이러한 여러 프로토콜의 개선에 기여한 샘 규 김, 캐서린 Plichta 빅토리아 미란다 - 톰슨 : 저자는 증권 연구소의 과거 회원을 감사드립니다. 우리는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원을 인정 SP 주식에 (보조금 IOS-0840932 및 IOS-0724978).

1. 토양 시료 채취 <ol><li> 각 샘플링 사이트에 4 평방 미터 - 2의 최소 면적을 고려. </li><li> 적어도 15 cm의 깊이 (그림 4)에서 토양 샘플을 수집합니다. </li><li> 이 영역에 적어도 5 무작위 샘플을 채취. </li><li> 샘플 당 3 서브 샘플을 가져 가라. 이 연구의 목적에 따라 서브 샘플을 결합하거나 구분하지 않고 하나. </li><li> 비닐 봉투에 각각의 샘플을 놓습니다. 시료의 누출 (그림 4)을 방지하기 위해 이중 자루에 넣기를 고려합니다. </li><li> 방수 마커 라벨 샘플. 등 (지방 / 지역 / 사이트 이름 및 GPS 좌표 정보를 포함) 사이트의 정보, 날짜, 서식지, 관련 식물, 온도, 고도, 각 샘플링 사이트에서 다음과 같은 정보를 포함 참고 : 해당되는 경우, 곤충 또는 이후의 식별을위한 샘플 수집 다른 무척추 동물의 존재를 수집 및 / 또는 기록한다. 그들은 잠재적 인 타고난를 나타낼 수있다알 EPN 호스트. </li><li> 물로 잘 세척 및 / 또는 70 % 에탄올 0.5 % 표백제 솔루션을 소독하여 샘플 사이 청소 수집 도구. </li><li> 실험실로 운송시 - (15 ° C에서 8) 쿨러에 샘플을 보관하십시오. </li><li> 토양 조성, 조직, 습기, 전기 전도성 또는 다른 원하는 토양 매개 변수에 대한 정보를 얻기 위해 분석 토양 샘플의 일부를 가라. </li></ol> . 토양 샘플에서 2 선충 격리 : 곤충을 유혹 기술 <ol><li> 이물질을 제거합니다 (예., 바위, 등 나무 나 나무 껍질, 잎, 조각.) saprobic 미생물 오염을 방지하기 위해 샘플 수집. </li><li> 흙을 묻혀 선충의 이동을 용이하게하기 위해 물을 추가합니다. 참고 : 천천히 토양의 수분 레벨을 증가시키기 위해 스프레이 병을 사용합니다. </li><li> 뚜껑이있는 깨끗한 플라스틱 용기에 촉촉한 흙의 약 200-250 ㎖를 놓습니다. </li><li> 곤충 미끼 추가. 각 시료의 토양 표면 (그림 5)에 5 ~ 10 곤충을 고려하십시오. </li><li> 뚜껑이있는 용기를 덮고 거꾸로 컨테이너를 켭니다. </li><li> (- 25 ° C에서 보통 22) 어둠과 RT의 컨테이너를 유지합니다. </li><li> 3 일 죽은 벌레를 제거 - 매 2 컨테이너를 확인합니다. 참고 : 토양 샘플의 추가 탄압 각 컨테이너에 추가 건강한 곤충을 추가합니다. </li><li> 컨테이너에서 죽은 벌레를 제거합니다. 참고 : 어두운 자주색 시체에 붉​​은 벽돌이 heterorhabditids에 기생하는 반면 갈색 또는 황토 채색 함께 시신은 일반적으로 steine​​rnematids에 의해 기생됩니다. </li><li> 멸균 물에 시체를 씻어. </li><li> (아래 절차 참조) 선충 자손의 회복을위한 수정 된 화이트 함정에 시체를 놓습니다. </li></ol> . 감염된 시체에서 3 선충류 복구 : 수정 된 화이트 함정 <ol><li> 50 (60) mm의 DIAM의 상단을 놓으십시오. 큰 접시 (100mm) 내부 페트리 접시. </li><li> 하나의 죄를 설정작은 그릇 안에 GLE 원형 여과지 (와트 만 # 1). </li><li> 확실히 시체를 만드는 작은 접시의 필터 종이에 장소 사체는 오염을 방지하기 위해 서로 접촉하지 않습니다. </li><li> 캘리포니아와 외부 (큰) 페트리 접시를 채우십시오. 멸균 증류수 20 ㎖. 시체를 보유하고 접시에 물을 추가하지 마십시오. </li><li> 큰 페트리 접시와 뚜껑의 내용 (그림 6)을 포함한다. </li><li> 그에 따라 요리를 레이블. 선충류 이름 (종 / 분리), 감염 날짜 (날짜 감염이 설정된) 및 트랩 날짜 (이것은 트랩이 설정된 날짜입니다) : 다음과 같은 정보를 추가합니다. </li><li> 감염성 청소년 단계 (IJS)의 출현이 발생할 때까지 RT에서 트랩을 유지합니다. 선충 종 및 / 또는 고려 변형에 따라 25 일 -이 과정은 10 사이의 시간이 소요될 수 있습니다. </li><li> 트랩의 큰 접시를 제거하고 비커에 선충 물을 부어 IJS 수확 물. </li><li> 선충은 B의 바닥에 가만히 따르다 할 수 있도록 허용eaker. 이 과정은 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. </li><li> 확인 선충이 비커의 바닥에 남아하고, 조심스럽게 물을 부어. </li><li> 더 많은 물을 추가하고 선충은 가만히 따르다 할 수 있도록하여 선충을 씻어. 물이 깨끗해질 때까지 3 회 -이 단계 2를 반복 할 수 있습니다. </li><li> 조직 배양 플라스크 (250 ㎖)에 선충 현탁액을 놓습니다. 3000 선충 / ㎖ - 현탁액의 농도를 1,000 보관하십시오. </li><li> C. ° 20 - 추운 방에서 또는 인큐베이터에있는 선충 서스펜션 스토어 플라스크 (10) 사이 참고 : EPN의 수명은 변수로 주기적으로 저장 플라스크를 확인합니다. heterorhabditids 더 정기적 인 검진을 필요로 할 수있는 반면, 계대 배양의 필요없이 12 개월 - 보통 steine​​rnematids 6 저장할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Bedding, R. A., Akhurst, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+the+detection+of+insect+parasitic+rhabditid+nematodes+in+soil.">A simple technique for the detection of insect parasitic rhabditid nematodes in soil.</a> Nematologica. 21, 109-110 (1975).</li><li>Boemare, N. E., Akhurst, R. A., Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K. -. H., Stackebrandt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Genera Photorhabdus and Xenorhabdus. In The Prokaryotes. , 473-488 (2007).</li><li>Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematology. , (2002).</li><li>Gaugler, R., Kaya, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Entomopathogenic Nematode s in Biological Control. , (1990).</li><li>Hazir, S., Keskin, N., Stock, S. P., Kaya, H. K., &#214;zcan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+distribution+of+entomopathogenic+nematodes+(Rhabditida:+Steinernematidae+and+Heterorhabditidae)+in+Turkey.">Diversity and distribution of entomopathogenic nematodes (Rhabditida: Steinernematidae and Heterorhabditidae) in Turkey.</a> Biodiversit., &amp; Conservation. 12, 375-386 (2003).</li><li>Kaya, H. K., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes.">Entomopathogenic nematodes.</a> Annual Review of Entomology. 38, 181-206 (1993).</li><li>Kaya, H. K., Stock, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Techniques in insect nematology. In Manual of techniques in insect pathology. , 281-324 (1997).</li><li>Lacey, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of techniques in invertebrate pathology. , (2012).</li><li>McCoy, C. W., Shapiro-Ilan, D., Duncan, L., Nguyen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+other+natural+enemies+as+mortality+factors+for+larvae+of+Diaprepes+abbreviatus+(Coleoptera:+Curculionidae).">Entomopathogenic nematodes and other natural enemies as mortality factors for larvae of Diaprepes abbreviatus (Coleoptera: Curculionidae).</a> Biological Control. 19, 182-190 (2000).</li><li>Meyling, N. V., Eilenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+and+distribution+of+soil+borne+entomopathogenic+fungi+within+a+single+organic+agroecosystem.">Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem.</a> Agriculture, ecosystem., &amp; environment. 113, 336-341 (2006).</li><li>Poinar, G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Taxonomy and biology of Steinernematidae and Heterorhabditidae. In: Entomopathogenic Nemtaodes in Biological. , 23-61 (1990).</li><li>Stock, S. P., Gress, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+phylogenetic+relationships+of+entomopathogenic+nematodes+(Steinernematidae+and+Heterorhabditidae)+from+the+Sky+Islands+of+southern+Arizona.">Diversity and phylogenetic relationships of entomopathogenic nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae) from the Sky Islands of southern Arizona.</a> Journal of invertebrate pathology. 92, 66-72 (2006).</li><li>Stock, S. P., Hunt, D. J., Grewal, P. S., Ehlers, R. U., Shapiro-Ilan, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode+morphology+and+systematics.">Nematode morphology and systematics.</a> Nematodes as biological control agents. CAB International Publishing. , 3-43 (2005).</li><li>Stock, S. P., Goodrich&#8211;Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entomopathogenic+nematodes+and+their+bacterial+symbionts:+The+inside+out+of+a+mutualistic+association.">Entomopathogenic nematodes and their bacterial symbionts: The inside out of a mutualistic association.</a> Symbiosis. 46, 65-75 (2008).</li><li>Stuart, R. J., Gaugler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchiness+in+populations+of+entomopathogenic+nematodes.">Patchiness in populations of entomopathogenic nematodes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64, 39-45 (1994).</li><li>White, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+obtaining+infective+nematode+larvae+from+cultures.">A method for obtaining infective nematode larvae from cultures.</a> Science. 66, 302-303 (1927).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 데모는 일반적으로 EPN과 공생 박테리아를 연구에 사용되는 다양한 기술을 설명하는 프레 젠 테이션의 첫 번째입니다. 이 기술은 실험실에서 EPN 문화의 성공적인 설립을위한 주요 단계를 대표하고 또한 연구를위한 모델 생물로 EPN을 채용 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. EPN의 다양한 토양 조사는 자신의 풍요 로움과 유통이 계절, 서식지와 지리적 영역 (4), 5,9,1...

많은 선충은 곤충과 관련된, 그리고 그들의 호스트 상호 작용으로부터 유리한 해로운 범위된다. 여기서, 우리는 또한 곤충 병원성 선충 (또는 EPN)로 알려진 곤충의 병원체이다 선충의 그룹에 초점을 맞 춥니 다. Steinernematidae 및 Heterorhabditidae 11,13 두 선충 가족이 선충이 그룹에 속한다. 그들의 병원성 효과는 통성 혐기성 장내 세균 (Xenorhabdus 박테리아 heterorhabditids와 연관 steinernematids 및 Photorhabdus 박테리아와 연관) 2과의 상호 작용에 의해 수여 사실이다. 박테리아는 토양에 살고있는 유일한 자유의 생활 선충 단계, (또한 영속 청소년, 감염성 청소년 또는 IJ라고도 함) 세 번째 단계 감염성 청소년에 의해 하나의 곤충 호스트에서 다른 벡터가된다. 일단 곤충 내부 선충 대규모 패혈증에 의한 곤충 호스트를 죽일 수있는 곤충의 체액에 박테리아를 놓습니다. 또한 박테리아곤충의 조직을 저하하고 성숙하고 번성 할 수 있도록, 선충 &#39;음식 소스가됩니다. 보통, 성인 선충의 하나 또는 두 세대는 곤충 사체 내에서 생산됩니다. 몇 박테리아 세포와 마지막으로 성인 세대 다시 연결합니다의 자손보다 이전의 영양 관계보다 방식을 전문으로하고, 그들이 기생하는 다른 곤충을 기다리고 것이다 토양에 곤충의 시체에서 이사로 자신의 창자에있는 세포를 육성 6,11,14 (그림 1). 그들은 농업 해충 3,4,5입니다 곤충의 다양한 기생 수있는 1927 년 자신의 발견 이후, EPN은 화학 농약에 가치있는 대안을 고려하고 있습니다. 그러나, 지난 20 년 동안,이 선충과 공생 박테리아는 호스트 미생물 자원 활용의 생물 생태와 진화의 양상을 연구 전성 모델 시스템으로 인식되고있다NS 14. 이 프레젠테이션의 목표는 방법과 가장 일반적으로 토양 샘플링 및 EPN의 분리를 위해 사용되는 기술을 보여주는 것입니다. 다양한 도구를 사용할 수 있으며 포함하여 토양 샘플을 수집하는 데 사용 할 수 있습니다 토양 corers, 흙손, 포스트 홀 굴착기, 오거, 샘플링 튜브, 손 삽, 다른 사람의 사이에서 (그림 2). 연구의 목적에 따라,이 샘플링 전략이 고려 될 수있다 : a) 성층, b) 무작위 추출 (도 3). 층화 샘플링은 보통 주어진 시간 동안 특정 또는 demarked 영역에서 집중적 인 연구의 일부로서 사용된다. 일반적으로, 횡단는 demarked하고 토양 샘플은 일정 기간 (그림 3A) 15 이상 횡단에 규정 된 간격으로 촬영하고 있습니다. 광범위한 영역에 초점을 때 무작위 표본 추출은 일반적으로 사용된다. 이 샘플링 전략 EPN F의 다양성을 연구를 위해 사용되어왔다광범위한 지역 또는 지역 (그림 3B) 12 롬. 요인의 숫자는 고도, 토양의 질감과 서식지 (예., 경작지, 삼림, 목초지, 공원, 해안 미, 수변 지역 등)의 다양한 범위를 포함하는 연구의 초점에 따라 고려 될 수있다. 우리는 원래 침구 및 Akhurst 1에 의해 설명과 토양 샘플에서 EPN를 복구하는 간단하고 선택적 대안을 나타냅니다 된 곤충을 유혹 기술을 보여줍니다. 이 선충 (IJ 스테이지) 곤충 숙주 유인 해 기생됨을 전제로 선택적 절차이다. 이 기술은 또한 다른 곤충, 균류 등의 병원균, 박테리아 및 8,10의 분리를 위해 고려 될 수있다. 우리는 또한 감염된 곤충 호스트 7,14에서 선충의 자손을 검색하는 데 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술을 보여줍니다. 이 충족 손쉽게입니다분해 곤충 사체 부스러기가 &#39;깨끗한&#39;선충 자손을 검색하는 이점을 제공 HOD. 마지막으로, 설명이 문서에 나와있는 기술은 임신 및 / 또는 우리의 실험실에서뿐만 아니라 여러 동료들과 공동으로 기술 된 실시하는에 해당합니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Galleria mellonella&lt;/em&gt;</td><td>Timberline</td><td>http://www.timberlinefisheries.com/ProductDetails.asp?ProductCode=WAXLG</td><td>For insect baiting technique</td></tr><tr><td>Filter paper, 55 mm Grade 1 Cellulose</td><td>Whatman/VWR</td><td>28450-048</td><td>Infection chamber and White trap assembly</td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td>Infection chamber and White trap assembly</td></tr><tr><td>100 x 15 mm Petri dishes</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>Infection chamber and White trap assembly</td></tr><tr><td>ZIPloc plastic bags</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td></td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Mechanical pipettor P1000, P200 ml</td><td>VWR</td><td>89130-562; 89130-566&amp;nbsp;</td><td>Infection chamber and White trap assembly</td></tr><tr><td>Pippetor tips 1000ml, 200 ml</td><td>VWR</td><td>16466-004 ; 53510</td><td>Infection chamber and White trap assembly</td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td></td><td>Soil sampling , disinfecting</td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td></td><td>Soil sampling , disinfecting</td></tr><tr><td>70% Ethyl alochol</td><td>AAPER</td><td>17212945</td><td>Soil sampling , disinfecting</td></tr><tr><td>Shovels</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td>N/A</td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Tubular soil sampler</td><td>Accuproducts</td><td></td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Soil probe, long handle</td><td>Nupla&amp;nbsp;</td><td>PRB4T 69401 Classic</td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td></td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Flagging tape, various colors</td><td>Ace Hardware or local hardware store</td><td></td><td>Soil sampling</td></tr><tr><td>Tissue culture flasks</td><td>VWR</td><td>Falcon, 29185-304&amp;nbsp;</td><td>White trap, collection of EPN</td></tr><tr><td>Wash bottles, polyethylene, wide mouth</td><td>VWR</td><td>16650-107</td><td>White trap, collection of EPN</td></tr></tbody></table>

soil sampling and isolation of entomopathogenic nematodes (steinernematidae, heterorhabditidae)

곤충 병원성 선충 (일명 EPN)은 곤충의 광범위한 기생 토양 서식하는 선충의기를 나타낸다. Steine​​rnematidae 및 Heterorhabditidae :이 선충이 두 가족에 속한다. 지금까지 70 개 이상의 종은 Steine​​rnematidae에 설명 된 약 20 종은 Heterorhabditidae에 있습니다. 선충은 장내 세균과 공생 협력 관계를 가지고 함께 그들은 곤충 종의 넓은 범위를 죽이는 강력한 살충 복잡한 역할을합니다. 여기서, 우리는 토양에서 EPN를 수집하기 위해 고려하는 가장 일반적인 기술에 초점을 맞 춥니 다. 이 프레젠테이션의 두 번째 부분은 곤충 유혹의 기술, 토양 샘플에서 EPN의 분리를위한 널리 사용되는 방식, 감염 곤충에서이 선충의 복구에 사용되는 수정 된 화이트 트랩 기술에 초점을 맞추고 있습니다. 이러한 방법과 기술은 EPN 숭배의 성공적인 설립을위한 핵심 단계입니다실험실에서 또한 URES 다른 생물 분야의 연구를위한 모델 생물로이 선충을 고려해 다른 생물 검정을위한 기초를 형성한다. 이 프리젠 테이션에 표시하는 기술은 SP 재고 실험실의 구성원뿐만 아니라 다양한 작가에 의해 설명 된 수행 및 / 또는 설계된에 해당합니다.

토양 시료 채취 EPN의 세 번째 단계 감염성 청소년은 토양에 (그림 1) 상주 이러한 선충 &#39;라이프 사이클의 유일한 자유의 생활 단계입니다. 따라서, 토양 시료를 수집하는 것은이 선충 복구하는 매우 효율적인 방법이다. 4 샘플들이 이동해야하는 깊이를 나타내는 토양 프로파일을 보여준다. 샘플의 수분을 보존하는 것은 선충의 생존을?...

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Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae, Heterorhabditidae

곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다.

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (a.k.a. EPN) represent a group of soil-inhabiting nematodes that parasitize a wide range of insects. These nematodes belong to ...

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Research

JoVE Journal

Environment

Soil Sampling and Isolation of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

24.9K 조회수.  University of Arizona.  곤충 병원성 선충은 곤충의 다양한 기생 토양에 서식하는 회충 있습니다. 각각의 토양 샘플 및 감염된 곤충 사체에서 선충의 복구를 위해 곤충 유혹하고 수정 된 화이트 트랩, 우리는 두 가지 기술을 사용하여 토양 선충의 분리에 사용되는 샘플링 방법을 보여줍니다. 

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Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes and soil organic matter formation to small-scale stable-isotope biomarker probing. Coupling multiple stable isotopes such as 13C with 15N, 18O or&#160;2H has the potential to reveal even more information about complex stoichiometric relationships during biogeochemical transformations. Isotope labeled plant material has been used in various studies of litter decomposition and soil organic matter formation1-4. From these and other studies, however, it has become apparent that structural components of plant material behave differently than metabolic components (i.e. leachable low molecular weight compounds) in terms of microbial utilization and long-term carbon storage5-7. The ability to study structural and metabolic components separately provides a powerful new tool for advancing the forefront of ecosystem biogeochemical studies. Here we describe a method for producing 13C and 15N labeled plant material that is either uniformly labeled throughout the plant or differentially labeled in structural and metabolic plant components.
Here, we present the construction and operation of a continuous 13C and 15N labeling chamber that can be modified to meet various research needs. Uniformly labeled plant material is produced by continuous labeling from seedling to harvest, while differential labeling is achieved by removing the growing plants from the chamber weeks prior to harvest. Representative results from growing Andropogon gerardii Kaw demonstrate the system&#39;s ability to efficiently label plant material at the targeted levels. Through this method we have produced plant material with a 4.4 atom%13C and 6.7 atom%15N uniform plant label, or material that is differentially labeled by up to 1.29 atom%13C and 0.56 atom%15N in its metabolic and structural components (hot water extractable and hot water residual components, respectively). Challenges lie in maintaining proper temperature, humidity, CO2 concentration,&#160;and light levels in an airtight 13C-CO2 atmosphere for successful plant production. This chamber description represents a useful research tool to effectively produce uniformly or differentially multi-isotope labeled plant material for use in experiments on ecosystem biogeochemical cycling.

Design and Operation of a Continuous 13C and 15N Labeling Chamber for Uniform or Differential, Metabolic and Structural, Plant Isotope Labeling

This method explains how to build and operate a continuous 13C and 15N isotope labeling chamber for uniform or differential plant tissue labeling. Representative results from metabolic and structural labeling of Andropogon gerardii are discussed.

연속의 설계 및 운영<sup&gt; 13</sup&gt; C 및<sup&gt; 15</sup통일 또는 차등을위한&gt; N 레이블 상공 회의소, 대사 및 구조, 식물 동위 원소 라벨링

Tracing rare stable isotopes from plant material through the ecosystem provides the most sensitive information about ecosystem processes; from CO2 fluxes ...

연구

환경과학

Integrated Field Lysimetry and Porewater Sampling for Evaluation of Chemical Mobility in Soils and Established Vegetation

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals is often not well understood. Here we demonstrate an integrated field lysimetry and porewater sampling method for evaluating the mobility of chemicals applied to soils and established vegetation. Lysimeters, open columns made of metal or plastic, are driven into bareground or vegetated soils. Porewater samplers, which are commercially available and use vacuum to collect percolating soil water, are installed at predetermined depths within the lysimeters. At prearranged times following chemical application to experimental plots, porewater is collected, and lysimeters, containing soil and vegetation, are exhumed. By analyzing chemical concentrations in the lysimeter soil, vegetation, and porewater, downward leaching rates, soil retention capacities, and plant uptake for the chemical of interest may be quantified. Because field lysimetry and porewater sampling are conducted under natural environmental conditions and with minimal soil disturbance, derived results project real-case scenarios and provide valuable information for chemical management. As chemicals are increasingly applied to land worldwide, the described techniques may be utilized to determine whether applied chemicals pose adverse effects to human health or the environment.

Field lysimetry and porewater sampling allow researchers to evaluate the fate of chemicals applied to soils and established vegetation. The goal of this protocol is to demonstrate how to install required instrumentation and collect samples for chemical analysis during integrated field lysimetry and porewater sampling experiments.

통합 필드 Lysimetry 및 Porewater 샘플링 토양에서 화학 이동성의 평가 및 설립 식물

Potentially toxic chemicals are routinely applied to land to meet growing demands on waste management and food production, but the fate of these chemicals ...

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and screening for the selection of a fast-acting, highly virulent entomopathogenic fungus are important steps. Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium, Beauveria, and Nomurea, which act by contact, are better suited than Bacillus thuringiensis or nucleopolyhedrosis virus (NPV), which must be ingested by the insect pest. In the present work, we isolated 68 Metarhizium strains from infected insects using a soil dilution and bait method. The isolates were identified by the amplification and sequencing of the ITS1-5.8S-ITS2 and 26S rDNA region. The most virulent strain of Metarhizium anisopliae was selected based on the median lethal concentration (LC50) and time (LT50) obtained in insect bioassays against III-instar larvae of Helicoverpa armigera. The mass production of spores by the selected strain was carried out with solid-state fermentation (SSF) using rice as a substrate for 14 days. Spores were extracted from the sporulated biomass using 0.1% tween-80, and different formulations of the spores were prepared. Field trials of the formulations for the control of an H. armigera infestation in pigeon peas were carried out by randomized block design. The infestation control levels obtained with oil and aqueous formulations (78.0% and 70.9%, respectively) were better than the 63.4% obtained with chemical pesticide.

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Here, we report the different stages involved in the knowledge-based development of an effective mycoinsecticide, including the isolation, identification, screening, and selection of the "best-fit" entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae, for the control of insect pests in agriculture.

개발<em&gt; 메타 리지 움 anisopliae</em&gt; Mycoinsecticide로서의 : 분리에서 현장 성능까지

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes (Steinernematidae and Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the family Enterobacteriaceae. Xenorhabdus bacteria are associated with steinernematids nematodes while Photorhabdus are symbionts of heterorhabditids. Together nematodes and bacteria form a potent insecticidal complex that kills a wide range of insect species in an intimate and specific partnership. Herein, we demonstrate in vivo and in vitro techniques commonly used in the rearing of these nematodes under laboratory conditions. Furthermore, these techniques represent key steps for the successful establishment of EPN cultures and also form the basis for other bioassays that utilize these organisms for research. The production of aposymbiotic (symbiont&#8211;free) nematodes is often critical for an in-depth and multifaceted approach to the study of symbiosis. This protocol does not require the addition of antibiotics and can be accomplished in a short amount of time with standard laboratory equipment. Nematodes produced in this manner are relatively robust, although their survivorship in storage may vary depending on the species used. The techniques detailed in this presentation correspond to those described by various authors and refined by P. Stock&#8217;s Laboratory, University of Arizona (Tucson, AZ, USA). These techniques are distinct from the body of techniques that are used in the mass production of these organisms for pest management purposes.

In vivo and In vitro Rearing of Entomopathogenic Nematodes Steinernematidae and Heterorhabditidae

The goal of this presentation is to demonstrate in vivo and in vitro techniques for the rearing of entomopathogenic nematodes. In vivo methods consider the rearing of these nematodes with an insect host, whereas the in vitro methods utilize rich agar media.

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

Entomopathogenic nematodes (EPN) (Steinernematidae and Heterorhabditidae) have a mutualistic partnership with Gram-negative Gamma-Proteobacteria in the ...

생체공학

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild nematodes in their natural environments are valuable for understanding many aspects of biology, including the selective regimes in which distinctive genomic and phenotypic characters evolve, the genetic basis for complex trait variation, and the natural genetic diversity fundamental to all animal populations. This manuscript describes a simple and efficient method for extracting nematodes from their natural substrates, including rotting fruits, flowers, fungi, leaf litter, and soil. The Baermann funnel method, a classical nematology technique, selectively isolates active nematodes from their substrates. Because it recovers nearly all active worms from the sample, the Baermann funnel technique allows for the recovery of rare and slow-growing genotypes that co-occur with abundant and fast-growing genotypes, which might be missed in extraction methods that involve multiple generations of reproduction. The technique is also well suited to addressing metagenetic, population-genetic, and ecological questions. It captures the entire population in a sample simultaneously, allowing an unbiased view of the natural distribution of ages, sexes, and genotypes. The protocol allows for deployment at scale in the field, rapidly converting substrates into worm plates, and the authors have validated it through fieldwork on multiple continents.

This protocol outlines a method for efficiently extracting live nematodes from natural substrates in the field.

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

유전학

Culturing and Genetically Manipulating Entomopathogenic Nematodes

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic of their life cycle is the mutualistic association with the bacteria Photorhabdus and Xenorhabdus, respectively. The nematode parasites are able to locate and enter suitable insect hosts, subvert the insect immune response, and multiply efficiently to produce the next generation that will actively hunt new insect prey to infect. Due to the properties of their life cycle, entomopathogenic nematodes are popular biological control agents, which are used in combination with insecticides to control destructive agricultural insect pests. Simultaneously, these parasitic nematodes represent a research tool to analyze nematode pathogenicity and host anti-nematode responses. This research is aided by the recent development of genetic techniques and transcriptomic approaches for understanding the role of nematode secreted molecules during infection. Here, a detailed protocol on maintaining entomopathogenic nematodes and using a gene knockdown procedure is provided. These methodologies further promote the functional characterization of entomopathogenic nematode infection factors.

Entomopathogenic nematodes live in symbiosis with bacteria and together they successfully infect insects by undermining their innate immune system. To promote research on the genetic basis of nematode infection, methods for maintaining and genetically manipulating entomopathogenic nematodes are described.

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

Entomopathogenic nematodes in the genera Heterorhabditis and Steinernema are obligate parasites of insects that live in the soil. The main characteristic ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

생물학

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative sparsity of information about C. elegans in its natural context comes from the challenges involved in the identification of the small nematode in nature. Despite these challenges, an increasing focus on the ecology of C. elegans has caused a wealth of new information regarding its life outside of the laboratory. The intensified search for C. elegans in nature has contributed to the discovery of many new Caenorhabditis species and revealed that congeneric nematodes frequently cohabitate in the wild, where they feed on microbial blooms associated with rotting plant material. The identification of new species has also revealed that the androdioecious mating system of males and self-fertilizing hermaphrodites has evolved three times independently within Caenorhabditis. The other two selfing species, C. briggsae and C. tropicalis, share the experimental advantages of C. elegans and have enabled comparative studies into the mechanistic basis of important traits, including self-fertilization. Despite these advances, much remains to be learned about the ecology and natural diversity of these important species. For example, we still lack functional information for many of their genes, which might only be attained through an understanding of their natural ecology. To facilitate ecological research of selfing Caenorhabditis nematodes, we developed a highly scalable method to collect nematodes from the wild. Our method makes use of mobile data collection platforms, cloud-based databases, and the R software environment to enhance researchers&#39; ability to collect nematodes from the wild, record associated ecological data, and identify wild nematodes using molecular barcodes.

A Highly Scalable Approach to Perform Ecological Surveys of Selfing Caenorhabditis Nematodes

This protocol can be used to perform large-scale ecological surveys of selfing Caenorhabditis nematodes. The primary advantage of this method is the efficient organization and analysis of ecological and molecular data associated with the nematodes collected from nature.

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

Caenorhabditis elegans is one of the major model organisms in biology, but only recently have researchers focused on its natural ecology. The relative ...

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant matter, especially rotten fruits like apples or on compost heaps. It is also associated with certain invertebrate hosts such as slugs and woodlice. These habitats are rich in microbes, which serve as food for C. elegans and which can also persistently colonize the nematode gut. To date, the exact diversity and consistency of the native C. elegans microbiota across habitats and geographic locations is not fully understood. Here, we describe a suitable approach for isolating C. elegans from nature and characterizing the microbiota of worms. Nematodes can be easily isolated from compost material, rotting apples, slugs, or attracted by placing apples on compost heaps. The prime time for finding C. elegans in the Northern Hemisphere is from September until November. Worms can be washed out of collected substrate material by immersing the substrate in buffer solution, followed by the collection of nematodes and their transfer onto nematode growth medium or PCR buffer for subsequent analysis. We further illustrate how the samples can be used to isolate and purify the worm-associated microorganisms and to process worms for 16S ribosomal RNA analysis of microbiota community composition. Overall, the described methods may stimulate new research on the characterization of the C. elegans microbiota across habitats and geographic locations, thereby helping to obtain a comprehensive understanding of the diversity and stability of the nematode's microbiota as a basis for future functional research.

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is one of the main model species in biology, yet almost all research is performed in the absence of its naturally associated microbes. The methods described here will help to improve our understanding of the diversity of associated microbes as a basis for future functional C. elegans research.

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

The nematode Caenorhabditis elegans interacts with a large diversity of microorganisms in nature. In general, C. elegans is commonly found in rotten plant ...

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

연속의 설계 및 운영

통합 필드 Lysimetry 및 Porewater 샘플링 토양에서 화학 이동성의 평가 및 설립 식물

개발

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steine​​rnematidae, Heterorhabditidae)

요약

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연속의 설계 및 운영

통합 필드 Lysimetry 및 Porewater 샘플링 토양에서 화학 이동성의 평가 및 설립 식물

개발

생체 내에서와 곤충 병원성 선충의 체외 양육 (Steinernematidae 및 Heterorhabditidae)

베어만 퍼널에 의해 야생 선충의 신속한 격리

Entomopathogenic Nematodes 배양 및 유전자 조작

토양 샘플에서 내토모 병원성 곰팡이의 격리 및 선택 및 곤충 해충에 대한 곰팡이 독성의 평가

토양 샘플에서 엔토모병원성 곰팡이를 분리하는 방법의 비교

Selfing caenorhabditis 선충류의 생태 조사를 수행하기위한 고도로 확장 가능한 접근법

모델 선충 Caenorhabditis elegans의 자연 미생물 총의 분리 및 특성화

토양 샘플링과 곤충 병원성 선충의 분리 (Steinernematidae, Heterorhabditidae)