이 프로토콜은 단일 세포 수준에서 다양한 표현성 변화의 직접적인 관찰을 용이하게하고 단백질 국소화 및 유전자 발현 타이밍의 지속적인 모니터링을 허용한다. 형광 현미경 검사법의 주요 장점은 살아있는 세포에 있는 세포 분열 및 세포 형태 변경과 같은 각종 생물학 프로세스를 감시하기 위한 간단한 방법이다. 샘플 준비 프로토콜에 특히 주의를 기울이고 이 프로토콜에 나열된 설정 및 옵션을 찾을 수 있는 현미경 소프트웨어를 살펴보십시오.
이 프로토콜의 시각적 표현은 사용자가 자체 실험을 설정할 때 기술의 중요한 단계를 보고 배울 수 있기 때문에 중요합니다. 먼저 관심 있는 세포 배양의 5~50마이크로리터 알리쿼트를 적절한 멤브레인 염색염으로 라벨을 붙이고 스테인드 세균 세포의 5마이크로리터를 35밀리리터 유리 바닥 배양 접시의 바닥에 있는 커버 슬립에 첨가하여 시작합니다. 11mm 직경의 아가로즈 슬래브를 샘플 위에 놓고 부드럽게 탭하여 슬래브가 커버 슬립에 평평하도록 합니다.
그런 다음 커버 슬립 주위에 약 5개의 마이크로리터를 추가하여 아가로즈 패드가 건조되는 것을 방지하고 배양 접시가 15~20분 동안 고해상도 감착 현미경의 인큐베이션 챔버 내부의 온도에 평형화되도록 합니다. 샘플을 이미지화하려면 거친 조정 포커스 노브를 사용하여 현미경 소프트웨어 내에서 현미경을 초기화하기 전에 목표가 완전히 낮아졌는지 확인합니다. 1.517 굴절성 지수 오일을 100배 오일 침수 목표에 넣고 샘플을 포함하는 유리 바닥 접시를 금속 하우징 관으로 옮킨다.
접시를 스테이지 클램프에 부드럽게 밀어 넣고 거친 조정 노브를 사용하여 기름이 접시의 유리 바닥과 접촉할 때까지 목표를 높입니다. 접안렌즈와 미세 조정 노브를 사용하여 샘플을 초점으로 만들고 카메라 모드로 전환합니다. 3D 해결 창의 이미징 소프트웨어에서 실험 설계/실행 아이콘을 선택합니다.
디자인/실행 실험이라는 제목의 새 대화 상자가 나타납니다. 대화 상자에서 디자인 및 단면 탭을 열어 Z 스택 수와 샘플 두께를 설정합니다. 샘플내의 셀 두께를 측정하려면 3D 대화 상자의 위쪽 및 아래쪽 화살표를 사용하여 Z 평면을 점진적으로 조정하여 셀이 이미지 수집의 상하한으로 초점이 바 나는 위치를 만듭니다.
라이트 강도의 백분율 전송과 3D 대화 상자에서 선택한 개별 채널에 대한 노출 지속 시간을 조정한 후 점 목록을 클릭하여 포인트 목록을 엽니다. 디자인 및 시간 경과 탭에서 시간 경과 확인란을 선택하고 시간 경과 매개 변수를 입력합니다. 방문 점 목록 옵션을 선택하고 텍스트 상자에 이미지할 점을 입력하여 전체 시퀀스를 위해 쉼표 또는 하이픈으로 점을 분리합니다.
그런 다음 실행 탭에서 파일 이름과 파일 위치를 편집하고 실험 시작 대화 상자에서 재생을 선택하여 실험을 시작합니다. 분석이 끝나면 적절한 deconvolution 프로그램에 관심있는 RAW 이미지 파일을 열고 프로세스 탭 및 Deconvolve를 선택합니다. TIFF 파일로 이미지를 저장하기 전에 필요에 따라 필요에 따라 모든 파장 채널에서 수동 배경 노이즈 뺄셈 및 밝기 콘트라스트 조정을 수행합니다.
셀 길이 정량화의 경우 제조업체에서 제공된 소프트웨어 또는 ImageJ와 같은 무료 이미징 소프트웨어에서 deconvoluted 이미지 파일을 열고 도구 탭을 엽니다. 그런 다음 거리 측정값을 선택하고 원하는 이미지 파일의 시작 점과 끝점을 왼쪽 단추로 클릭하여 셀 길이를 측정합니다. 형광 신호 정량화의 경우 데이터 관리자를 선택합니다.
특정 관심 크기로 설정된 열/행 옵션이 있는 상자를 그리고 정량화할 신호가 있는 영역을 선택합니다. GGS 8 스트레인을 유도하는 xylose를 첨가하면 6세포 표현형이 발생한다. 빈 벡터 컨트롤은 유도자가 없는 상태에서 성장한 제어 셀과 유사하게 나타납니다.
포도상 구균 gpsB의 과잉 생산은 시간 경과 현미경 검사법과 세포 길이 정량화에 의해 측정된 바와 같이 B.subtilis에 있는 세포 분열을 방해합니다. 또한, FtsZ 또는 이 단백질과 관련된 단백질 중 하나의 국소화 패턴은 시간 경과 이미징 및 세포 길이 정량화를 통해 새로운 항균 화합물을 연구 및/또는 식별하는 기자를 사용할 수 있다. 굴절률은 이미징에 사용되는 온도에 따라 변경될 수 있기 때문에 적절한 굴절률을 가진 오일을 사용해야 합니다.
사용자가 초점 외 노이즈를 제거하려는 경우 절충볼루션을 수행할 수 있으며 형광 신호 정량화 및 셀 길이 및 폭 측정과 관련된 데이터 분석도 수행될 수 있다.
