이 프로토콜은 간단한 절차를 사용하여 전자 현미경에 가까운 분해능으로 신경근 접합부의 3D 구조를 정량적으로 분석하는 데 도움이 됩니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 근육 샘플이 컨포칼 및 STED 현미경을 위해 유사하게 처리되고 면역 표지되어 동물 모델에서 정확한 신경근 접합 구조 평가 시간을 단축한다는 것입니다. 우리가 개발 한 형태 학적 정량화는 다른 세포 하 구조를 분석하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
근육 놀림과 면역 염색이 어떻게 수행되는지 보여주고 이 프로토콜의 성공적인 적용을 위한 몇 가지 권장 사항을 제공할 우리 팀의 과학자인 Martina Marinello 박사를 소개하게 되어 기쁩니다. 공초점 및 STED 현미경을 사용한 이미지 획득 및 분석을 보여줄 Genethon의 이미징 플랫폼의 Jeremie Cosette 박사를 소개하게 된 것을 기쁘게 생각합니다. 안락사 후, 두 개의 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 약 1mm 너비의 작은 섬유 다발로 경골 전방 근육을 놀리기 시작합니다.
그런 다음 이 근육 다발을 PBS로 준비된 1%Triton X-100이 포함된 24웰 플레이트에 옮기고 실온에서 1시간 또는 섭씨 4도에서 5시간 동안 부드럽게 교반합니다. 샘플을 실온에서 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후, PBS에서 1%Triton X-100으로 제조된 4%BSA로 구성된 블로킹 용액으로 샘플을 부드러운 교반 하에 섭씨 4도에서 4시간 동안 배양합니다. 그런 다음 신경 섬유 M 또는 시냅스 소포 당 단백질 2에 대한 1 차 단일 클론 항체를 포함하는 동일한 차단 용액으로 샘플을 밤새 배양하여 시냅스 전 축삭 말단 또는 활성 영역을 각각 표지합니다.
다음날, 라벨이 붙은 근육 다발을 부드러운 교반하에 PBS로 5 분 동안 3 번 씻으십시오. 그런 다음 실온에서 2 시간 동안 쉐이커에 올려 적절한 2 차 항체와 함께 배양하십시오. 근육 번들을 다시 씻은 후 장착 매체가있는 슬라이드에 놓습니다.
그런 다음 상단에 1.5 등급 유리 커버 슬립을 놓은 다음 슬라이드 양쪽에 원통형 자석을 놓아 압력을 가하고 근육을 평평하게합니다. 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지를 획득하려면 현미경 소프트웨어를 실행하고 구성 모드로 기계를 선택하고 텍스트 원고에 언급된 설정에 따라 각 실험 그룹에서 신경근 접합부의 이미지 스택을 수집합니다. 세션이 끝나면 3D 뷰어에서 열기를 클릭하고 실험 그룹을 대표하는 신경근 접합부를 선택하여 3D 라벨링을 시각화합니다.
시냅스 후 신경근 접합부 및 플레이트 부피, 최대 강도 투영 영역 및 상대 비틀림을 계산하려면 신경근 접합부 부피 정량화를 위한 매크로를 이미지 J 창으로 끌어다 놓고 매크로가 두 번째 창에서 열리면 매크로 및 매크로 실행을 클릭합니다. 분석할 접합 하위 폴더가 포함된 기본 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다. 그런 다음 폴더 저장 팝업 메뉴에서 저장 폴더를 선택하고 선택을 클릭합니다.
이미지 유형이라는 새로운 팝업 메뉴에서 Z 스택 획득의 형식을 선택합니다. 관심 염색에 해당하는 RGB 채널을 선택하고 X, Y 픽셀 크기 및 Z 단계를 나타냅니다. 독점 파일 형식을 선택한 경우 매크로는 픽셀 크기와 Z 단계를 직접 읽습니다.
시냅스 전 신경 섬유 축적을 정량화하려면 신경근 접합부 축적 정량화를 위한 매크로를 Image J 창으로 끌어다 놓고 매크로 및 매크로 실행을 클릭합니다. 접합 하위 폴더, 스토리지 폴더 및 앞에서 설명한 대로 Z 스택 획득 형식을 선택합니다. 그런 다음 염색 정보 팝업에서 시냅스 전 및 시냅스 후 레이블과 색상을 표시하고 픽셀 크기 팝업 OK.In 클릭하고 X, Y 픽셀 크기를 0.072 마이크로 미터로, Z 단계를 0.5 마이크로 미터로 표시 한 다음 확인을 클릭합니다. 독점 파일 형식을 선택한 경우 매크로는 픽셀 크기와 Z 단계를 직접 읽습니다.
아세틸콜린 수용체 줄무늬 사이의 거리를 계산하려면 중앙 창 상단의 정량화 메뉴를 선택합니다. 도구 탭을 클릭하고 강도를 선택한 다음 선 프로파일 아이콘을 클릭합니다. 오버샘플링을 1로 설정하고 채널 정렬을 선택합니다.
프로젝트 열기 탭을 클릭하고 분석할 필터링된 이미지를 선택합니다. 그런 다음 선 그리기 아이콘을 클릭하고 여러 줄무늬 또는 접합 접힘을 수직으로 교차하는 선을 추적합니다. 첫 번째 피크의 상단을 클릭하고 다음 최대 피크에 도달할 때까지 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 마우스 포인터를 이동합니다.
두 피크 사이의 거리에 해당하는 DX 값에 유의하십시오. 오른쪽 창의 이미지에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 ROI 저장을 선택합니다. 화살표 아이콘을 클릭한 후 ROI를 클릭하고 휴지통 아이콘을 클릭하여 삭제합니다.
아세틸콜린 수용체 스트라이프의 너비를 계산하려면 도구 탭 아래의 왼쪽 상단 패널에서 강도를 선택하고 FWHM 결정 아이콘을 클릭한 다음 채널 정렬을 선택합니다. 그런 다음 프로젝트 열기 탭을 클릭하고 분석할 필터링된 이미지를 선택합니다. 그런 다음 오른쪽 창의 상단 메뉴에서 사각형 그리기 아이콘을 클릭합니다.
가로 또는 세로인 줄무늬를 선택하고 줄무늬에 수직으로 사각형을 그립니다. 중앙 창에 프로파일이 나타납니다. 왼쪽 패널에 있는 평균 투영 메뉴의 수직 또는 수평을 클릭합니다(스트라이프 방향이 수직 또는 수평인지에 따라 다름).
중앙 창에서 통계를 클릭하여 FWHM 값을 읽은 다음 이전에 설명한 대로 ROI를 저장하고 삭제합니다. 형광 알파-붕가로톡신으로 표지된 시냅스 후 모터 종판은 두 마우스 계통의 돌연변이체에서 더 작고 단편화된 것으로 나타났습니다. 맞춤형 Image J 매크로를 사용한 신경근 접합부 Z 스택의 정량화는 대조군과 비교하여 두 질병 마우스 모델에서 엔드 플레이트 부피, 최대 강도 투영 및 상대 비틀림의 현저한 감소를 나타냈으며, 이는 신경근 접합부 성숙 결함을 나타냅니다.
Image J 커스텀 매크로를 사용하여 시냅스 전 축삭 말단 가지 분포를 정량화한 결과, 면역표지가 증가한 두 동물 모델에서 신경섬유 M 분포의 변경된 패턴이 밝혀졌습니다. 시냅스 소포 당단백질 2 염색을 통해 Smn 2B/마우스에서 인접한 신경 말단 활성 영역을 갖는 아세틸콜린 수용체 함유 영역의 점유 비율이 43% 감소하는 것이 관찰되었습니다. 신경근 접합부 시냅스 후 말단 플레이트의 측면은 형광 알파-붕가로톡신 표지 및 강도 프로파일 분석에 의해 명확하게 시각화되었습니다.
신경근 접합 매개 변수를 평가 한 결과 돌연변이 체의 비복근 근육에서 접합 접힘 거리와 아세틸 콜린 수용체 줄무늬의 폭이 증가한 것으로 나타났습니다. 신뢰할 수 있는 결과를 얻으려면 근육을 적절하게 애타게 하는 것이 중요하며, 근육 다발을 분리하기 위해 적용된 강도에 특히 주의를 기울이십시오. 이 프로토콜은 이전에는 투과 전자 현미경과 같은 복잡하고 시간이 많이 소요되는 절차에 의해서만 설명되었던 신경근 접합부의 보다 심층적인 형태학적 특성을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
STED 영상 절차는 신경근 접합부에 영향을 미치는 질병의 병태생리학에 기여하는 시냅스 전후 마커에 관한 새로운 통찰력을 조사할 수 있는 길을 열었습니다.
