현미경 기반 분석법은 SNARE 인신매매를 사용하여 재활용 내시경을 연구하고 분석합니다. 이들은 피부 멜라닌세포입니다. 세포 내부에서 볼 수 있는 검은 색 세포기관은 멜라노솜이라고 합니다.
멜라노솜은 리소조메 관련 세포기관 또는 LRO라고 불리는 세포기관의 클래스로 알려져 있다. 재활용 내분은 초기또는 모든 세포 유형의 내모세포를 분류하는 관형 성구 세포기관입니다. 이 세포기관은 멜라노좀의 생물 발생에 중요한 역할을, 멜라노세포에 의해 생성 된 리소조메 관련 세포기관.
재활용 내분은 멜라닌세포별 화물을 형성하는 동안 조기 멜라노솜에게 전달합니다. 여러 증후군에서 관찰되는 재활용 내종의 생성은 피부, 모발 및 눈의 과색소 침착에 있는 세포입니다. 따라서, 재활용 내종의 역학을 연구하는 것은 정상 및 질병 조건에서 이러한 세포기관의 기능을 이해하는 데 유용하다.
이 연구는 SNARE 구문 -13을 체포하여 재활용 내역의 역학을 측정하는 것을 목표로합니다. 첫 번째 단계는 미리 처리된 커버립에 마우스 멜라닌세포의 파종입니다. 지하 멤브레인 매트릭스 매체에 페트리 접시에 유리 커버립을 코팅합니다.
그리고 조직 배양 후드에 15 분 동안 건조. 사용하기 전에 1X PBS로 커버립을 한 번 씻으시면 됩니다. 지하 막 에 세포를 시드 중코팅 커버립 50 받는 다 60%의 역량.
항상 완전한 RPMI 매체에서 도금 된 세포 현탁액에 PMA의 200 나노 몰라를 추가하십시오. 세포를 파종한 후 CO2 인큐베이터에 세포를 함유한 접시를 12~24시간 동안 배양한다. 두 번째 단계는 구문 -13 플라스미드를 가진 세포의 형질입니다.
DNA 및 트랜스페션 시약을 포함하는 팁을 배양하고 5 분 동안 혼합하고 반복된 파이펫팅없이 섞습니다. 실온에서 30분 동안 10분마다 손으로 튜브를 누릅니다. 인큐베이션 하는 동안, 1X PBS와 함께 두 번 세포를 세척, 한 번 OPTI-MEM, 다음 세포에 OPTI-MEM의 1 마일을 추가.
인큐베이션의 30 분을 게시, 접시를 덮음 현명한 방식으로 세포에 경질 시약 DNA 믹스를 추가합니다. 6 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. CTI-MEM 배지를 트랜스페트 시약으로 흡인하고 PMA의 200 나노몰라로 보충된 완전한 RPMI 배지를 추가합니다.
48 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양하십시오. 세 번째 단계는 셀의 고정입니다. 다음 절차는 조직 배양 후드 외부에서 수행됩니다.
48시간의 트랜스펙트 후, 1X PBS로 세포를 두 번 씻은 다음 30분 동안 3%의 포름알데히드로 세포를 고정합니다. 고정 후, 1X PBS로 셀을 두 번 씻고 커버립을 1X PBS에 추가로 사용할 때까지 보관하십시오. 또는, 세포는 유리 판에 장착하거나 섭씨 4도에 보관할 수 있습니다.
네 번째 단계는 세포의 면역 염색이다. 습한 챔버를 준비합니다. 페트리 접시에 마우스 필터 용지에 파라필름 컷 조각을 놓습니다.
알루미늄 호일로 덮습니다. 1차 항체 용액의 25 마이크로리터를 준비합니다. 1에서 200까지의 희석에 항체를 추가합니다.
습한 챔버의 파라필름에 드롭으로이 솔루션을 추가합니다. 조심스럽게 집게로 커버 슬립을 들어 올립니다. 1 차적인 항체 염색 용액의 낙하에 그것을 반전하고, 그 후에 습한 챔버의 뚜껑을 덮습니다.
실온에서 30분 동안 배양하세요. 유사하게, 1-500의 희석에서 이차 항체 용액을 준비하고 습한 챔버의 커버슬립 옆에 있는 파라필름에 놓는다. 핵염색을 위해, 용액에 120, 000 ~ 130, 000의 희석에 DAPI를 추가한다.
집게를 사용하여, 조심스럽게 1 차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1X PBS에 두 번 찍어. 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거합니다. 습한 챔버에 이차 항체 염색 용액에 배치하고 용액에 형광염 염색 항체의 존재로 인해 빛에 노출시키지 않는다.
인큐베이션 후, 신중하게 이차 항체 용액에서 커버 슬립을 선택하고 1X PBS에 두 번 찍어. 또한, 티슈 페이퍼의 커버슬립을 탭하여 커버슬립의 초과 PBS를 제거한다. 이미징 시약 12마이크로리터를 유리 슬라이드에 놓고 스테인드 커버슬립을 장착 시약에 조심스럽게 배치합니다.
티슈 페이퍼의 유리 슬라이드를 반전한 다음 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 형광 현미경을 사용하여 커버슬립을 이미지화하고 ImageJ를 사용하여 이미지를 분석한다. 여섯 번째 단계는 재활용 내성 국소화 단백질과 멜라노솜 사이의 중첩의 정량화이다.
구문신-13 델타-129의 정량화는 멜라노솜과 공존한다. 마우스 야생형 멜라닌세포에서 구문신-13의 면역형 현미경검사는 GFP-구문신-13야생형을 정맥 및 관구조로 국소화하였다. 그리고 GFP-구문신-13 델타-129는 셀 표면 이외에 고리와 같은 구조를 국소화한다.
또한, 세포내 고리 같은 GFP-구문-13 델타-129는 밝은 필드 이미지 멜라노솜에서 멜라노솜 단백질 TYRP1과 공동화를 보였다. 앞서 나타낸 바와 같이, 과발현된 GFP-구문-13 야생형의 코호트가 멜라노솜에서 관찰된다. GFP-구문신-13 야생형및 GFP-구문-13 델타-129의 상대적 국소화를 멜라노솜에 측정하기 위해, 피지 소프트웨어가 사용되었고 JACOP 플러그인으로 분석이 이루어졌다.
측정 된 Mander의 중복 계수는 MOC이며, TYRP1을 가진 GFP-구문 -13 델타-129 사이의 은 TYRP1을 가진 GFP-구문 -13 야생 유형에 비해 약 1.5 배 더 높습니다. 흥미롭게도, TYRP1은 GFP-구문신-13 델타-129를 가진 2.9 배 더 높은 MOC 값을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 GFP-구문-13 델타-129 멜라노솜의 국소화가 꾸준한 상태에서 GFP-구문신-13 야생 유형에 비해 상대적으로 높다는 것을 나타낸다.
구문신-13 야생형 의 정량화는 재활용 내종의 소중. GFP-구문-13 야생형의 면역형 현미경 검사는 알려진 재활용 내피 단백질 Rab11과 공존성을 보였다. mCherry-Rab11을 가진 GFP-구문-13 야생 타입 사이의 MOC는 GFP-구문-13 야생 타입을 가진 mCherry-Rab11에 비해 약 1.4 배 더 높습니다.
GFP-구문신-13 야생형 양성 내구의 수와 길이를 측정하기 위해, 피지 소프트웨어는 프로토콜 섹션에 기재된 바와 같이 사용되었다. mCherry-Rab11은 실험에서 양성 대조군을 사용한다. GFP-구문-13 야생형으로 전감염된 멜라노세포는 mCherry-Rab11을 발현하는 세포에 비해 세포당 튜벌레수가 더 많은 것으로 나타났다.
그러나, 튜브는 세포에서 GFP-구문-13 야생 형 및 mCherry-Rab11의 공동 발현시 감소된다. 일곱 번째 단계는 내모의 관 수와 길이를 재활용하는 정량화입니다. 튜브는 세포에서 GFP-구문-13 야생 유형과 mCherry-Rab11의 공동 발현시 감소된다.
흥미롭게도, GFP-구문-13 야생형과 mCherry-Rab11모두에서 평균 튜버 길이는 개별적으로 또는 함께 표현하는 세포에서 서로 비교된다. 이 데이터는 GFP-구문신-13 야생 유형이 Rab11과 유사한 내분모를 재활용하는 데 국한되어 있음을 시사합니다. 이 연구는 구문 -13 돌연변이의 N 단자 납품, 즉 GFP-구문 -13 델타-129, 멜라노솜 GFP-구문 -13 델타-129로 지역화하는 것은 아마도 세포 표면에 내분피를 재활용에서 vesicular 밀매에 기자로 사용할 수 있음을 보여주었다.
반면, GFP-구문신-13 야생형은 Rab11과 유사한 내모성 재활용에 국한됩니다. 이 연구는 GFP-구문신-13 야생 유형도 멜라닌 세포에서 재활용 내분법을 표시하는 데 사용될 수 있음을 보여 주었다. GFP-구문-13 야생 형은 Rab11이 내피 역학을 변화하기 때문에 Rab11보다 더 나은 재활용 내도 마커일 수 있습니다.
GFP-구문신-13 야생형은 안정된 상태 조건에서 역학을 연구하기 위해 잠재적인 재활용 내도 마커를 작용합니다.
