We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

다음 프로토콜은 혐기성 종, 경찰에 의해 침략을 배양하고 연구하는 방법을 설명합니다 진지 발리; 그러나, 이들 프로토콜은 혐기성 병원균에 사용될 수있다. HUVECs를 사용하고 있지만,이 프로토콜은 면역 및 비 면역 다른 진핵 세포 모두에 사용될 수있다. 1. 혐기성 상공 회의소 사용 및 유지 보수 참고 : P. gingivalis에이 주변 공기에서 발생하는 산소의 정상 수준에 민감 혐기성이다. 제어 혐기성 환경은 P.의 재배에 매우 중요합니다 진지 발리. <ol><li> 여기서, 무산소 혼합 가스 (80 % N 2, 10 % H 2, 2~10 %의 CO) 비닐 혐기 챔버에서 (도 1a)로 지정 인공 분위기를 유지한다. 혐기성 챔버 실험실 환경에서 항목을 전송하기위한 에어 록 (그림 1B)를 사용합니다. 에어 록 수동 TW를 운영혼합 된 혐기성 가스를 도입하기 전에 N2 가스와 얼음 퍼지. </li><li> 바람직 황화수소 무보수 제거 황화수소 제거 칼럼 (도 1C)를 사용한다. 촉매에 의해 생성 된 O H 2를 제거하고 오염의 확산을 촉진 에어로졸을 방지하기 위해 챔버 내에서 제습기를 놓습니다. 주 : 황화수소 많은 혐기성 세균의 천연 대사 부산물 및 축적은 세균에 독성이고 가전 손상되고, 촉매의 수명을 감소시킬 수있다. </li><li> 수소의 존재 (그림 1D)에서 산소를 제거하는 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 분위기를 순환 팬 상자를 사용합니다. 참고 : 순환 대기 (HEPA) 필터는 0.22 μm의 또는 더 큰 크기로 공기 중 오염 물질을 제거합니다. </li><li> 혐기성의 내부에 위치하는 37 ° C 배양기에서 배양 혐기성 세균방. 혐기성 챔버 내부에서 작업 할 때 표준 무균 기술을 사용합니다. </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> 그림 1. 혐기성 비닐 챔버와 그 구성 요소. (A) 대기 중 산소로부터 완전히 밀봉 된 비닐 혐기성 챔버는 한 번에 (32 X 78 년) 두 개인 작업 공간을 제공합니다. 그것은 (다시 중간) 37 ℃로 설정 인큐베이터가 포함되어 있습니다. (B)는 에어 록 혐기성 챔버로 실험실 환경에서 상품의 전달을 위해 사용된다. 사진은 자동적으로 혐기성 환경을 조성하기 위해 필요한 진공 및 퍼지 절차를 수행하도록 프로그램 될 수있는 제어기를 통해 작동 자동 출입구이다. (C) 황화수소 제거 컬럼은 바람직 황화수소 무보수 고용량 제거를 제공한다. (D)는 두 촉매 팬 박스 아르수소의 존재 하에서, 산소를 제거하고, 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 대기를 순환하기 위해 혐기 챔버에 걸쳐 두었다. 혐기성 챔버는 제조업체의 지침에 따라 설정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 혐기성 박테리아 2. 준비 참고 : P.을 진지 발리는 aerotolerant이고 호기성 조건에서 저장 될 수 있지만, 6 % (17, 18)보다 높은 수준의 산소의 존재하에 성장하지 않을 것이다. 혐기성 챔버의 P. 적절한 배양에 필요한 진지 발리와 다른 혐기성 종 (그림 1). 혐기성 실 사용에 대한 적절한 훈련과 교육은 microanaerobes 19을 사용하기 전에 필요합니다. <ol><li> 혐기성 CONDIT 모든 액체 매체와 판 평형적어도 12 시간 이전에 실험에 이온이 잔류 산소를 제거합니다. </li><li> P. 이동 혐기성 챔버 -80 ° C의 냉동고에서 진지 발리는 해동을 할 수 있습니다. </li><li> 킬 P. (TSA II 5 % 양 혈액) 트립 티카 간장 혈액 한천 플레이트에 진지 발리. 4~7일에 대한 혐기성 배양기에서 37 ℃에서 파라 필름과 가게에서 판을 바꿈. </li><li> P. 접종 3 ㎖ 뇌 심장 주입에 진지 발리는 (BHI) 국물은 멸균 루프를 사용하여, 헤민와 메나 디온, 혐기성과 까다로운 미생물의 분리 및 문화에 대한 풍부한 비 선택적 액체 매체와 보충. 주 : 장기 저장을 위해, -80 ° C의 냉동고에 글리세롤 또는 DMSO (10 내지 20 %의 최종 농도) 및 장소 BHI 준비 박테리아 문화를 섞는다. </li><li> P.의 스타터 문화를 준비 1:10 희석을하고 박테리아가 중반 로그 단계까지 성장 할 수 있도록하여 진지 발리. </li></ol> 참고 : 혈중 알코올 농도의 광학 밀도를박테 리아 현탁액을 판정하고 피검 각 균주 박테리아 농도를 조정한다. 피하십시오 진지 발리 미드 로그 상 및 7 ~ 8 × 106 세포 / mL를 0.7 OD (660)의 대응에 현탁. 프로토콜에 설명 된 성장 조건은 위의 피에 대한 특정 진지 발리와는 다른 균주에 적응해야 할 수도 있습니다. 3. 내피 세포 배양 주 : 매입은 제조업체의 지시에 따라 5 % CO 2에서 37 ° C에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 기본 배지에서 일차 배양 된 HUVECs 및 풀링. <ol><li> 15 ml의 VEGF 미디어 2.5 × 10 5 세포 / 플라스크에 T-75 플라스크에 씨앗 된 HUVEC. 참고 : 4.0 % 트리 판 블루 (1) 희석 : 1을 통해 가능성을 확인합니다. 양안 광 현미경으로 볼 때 트리 판 블루를 유지합니다 손상된 세포막과 세포, 양막 건강한 세포는 흰색 나타납니다. COUN세포의 80 % 이상이 20 가능한 지 확인, 100 세포를 톤. </li><li> 세포가 ~ 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 예열 신선한 VEGF 매체와 미디어를 2 일마다 교체합니다. </li><li> 미리 예열 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 2 ㎖의 트립신 중화 솔루션 다음 5 분 동안 2 ㎖의 트립신 EDTA (0.25 %)와 함께 배양하여 T75 플라스크에서 세포를 해방. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브 중단 된 HUVEC를 수집합니다. PBS로 T-75 플라스크에서 여분의 세포를 씻어 내고 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 10 분 동안 200 XG에 원심 분리기 세포. </li><li> , 뜨는을 제거 10ml를 미리 예열 VEGF 미디어에서 세포 펠렛을 일시 중지합니다. </li><li> 혈구 세포 또는 유사한 계산 장치를 이용하여 세포 농도를 결정. </li><li> (50,000 / 웰) 된 커버와 6 웰 플레이트 (400,000 / 웰) 또는 12 웰 플레이트 중 하나에 추가 세포 현탁액의 양을 계산합니다. HUVECs를 다음날 실험을위한 준비가 될 것입니다. </li></ol> 4. 생존 분석 침략 / 상호 작용(도금) 참고 :이 분석을 수행 할 때, / 잘 400,000 세포에 접종 내피 세포의 두 6 웰 플레이트를 준비합니다. 하나의 판에 부착 된 박테리아 및 숙주 세포에 의해 내재화를 평가하기 위해 사용될 것이다. 다른 판은 세포 내 세균을 설명합니다. 두 샘플의 삼중 한 실험에서 수행하는 6- 웰 플레이트는 허용한다. 이 프로토콜의 개요는 생존 분석 흐름도 (그림 2)를 참조하시기 바랍니다. <ol><li> 그들이 중반 로그 성장 (OD 660 0.5-0.7)에 도달 할 때까지 (제 1 참조) 상기 한 바와 같이 혐기성 박테리아를 준비합니다. </li><li> 원심 분리기 박테리아 10 분 동안 5,000 XG에. 원심 분리기는 챔버 외부 혐기성 인 경우, 15 mL의 밀봉 된 튜브에서 세균 시료를 운반 산소 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 뚜껑을 감싸는 참고. </li><li> 펠렛 P. 배치 gingivalis에 다시 실, 상층 액을 버린다. VEGF 나에 재현 탁 전에 다시 PBS로 펠렛 박테리아를 씻어디아. 모든 균주가 중반 로그 단계 (~ 7 × 10 8 세포 / ml)에 해당하는 0.7의 OD 660에서 테스트 할 수 있도록 현탁액을 준비합니다. 박테리아는 현재 감염에 대한 준비가되어 있습니다. </li><li> 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 된 HUVEC를 포함하는 전송 6 웰 플레이트. 용지를 제거하고 혐기성 PBS로 3 회 세척한다. 각 웰에 혐기성 VEGF 미디어 2 ㎖를 추가하고 감염에 대한 온도를 평형 20 분 동안 혐기성 배양기에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다. 참고 : 감염에 사용되는 것을 보장하기 위해 혈액 한천 플레이트에 플레이트 박테리아가 균일 감염에 오염되지 않습니다. </li><li> 100 : 감염 다중의 박테리아 숙주 세포 (숙주 박테리아 MOI) 감염 1. 주 : HUVEC 세포 수는 감염 전에 단일 웰에 트리 판 제외 테스트를 수행하여 결정된다. 박테리아 세포의 수는 (0.5 = 5 × 10 8 세포 / ㎖의 OD, 예) 광학 밀도를 통해 결정된다. 비acterial 농도는 HUVEC를 농도 (21)에 기초하여 적절한 방어로 조정된다. </li><li> 혐기성 배양기에 감염된 HUVECs를 6 웰 플레이트를 놓고 세균이 30 분 동안 숙주 세포와 상호 작용 할 수 있습니다. </li><li> 비에이치 아이에 사포닌 혐기성 챔버 내부와 0.2 μm의 필터를 통해 필터링 (/ V W 1.0 %)을 준비합니다. </li><li> 모두 부착 내면화 박테리아의 생존. <ol><li> , 인큐베이터, 흡 매체에서 플레이트를 제거 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 2 ㎖를 (단계 4.8에 기재된 바와 같이 제조) 1.0 %의 사포닌을 추가 여과. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다. </li><li> 세포 스크레이퍼 잘 각각의 바닥을 쳤어요. 각 웰의 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석. </li><li> 샘플의 일련 희석을 진행합니다. 박테리아 종과 농도에 따라, 연속 희석을 조정합니다. (1) 시작 : 100 또는 1 : 1,000 희석. </li><li> 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 랩 T37 ° C에서 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에서 그가 판. </li><li> 37 ° C에서 배양 7 일 후, 플레이트를 제거하고 수동으로 식민지를 계산하는 라이트 박스를 이용하여 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 계산합니다. 참고 : CFUs이 열거되어있다. CFUs의 대량 들어, 화상이 촬영 될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어 CFUs의 열거를 용이하게하기 위해 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 내면화 된 박테리아의 생존. <ol><li> 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 보충 항생제 (겐타 마이신 300 μg의 / ㎖과 메트로니다졸 400 ㎍ / ml)로 2 ml의 VEGF 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 1 시간 동안 품어. 그들이 원하는 균주를 죽이는 100 % 효과가 있으므로 항생제를 테스트하고 그들이 숙주 세포 (22, 23)을 관통하지 않는 것이 있는지 확인해야합니다. </li><li> 대기음 매체는 필터링 1.0 % 사포닌 2 ㎖를 추가합니다. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다. </li><li> 각 아의 바닥을 쳤어요세포 스크레이퍼와 L. 각 우물에서 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석. </li><li> 샘플 (: 100, 1 : 1,000 1)의 연속 희석을 준비합니다. </li><li> 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에 판을 바꿈. </li><li> 37 °에서 배양 7 일 후 판을 제거하고 CFUs를 계산 C. </li></ol></li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> 그림 2. 진핵 세포와 혐기성 세균의 생존을 위해 사용되는 프로토콜의 도식 표현. 총 세균의 생존과 내면화 박테리아의 생존을위한 두 가지 분석을 동시에 수행 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 호스트 세륨에 박테리아의 5 내면화LLS (형광 현미경) 참고 : P.을 gingivalis에, 2 &#39;로 7&#39;- 비스 -로 표시되는 (2- 카복시 에틸) -5- (및 -6) -Carboxyfluorescein, 아세 에스터 (BCECF-AM). BCECF-AM은 비 형광 막 투과성 염료이다; 세포 내 에스 테라 제의 작용을 통해 형광 BCECF에의 변환은 세포 생존 능력을 표시 할 수 있습니다. 피를 진지 발리는 BCECF-AM 염료로 표지 한 후 진핵 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 감염 후, 세포를 고정하고 DAPI와 TRITC-팔로이 딘으로 표시. 진핵 세포의 핵을 염색하는데 사용 DAPI 염색은 또한 대사되지 쪼개짐 BCECF-AM 수 비 생존 박테리아를 식별 할 대응책을 제공하는 박테리아 세포 핵을 레이블링한다. 호스트 세포 TRITC-팔로이 딘, 빨간색 굴지 염료로 강조 표시됩니다. <ol><li> 오토 클레이브 된 커버. 무균 / 웰 5 × 10 4 세포에서 내피 세포를 파종하기 전에 12 웰 플레이트로 된 커버를 추가합니다. (실험 전 준비 일) </li><l난&gt; 상기 한 바와 같이 12 웰 플레이트에서 18mm (# 1.5 두께) 원형 된 커버에 준비 내피 세포 되세요. </li><li> 제 1 절에 설명 된대로 중반 로그 단계로 성장 혐기성 세균 (= 0.5-0.7 OD 660)를 준비합니다. </li><li> 워시 박테리아는 5,000 XG에 원심 분리 및 5-7 × 10 8 세포 / ml에서 PBS에 펠렛을 일시 중단하여 혐기성 PBS로 2 배. </li><li> 2 μM의 BCECF-AM의 최종 농도 세균 현탁액 (5-7 X 108 세포 / ml) 2 ㎖에 0.2 mM의 BCECF-AM의 20 μL를 추가한다. </li><li> 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 18mm (# 1.5 두께) 원형 된 커버에 시드 내피 세포와 전송 플레이트. PBS 및 혐기성 VEGF 매체과의 교류로 씻으십시오. 참고 : HUVECs를 가벼운 현미경 건강 있는지 확인합니다. HUVEC를 80 %의 합류는, 형태는 제조 업체와 비교해야한다 ~해야한다. </li><li> 원심 분리기 표시 박테리아10 분 동안 5,000 XG 잔류 BCECF-AM 염료를 제거합니다. 2 ml의 혐기성 VEGF 매체에서 일시 중단합니다. </li><li> 1 (세균 : 호스트) (100)의 MOI에서 표지 된 박테리아 숙주 세포를 감염시킨다. </li><li> 30 분 동안 37 ℃의 혐기성 챔버에서 배양한다. </li><li> 및 PBS로 3 회 감염 세척 세포 후 10 분 동안 새로 제조 4.0 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다. 주 : 세포를 고정 후, 실험을 혐기 챔버 밖에서 실시 할 수있다. </li><li> 워시는 PBS로 3 회 된 커버. </li><li> 10 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 워시는 PBS로 3 회 된 커버. </li><li> 45 분 동안 커버 슬립에 TRITC의 팔로이 딘 (50 μg의 / ㎖)의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 워시는 DAPI를 포함하는 소프트 세트 장착 매체와 슬라이드에 12 웰 플레이트와 장소에서 제거, 세 번 된 커버. 매니큐어 측면을 밀봉합니다. 참고 : 슬라이드 어둠 속에서 몇 달 동안 저장 될 수있다. 사진 표백을 방지하기 위해 빛의 노출을 피하십시오. </li><li> 보기 슬라이드공 초점 현미경을 사용. <ol><li> 여기서, (반전) AxioObserver 주위 구성된 34 채널 분광 시스템 (32 채널 어레이 검출기와 두 개의 측면 PMT 검출기, 플러스 전송 된 광 검출기) 전동 XY 스테이지 스탠드를 사용합니다. 파란색 다이오드 (405 ㎚), 멀티 라인 아르곤 (458, 488, 514 ㎚), 녹색 다이오드 (561 ㎚), 빨간색 헬륨 네온 (633 ㎚) 및 440 nm의 펄스 레이저 :이 시스템은 다섯 레이저를 보유하고 있습니다. (FRET-FLIM 용) 2 하이브리드 하나로 이루어질 탐지기 형광 수명 이미징 시스템을 착용. </li><li> 3백40부터 3백80까지 nm 내지 5백40에서 5백60까지 nm의 각각 4백35부터 4백85까지 nm 내지 5백70에서 5백90까지 nm 인 발광 필터의 여기 파장을 가진 듀얼 - 밴드 필터를 사용하여 하나의 채널에 DAPI와 TRITC에서 형광을 검출한다. 4백40에서 5백까지 나노 미터의 여기 파장 및 5백10에서 5백90까지 nm 인 발광 필터와 필터를 사용 BCECF-AM에서 형광을 검출한다. 참고 : 모든 균주에 수행해야 BCECF-AM에 대한 제어하는​​ 실행 가능한 박테리아의 적절한 라벨을 보장하기 위해 연구되고있다. 먼저 nonviab을 확인제작 박테리아는 DAPI 양성 및 BCECF 음성이다. 둘째, 살아있는 박테리아가 형광 BCECF에 BCECF-AM을 대사 할 수 있는지 확인합니다. 세균이나 BCECF-AM 염료의 변수 농도는 최적의 라벨 검사를해야 할 수도 있습니다. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

위의 모든 방법들은 진핵 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 특정 분석법을 설계하는데 사용될 수있다. 그러나 성공적으로 실험을 수행 할 수있는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 실험에 사용되는 균주이다. 그것은 그들이 유사한 성장 단계에 있으며 침입 효율 (13)에 영향을 미칠 수있는 전술의 차이와 유사한 세포 농도를 달성한다는 생존 분석 ?...

혐기성 박테리아는 인체의 거의 모든 표면에 정착. 산소 농도가 낮은 장과 비뇨 생식기 책자의 식물에서 우세하지만, 그들은 또한 피부, 입, 코, 목의 1에 높은 수준으로 존재한다. 혐기성 박테리아는 내인성 감염의 흔한 원인이며, 자주 병에 걸린 사이트에서 격리됩니다. 그러나, 그들의 까다로운 성격, 혐기성 격리하고 문화 어려울 수 있습니다. 혐기성 박테리아를 포함하는 연구는 제한된 조건에서 수행해야합니다. 현대 혐기성 배양 기술은 연구자가 많은 혐기성 실험 균주 또는 임상 분리 2,3을 연구하는 데 필요한 혐기성 설정을 모방 할 수 있습니다. 병원성 혐기성 세균들이 거주하는 숙주 세포와 동적 관계 공진화를 개발했다. 대부분의 혐기성는 infecti에 도달하기 전에 호스트 면역 반응에 의해 살해에 민감하다OU에 수준. 그러나 일부 병원성 박테리아로부터 탈출 또는 숙주 면역 반응을 파괴하는기구를 개발했다. 그들은 이러한 면역 인식, 면역 매개 물질의 중화, 세포 매개 면역의 변경, 숙주 세포의 침윤, 4 신호 면역의 변경의 회피로 메커니즘을 통해이 목표를 달성. 포피 gingivalis에 모두 구강과에 연루 그람 음성 혐기성를 구외 질환, 호스트 5-7 병원성 변화를 일으킬 수있는 매우 적합 세균성 병원체의 일례이다. 생물막 플라크의 포켓은 대기 산소 (8)로부터 보호되는 혐기성 박테리아를 정박 할 수있는 치아와 치은 점막 조직 사이에 형성된 깊은 틈새에서 발생한. 이러한 치주 포켓은 피 등 다양한 혐기성 병원균에 대한 틈새 시장의 역할 진지 발리 (9). P. 진지 발리는 리모델링 할 수있는 키스톤 병원균이다치주 질환 (10)의 발생과 진행을 촉진 방법으로 구강 미생물 커뮤니티를 보내고. 이는 호스트 단백질의 광범위한 스펙트럼에 대해 활성 및 숙주 방어 11 회피 메커니즘을 제공 독성 인자의 대량 생산. 또한, 시험 관내 및 생체 내 12-14 15 상피, 내피, 섬유 아세포, 및 치주 인대 세포에 침입 할 수있다. 효과적으로 피를 숙주 세포에 침입하여 진지 발리는 호스트 면역을 탈출 할 수 있습니다. 숙주 세포의 효과적인 침략뿐만 아니라 박테리아가 숙주 방어를 탈출 할 수 있습니다뿐만 아니라 미래에 다시 감염에 대한 저수지 역할뿐​​만 아니라 숙주 세포를 변경합니다. 숙주 세포에 의해 부착 및 세균 내면화에 관여하는 분자 메커니즘의 연구가 필요하다. 여러 실험실에서 연구 P.의 국제화와 관련된 분자 이벤트를 이해에 초점을 맞추고 숙주 세포에 의해 진지 발리뿐만 아니라 억제하고 면역 반응을 납치하고 적대적인 호스트 방어 메커니즘을 생존하는 데 사용되는 메커니즘으로. 식별 및 숙주 세포에 침입 할 수있는 병원체의 특성을 분석 할 수있는 많은있다. 이 산소없이 부피 악기에 의존 연구를 수행하는 것은 곤란하다 때문에, 혐기성 병원균 관내 연구는 주로 많은 실험적 연구 문제를 제기. 이는 진핵 세포 성장에 산소를 필요로하며, 따라서 조직 배양 인큐베이터에서 별도로 준비되어야한다는 사실에 의해 복잡해진다. 그러한 장애물을 피할 수있는 한 가지 방법은 산소 분위기 하에서 조사를 수행하는 것,하지만 혐기성 박테리아의 성장이 불가능하게된다. 또 다른 방법은 감염 숙주 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 열 살해 박테리아를 사용하는 것이다. 그러나 차이는 호스트 병원체 interacti의 관련성을 감소 열 명이 사망하고 실행 가능한 박테리아 사이에 존재16. 그것은 숙주 세포와의 상호 작용 변경되지 않은 표현으로 가능한 박테리아를 연구하는 중심; 피를 배양 따라서 방법 혐기성 환경에서 진지 발리가 제공됩니다. 또한, 간단한 두 비용 효율적인 프로토콜 P.의 능력을 평가하기위한 입증되고 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)에 의해 내면화한다. 제 1 프로토콜은 인기 항생제 보호 분석에 기초한다. 분석이 간단하지만, 혐기성 미생물을 이용한 고려 주어진다. 제 2 프로토콜은 상호 작용 시각화 형광 주사 현미경의 사용을 필요로하며, P. 내재화 진지 발리. 각 분석은 한계 및 혐기성 세균의 침입을 연구 연구자에게 개요를 제공하도록 설명되는 장점을 갖는다. 현재 원고는 피를 연구했지만 HUVECs를 진지 발리 및 이러한 프로토콜뿐만 아니라 다른 많은 혐기성 세균에 대해 사용될 수있다숙주 세포의 다른 유형에도.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Model 2000 incubator&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td>221261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>FC-0044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td>
			<td>LifeLine Technology</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypKit</td>
			<td>LifeLine</td>
			<td>LL-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin</td>
			<td>Riedel-de Haen</td>
			<td>16109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G-1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metronidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-3761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCECF-AM</td>
			<td>LifeTechnologies</td>
			<td>B1150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC Phalloidin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm Circular Coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72222-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

혐기성 박테리아는 지금까지와 같은 창자, 입 및 질만큼 인간의 틈새에서 성균보다 많다. 또한, 혐기성 감염은 일반적이고 자주 원주민 출신이다. 인간의 세포에 침입하는 일부 혐기성 병원균의 능력은 그들에게 선천성 면역을 탈출뿐만 아니라 숙주 세포의 행동을 조절하는 적응 대책을 제공합니다. 그러나, 혐기성 세균이 문제를 일으킬 수 사건 조사 실험 도중 라이브임을 보장. 포피로 모나스 진지의, 그램 음성 혐기성는 진핵 비 식세포 다양한 침입 할 수있다. 이 문서에서는 성공적으로 문화와는 P.의 능력을 평가하는 방법에 대해 설명합니다 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)을 침공. 두 개의 프로토콜이 개발되었다 : 하나는 성공적 침입 숙주 내에서 생존 및 다른 숙주 세포와 상호 작용하는 박테리아를 시각화 할 수있는 박테리아를 측정하기 위해. 이러한 기술은 처남의 사용을 필요robic P. 공급 챔버 최적 성장 혐기성 환경 진지 발리. 제 1 프로토콜은 주로 박테리아 숙주 세포의 침윤을 연구하는 데 사용되는 항생제 보호 분석에 기초한다. 그러나, 항생제 보호 분석법은 제한된다; 항생제 치료 및 숙주 세포 용해 다음 배양 세포 내 박테리아 만이 측정된다. 살아있는 및 죽은 모두 숙주 세포와 상호 작용하는 모든 세균을 평가하기 위해, 우리는 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하는 프로토콜을 개발했다. 박테리아 형광, 2 &#39;와 7&#39;- 비스 - (2- 카르복시 에틸)에 표시되어 -5- (및 -6) -carboxyfluorescein 아세 톡시 메틸 에스터 (BCECF-AM) 및 혐기성 조건 하에서 진핵 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 0.2 % 트리톤 X-100과 파라 포름 알데히드 및​​ 투과성으로 함께 고정 다음, 숙주 세포는 각각 세포 골격과 핵 라벨을 TRITC의 팔로이 딘 및 DAPI로 라벨링된다. 여러 IMA다른 초점 (Z-스택)에서 촬영 GES는 박테리아의 시간적 공간적 시각화를 얻을 수있다. 이 연구에서 사용되는 방법은 경작 혐기성 및 진핵 세포 유형에 적용될 수있다.

위에서 설명한 프로토콜 (P) 사이에 호스트 병원체 상호 작용을 연구에 사용 된 진지 발리와 내피 세포. P. 진지 발리 W83 및 P. PG0228의 삭제를 수행 진지 발리 V3150이 연구에 사용 하였다. PG0228 궁극적 P.의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 RNA와 단백질의 레벨을 변경할 수 단백질을 인코딩하도록 예측되고 숙주 세포와 진지 발리. 경찰에 PG0228의 ?...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.2K 조회수.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

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Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

모델 Herpesvirus의 Lytic 복제의 해부 호스트 바이러스 상호 작용

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

연구

면역학 및 감염병학

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

장기 호스트 병원체 상호 작용을 특성화에 대한 EpiAirway 모델의 사용

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols to address these questions include colony count assays, gentamicin protection assays, and electron microscopy. Colony count and gentamicin protection assays only assess the viability of the entire bacterial population and are unable to determine individual bacterial viability. Electron microscopy can be used to determine the viability of individual bacteria and provide information regarding their localization in host cells. However, bacteria often display a range of electron densities, making assessment of viability difficult. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells. These assays were developed originally to assess survival of Neisseria gonorrhoeae in primary human neutrophils, but should be applicable to any bacterium-host cell interaction. These protocols combine membrane-permeable fluorescent dyes (SYTO9 and 4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole [DAPI]), which stain all bacteria, with membrane-impermeable fluorescent dyes (propidium iodide and SYTOX Green), which are only accessible to nonviable bacteria. Prior to eukaryotic cell permeabilization, an antibody or fluorescent reagent is added to identify extracellular bacteria. Thus these assays discriminate the viability of bacteria adherent to and inside eukaryotic cells. A protocol is also provided for using the viability dyes in combination with fluorescent antibodies to eukaryotic cell markers, in order to determine the subcellular localization of individual bacteria. The bacterial viability dyes discussed in this article are a sensitive complement and/or alternative to traditional microbiology techniques to evaluate the viability of individual bacteria and provide information regarding where bacteria survive in host cells.

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. This article outlines protocols for the use of fluorescent dyes that reveal the viability of individual bacteria inside and associated with host cells.

포유 동물 세포와 관련있는 박테리아의 생존을 확인하는 방법에 대한 형광 현미경 방법

Central to the field of bacterial pathogenesis is the ability to define if and how microbes survive after exposure to eukaryotic cells. Current protocols ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

사용<em&gt; 갤러리아 mellonella</em&gt; 모델 생물로 공부하기<em&gt; 레지오넬라 뉴모 필라</em&gt; 감염

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

박테리아 - 호스트 상호 작용의 특성을 생체 모방 재료

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

그룹 B의 쥐 모델<em&gt; 연쇄상 구균</em&gt; 질 식민

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리

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