극 인산 가수 분해 효소 정제 된 mRNA를 5. 치료 <ol><li> 참고 : 생성 된 mRNA의 5를 제거하기 위해 포스 파타 아제로 처리 &#39;트라이면역 활성화에 RIG-I에 의해 인식 이어질 수 있습니다 인산염. 또한, 인산 처리는자가 결찰 반응에 다시 회람을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 정제 된 mRNA의 솔루션의 79 μL에 10 배 남극 포스 파타 아제 반응 버퍼 9 μl를 추가합니다. 그 후, 남극 포스 파타 아제 (5 U / μL)의 2 μL를 추가하고 부드럽게 샘플을 섞는다. 30 분 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 인큐베이션. </li><li> 제조자의 지시에 따라 RNA 정제 키트를 사용하여 반응 혼합물을 정제 하였다. 50 ㎕의 뉴 클레아 제 무 물로 2 회 스핀 컬럼 막으로부터 수정의 mRNA를 용출. </li><li> 분광 광도계를 사용하여 변형 된 mRNA의 농도를 측정한다. 260 nm의 체크인 / 280 nm에서의 흡광도의 비율 (A (260) / A (280)) ≥ 1.8 내지 260의 비율 / A (230)의 순도를 나타내는, 인을 2.0이라고. 참고 : 예상 총 생산량은이 sufficie이며, 약 90 μg의해야NT 약 36 mRNA의 형질합니다. </li><li> 클레아없는 물을 첨가하여 100 ng의 / μL로의 mRNA의 농도를 조정. </li><li> -80 ° C에서 형질 및 저장에 필요한 일회용 씩에 수정 된 mRNA의 나누어지는. 여러 동결 및 해동 사이클을 피하십시오. 제대로 준비하고 mRNA를 몇 년 동안 안정 저장됩니다. 작업하는 동안 항상 얼음에 수정 된 mRNA를 유지합니다. </li></ol> 6. 조정 단계 : 종합 된 수정 된 mRNA의 품질 <ol><li> RNA 겔 전기 영동에 의해 수정의 mRNA의 품질을 확인합니다. </li><li> 플라스크에 1 배 TBE와 아가로 오스의 원하는 금액을 섞는다. 1 % 아가 로즈 겔의 경우, 1 배의 TBE 50ml로 오스 0.5 g을 추가한다. </li><li> 아가까지 마이크로 웨이브가 용해된다. 이 비등하게하지 마십시오. 아가로 오스 용액에 완전히 있는지 확인합니다. </li><li> 50 ml의 아가 로스 젤에 5 μL 핵산 젤 얼룩을 추가합니다. </li><li> , 아가 로스 겔 상자에 겔을 붓고 빗 설정하고 겔 솔리 때까지 약 1 시간을 기다려dified. </li><li> 빗을 제거하고 젤 트레이에 젤 상자를 배치합니다. </li><li> 0.5 ~ 10 KB의 RNA 사다리의 3 μL (3 μg의)와 mRNA의 10 μL의 총 부피의 7 μL 로딩 버퍼 각각 수정하여 합성 200 NG를 섞는다. 로딩 완충액의 조성은 표 5에 기재되어있다. </li><li> 10 분 동안 70 ° C에서 사다리와 mRNA의 샘플을 변성시킨다. </li><li> 조심스럽게 사다리와 1 % 아가 로스 젤에서 mRNA의 샘플을로드합니다. </li><li> 버퍼를 실행으로 1X TBE를 사용하여 1 시간 동안 100 V에서 전기 영동을 수행합니다. </li><li> 젤 문서 시스템 (그림 4)를 사용하여 자외선 transilluminator가와 사진에 사다리와 mRNA의 밴드를 시각화. </li></ol> 7. 형질에 대한 세포의 준비 <ol><li> 12 웰 플레이트 잘 당 판 (2) X10 5 세포 (HEK293 세포). </li><li> 세포 배양기에서 37 ° C에서 밤새 세포를 부화. 참고 : 형질의 날에, 세포가 REAC해야한다80-90 %를을 hed. </li></ol> 8. 세포의 mRNA 트랜 수행 <ol><li> 수정 된 mRNA를 해동. </li><li> 형질 전환에 대한 리포 플렉스를 생성합니다. </li><li> 수정 mRNA의 25 μL (2.5 μg의) 내가 12 웰 플레이트 잘 하나의 형질 전환을위한 형질 전환 혼합물을 생성하는 혈청 배지를 감소 473 μL 옵티-MEM (최소 필수 중간)에 양이온 성 지질 형질 전환 시약의 2 μL를 추가합니다. 형질 전환되는 우물의 수에 따라 볼륨을 확장 할 수 있습니다. 음성 대조군으로, mRNA를하지 않고 형질 전환 혼합물을 제조. </li><li> 부드럽게 피펫 팅하여 컴포넌트를 섞는다. 형질 감염을위한 리포 플렉스를 생성하기 위해 20 분 동안 실온에서 형질 전환 혼합물을 인큐베이션. 참고 : 형질 전환 혼합물이 항생제가 포함되어 있지 않습니다. 따라서, 세포를 처리하는 동안 불임을 보장하기 위해주의를 기울입니다. </li><li> 500 μL의 DPBS와 세포를 씻으 / 웰. </li><li> 12도 괞 찮아 잘 하나에 형질 전환 혼합물 μL 500 추가테. </li><li> 37 ° C에서 4 시간, 5 % CO 2 세포를 부화. </li><li> 형질 전환 혼합물을 대기음 세포에 1 ml의에게 완전한 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 세포 배양기에서 24 시간 동안 세포를 품어. </li><li> 형광 현미경을 수행하면 형광 현미경 (도 5)를 사용하여 분석한다. NOTE는 : eGFP는 이외의 mRNA는 mRNA의 코딩에 의해 생성되는 형질 전환 세포에서 다른 단백질의 발현을 조사하기 위해서, 세포는 커버 슬립에서 배양 될 수있다. 이어서 형질 감염이 수행 될 수 있고, 세포를 적절한 항체로 염색하고 형광 현미경으로 분석 될 수있다. </li></ol> 세포의 eGFP는 표현의 9 유세포 분석 <ol><li> 웰로부터 세포 배양 배지를 제거하고 (칼슘 및 마그네슘없이) 1 ㎖의 DPBS로 각 웰을 세척 하였다. 세포 배양 플레이트의 표면으로부터 세포를 분리하는 웰 당 500 ㎕를 트립신 / EDTA를 추가한다. 계속해서, (500)을 추가μL TNS 당 잘 트립신을 비활성화합니다. </li><li> 실온에서 300 XG에서 5 분 동안 분리 된 세포를 원심 분리기. 만 펠렛을 떠나 뜨는을 제거합니다. 150 ㎕의 세포 고정액에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 유세포 튜브에 세포 현탁액을 전송. </li><li> eGFP는 발현 세포의 비율 및 평균 지오 (형광 강도의 기하 평균) (도 6)를 사용하여 형광 강도를 분석. </li></ol> 시간 이상 단백질 발현 10. 측정 <ol><li> 또한 단계 8에 기재된 바와 같이, 12- 웰 플레이트의 웰 (3)의 셀의 mRNA 트랜 수행 mRNA를 첨가하지 않은 형질 전환 혼합물로 HEK293 세포를 웰 3을 배양한다. </li><li> eGFP는 1, 2의 발현을 측정, 3 일 후 형질 전환 단백질 발현 (도 7)의 지속 기간을 평가. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

mRNA의 치료는 재생 의학, 질병 및 예방 접종의 치료 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 이 비디오는, 세포에서 단백질 발현의 유도를위한 안정화 된 변형의 mRNA의 생성을 보여준다. 이 프로토콜을 이용하여, 다른 원하는 mRNA를 생성 할 수있다. 변형 된 mRNA를 시험 관내 합성은 표적 단백질의 발현을 유도하는 것이 바람직 mRNA를 함께 세포의 형질 감염을 허용한다. 외생 전달 mRNA를 완전히 ...

세포에서, 전령 RNA의 전사 (mRNA의) 원하는 단백질 내로의 mRNA의 번역은 다음 셀의 적절한 기능을 보장한다. 유전 또는 획득 한 유전 질환 단백질의 부족과 장애 합성으로 이어질 심각한 질병을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 결함이 없거나 단백질의 생산을 유도하는 새로운 치료 방법은 세포 내로의 mRNA 합성의 개질 외인성 전달, 목적 단백질을 코딩이다. 이에 따라, 세포가 정상적으로 생성되지 않거나 자연적으로 필요하지 않을 기능 단백질을 합성하는 트리거됩니다. 이 방법을 사용하여, 유전 질환의 mRNA의 도입에 의해 보정 될 수없는 결함이 있거나 한 단백질을 코딩. mRNA의 치료는 또한 종양 세포 또는 병원체에 의해 발현 된 단백질 항원을 접종 synthetize하기 위해 사용될 수있다. 이에, 숙주 면역 시스템은 효과적으로 종양 세포를 제거하거나 infe을 방지하기 위해 활성화 될 수있다ctions 2,3. 또한, 최근에는 mRNA를 성공적으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기 위해 사용되었다. 이러한 목적을 위해, 섬유 아세포 리 프로그래밍의 발현이 4-6 인자 유도 및 재생 의학에 막대한 잠재력 iPSCs으로 변환하는 mRNA를 함께 형질 감염시켰다. 이전에, 종래의 mRNA의 사용은 낮은 안정성과 강한 면역 원성 연관되었다. 따라서, 기존의 mRNA의 임상 적용은 제한되었다. 그러나 Kariko과 동료의 mRNA 분자 내에 5 메틸 시티와 pseudouridine로 시티 딘과 딘의 교체는 생물학적 유체 안정의 mRNA 분자를 렌더링 극적으로 지금 수정의 mRNA의 임상 적용을 허용 면역 활성화 7-10 감소. 합성으로 생산 된 수정의 mRNA를 사용하여, 원하는 유전자 성적표는 일시적으로 생체 (11)에 전달 될 ​​수또는 시험관 내에서 단백질 발현을 유도한다. 도입의 mRNA는 세포 번역 기계에 의해 생리 학적 조건에서 변환됩니다. 인해 바이러스 유전자 치료 벡터에 비해 숙주 세포 게놈 내로 통합의 부족으로, 종양의 위험도 12,13 방지된다. 따라서, 수정 합성의 mRNA를 사용하여 치료 이후에보다 좋은 임상 승인을 얻을 것이다. 여기에, 우리는 수정 된 mRNA를 생산 (그림 1)의 mRNA와 세포와 형질 전환 된 세포에서 단백질 발현의 평가, 형질 전환에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1058">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:172px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:435px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Cell culture</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:157px;">PAA</td>
			<td>P11-010</td>
			<td>100x</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>M11-004</td>
			<td>200 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS without calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>PAA</td>
			<td>E15-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.04% Trypsin / 0.03% EDTA&#160;</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">TNS</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-41120</td>
			<td style="width:435px;">Trypsin Neutralizing Solution, 0.05% trypsin inhibitor in 0.1% BSA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK-293 cells</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Consumables</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tissue culture plates, 12-well&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Cell culture flask (75 cm2)&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">DNase-and RNase-free 1.5 ml sterile microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.589</td>
			<td>Safe-Lock, Biopur</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 ml conical tubes&#160;</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:295px;">PCR clean and sterile epT.I.P.S. dualfilter pipette tips&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;">10 &#181;l: 022491202,&#160;&#160;&#160; 100 &#181;l: 022491237, 1000 &#181;l: 022491253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryovial</td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>122279-128</td>
			<td>Cryo.s&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">14 ml polypropylene round bottom tube for bacterial culture&#160;</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plasmid amplification and purification</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA 3.3_eGFP Plasmid&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Addgene</td>
			<td>26822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">One Shot Top10 chemically component Escherichia coli&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C4040-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Sterile water (Ampuwa)</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td>1636071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB medium (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X968.1</td>
			<td>Dissolve 25 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">LB agar (Luria/Miller)&#160;</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X969.1</td>
			<td>Dissolve 40 g l-1 in sterile water.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ampicillin Ready Made Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>100 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mRNA production</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HotStar HiFidelity Polymerase Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>202602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAquick PCR Purification Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Methylcytidine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1014</td>
			<td>5-Methyl-CTP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pseudouridine-5&#180;-triphosphate&#160;</td>
			<td>Trilink</td>
			<td>N1019</td>
			<td>Pseudo-UTP</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:295px;">3&#180;-O-Me-m7G(5&#180;)ppp(5`)G RNA cap structure analog&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>S1411L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RiboLock RNase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EO0381</td>
			<td>40 U/&#181;l&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TURBO DNase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM1334</td>
			<td>2 U/&#181;l (from MEGAscript T7 Kit)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antarctic phosphatase&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>MO289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy mini kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transfection</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Cationic lipid transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Opti-MEM I Reduced Serum Media&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11058-021</td>
			<td style="width:435px;">Improved Minimal Essential Medium (MEM) with&#160; reduced Fetal Bovine Serum (FBS) supplementation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel electrophoresis</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelred Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>10,000x in water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">peqGOLD Range Mix DNA-Ladder&#160;</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>25-2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.5-10 kb RNA Ladder&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15623-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x TBE buffer</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow cytometry analyses</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CellFIX (1x)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>340181</td>
			<td>10x concentrate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:295px;">Primer for insert amplification and&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; poly (T) tail PCR</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;-TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Reverse Primer (HPLC-grade) 10 &#181;M</td>
			<td style="width:157px;">Ella Biotech</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>5&#180;- T120-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3&#180;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;"></td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Equipment</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Cell incubator</td>
			<td>Binder</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td>CO2 (5%) and O2 (20%)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CASY cell counter&#160;</td>
			<td>Sch&#228;rfe System</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;">Sterile workbench&#160;</td>
			<td style="width:157px;">BDK Luft-und Reinraumtecknik GmbH</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacterial incubator&#160;</td>
			<td>Incutec</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water bath</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ScanDrop spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Analytic Jena</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermocycler&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex</td>
			<td>peqlab</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus for electrophoresis&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel documentation system&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACScan System&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td style="width:172px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro synthesis of modified mrna for induction of protein expression in human cells

원하는 세포에서 단백질 합성의 유도 합성 메신저 RNA (mRNA의)를 코딩의 외생 배달 재생 의학, 기본적인 세포 생물학, 질병의 치료, 세포의 재 프로그래밍 분야에서 엄청난 잠재력을 가지고있다. 여기서 우리는 유동 세포 계측법에 의해 유도 된 단백질 발현의 감소 면역 활성화의 가능성과 안정성이 향상, 생산의 mRNA의 품질 관리, 세포의 형질의 mRNA와 검증과 수정의 mRNA의 생성 단계 프로토콜에 의해 단계를 설명합니다. eGFP는 mRNA의 단일 형질 전환 후 3 일까지, 형질 전환 된 HEK293 세포 eGFP는을 생산하고 있습니다. 이 비디오 문서에서, eGFP는 mRNA의 합성을 예로 들어 설명한다. 그러나, 절차는 다른 원하는 mRNA를 생산에 적용될 수있다. mRNA의 변성 합성을 사용하여, 세포를 일시적들이 정상적으로 발현하지 것이다 원하는 단백질을 발현하도록 유도 될 수있다.

eGFP는의 CDS를 포함하여 pcDNA 3.3 플라스미드를 사용하여, 수정 된 eGFP는 mRNA를 합성 (도 1)를 구축했다. PCR에 의한 삽입 증폭 및 폴리 T-미행 한 후, 약 1,100 bp의 길이의 명확한 밴드 (그림 2)을 검출한다. mRNA의 (그림 3)의 수율은 IVT 시간을 증강 증가. IVT 후, 약 1100 bp의 길이의 명확한 mRNA의 밴드가 생성 될 eGFP는 mRNA의 길이 (도 4)에 대응하는 검출되었다...

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In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다.

체외 합성에 인간의 세포에서 단백질 발현 유도의 mRNA를 수정의

The exogenous delivery of coding synthetic messenger RNA (mRNA) for induction of protein synthesis in desired cells has enormous potential in the fields ...

in-vitro-synthesis-modified-mrna-for-induction-protein-expression

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

24.8K 조회수.  University Hospital Tuebingen.  이 비디오 문서에서는, 우리는 세포에서 단백질 발현의 유도에 대한 수정의 mRNA의 체외 합성을 설명합니다. 

비디오: In Vitro Synthesis of Modified mRNA for Induction of Protein Expression in Human Cells

In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of the predominant imaging modalities to assess the restoration of the injured myocardium. Furthermore, ex-vivo labeling agents, such as iron-oxide nanoparticles, have been employed to track and localize the transplanted stem cells. However, this method does not monitor a fundamental cellular biology property regarding the viability of transplanted cells. It has been known that manganese chloride (MnCl2) enters the cells via voltage-gated calcium (Ca2+) channels when the cells are biologically active, and accumulates intracellularly to generate T1 shortening effect. Therefore, we suggest that manganese-guided MRI can be useful to monitor cell viability after the transplantation of hESC into the myocardium.
In this video, we will show how to label hESC with MnCl2 and how those cells can be clearly seen by using MRI in vitro. At the same time, biological activity of Ca2+-channels will be modulated utilizing both Ca2+-channel agonist and antagonist to evaluate concomitant signal changes.

In this video, we are showing how to label human embryonic stem cells (hESC) with manganese chloride (MnCl2) which can enter cells via voltage-gated calcium channels when the cells are biologically active. Additionally, we show the use of MnCl2 as cellular MRI contrast agent to determine the in vitro viability of hESC.

자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Human embryonic stem cells (hESC) have demonstrated the ability to restore the injured myocardium. Magnetic resonance imaging (MRI) has emerged as one of ...

연구

생물학

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

유기 용매 및 초산없이 쿠매시 G - 250로 젤의 단백질 염색법

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포로부터 인간 심장 엽 성의 전구 물질과 Cardiomyocytes의 효율 유도

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribosome 바운드 초기 Polypeptides의 분리<em&gt; 체외에서</em&gt; mRNA 함께 Translational 일시 중지 사이트를 식별하려면

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

배양 된 포유 동물 세포의 생물 학적 경로의 유비퀴틴과 유비​​퀴틴 같은 시스템 레귤레이터를 확인하는 siRNA를 상영

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...