내모병원성 곰팡이 격리를 위한 방법은 미생물 대조군 제의 를 개발하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 토양 샘플에서 높은 독성 내성 곰팡이 분리를 분리하고 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 병원성 검열의 3개의 갈래를 포함하고 효과적인 코니디아 번호 순위를 만들기 위하여 열옹옹과 코니디아 생산 분석체를 결합합니다.
이 방법은 높은 독성과 유망한 내피 병원성 새로운 곰팡이 분리를 선택하여 상용화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 생물학적 조절에 초점을 맞추고, 해충과 내모 병원성 곰팡이 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 내모 병원성 곰팡이 분리를 발견하는 데 사용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 야오치아 리우와 니안통 니, 내 실험실에서 마스터 학생입니다.
표면 토양의 1센티미터를 제거하고 삽을 사용하여 각 샘플링 부위로부터 5~10cm 깊이 내의 토양을 수집하여 토양 시료의 수집으로 시작합니다. 각 샘플링 사이트의 세부 정보를 기록한 후, 100그램의 토양 샘플을 실온에서 비닐 봉지에 수집 및 유지하여 3시간 이내에 곰팡이 격리 프로토콜을 수행한다. 잠재적인 내모병원성 균류 또는 EPF를 분리하려면 플라스틱 컵에 토양 샘플 100그램을 추가하고 매일 유충 사망률과 균주를 관찰하고 기록하여 2주 동안 어둠 속에서 실온에서 토양 표면에 테네브리오 몰리터 웜 5개를 놓습니다.
곰팡이 격리를 위해 2 주까지 죽은 애벌레를 컵에 보관하십시오. 2 주 후, 깨끗한 벤치에 죽은 곤충을 전송하고 코니디아를 수집하기 위해 멸균 이쑤시개를 사용합니다. 곰팡이의 주요 문화를 얻으려면 수집 된 코니디아를 분기 강도의 Sabouraud dextrose agar 매체 또는 SDA를 55mm 플레이트에 7 일 동안 25도에서 배양하십시오.
8일째에는 각 1차 배양균을 55mm 의 분기 강도 SDA 플레이트1개로 리행진한 후 7일 동안 25도의 문화를 배양하여 단일 곰팡이 식민지를 얻습니다. 첫 번째 병원성 검진에서는 5개의 테네브리오 몰리토르 애벌레를 각 순수 곰팡이 배양판의 표면에 직접 배치하여 섭씨 25도에 놓습니다. 10일 동안 진균과 사망률을 관찰하고 기록한 후, 추가 분석을 위해 곰팡이 분리를 선택한다.
두 번째 독성 테스트를 수행하려면, 1 분 동안 소용돌이에 의해 각 곰팡이 분리의 코니디아를 수확하고 혈류계를 사용하여 코니디아의 수를 계산합니다. 완료되면, 코니디아 서스펜션을 밀리리터당 10번의 농도로 10회 10회 10회 10회 농도로 조정하여 밀리리터당 1/7 코니디아를 0.03%의 계면활성제 용액으로 조정한 후, 10마이크로리터의 곰팡이 현탁액을 55mm 의 분기 강도 SDA 플레이트에 확산시켜 어둠 속에서 섭씨 25도에서 7일 동안 자랍니다. 8일째에는 테네브리오 몰리토르 애벌레 5개를 각각 의 표면에 직접 놓고 파라필름 필름으로 판을 밀봉하여 전년과 같이 진균과 사망률을 관찰하면서 배양한다.
각 곰팡이 격리에 대한 삼중 에서 두 번째 독성 테스트를 반복 한 후, Spodoptera 리투라와 같은 대상 해충에 대한 세 번째 독성 테스트를 수행하기 위해 격리를 선택합니다. 곰팡이 게놈 DNA 추출 키트를 사용하여 곰팡이 게놈 DNA를 추출하기 위해 7 일 분기 강도 SDA 플레이트에서 1 평방 밀리미터 EPF를 수집합니다. 다음으로, 텍스트 원고에 기재된 PCR 프로그램에 이어 DNA 샘플의 PCR에 의해 곰팡이 내부 전사 스페이서 또는 ITS 영역을 증폭한다.
상용 시퀀싱 서비스에 의해 PCR 증폭 제품을 시퀀싱한 후 NCBI BLAST를 사용하여 NCBI 데이터베이스에서 유사한 곰팡이를 검색하고 물리 유전학 분석을 위한 상대 곰팡이 종을 선택합니다. 여러 서열을 정렬하고 보존된 서열 영역을 GeneDoc과 수동으로 다듬습니다. 최소 진화, 이웃 결합 및 최대 가능성 방법에 따라 물리 유전학 분석을 수행합니다.
곰팡이의 형태를 연구하기 위해 카메라로 7 일 동안 곰팡이 배양 식민지 성장을 포착하고 성장, 형태 : 푹신푹신하거나 단단하며 식민지의 색상을 기록하십시오. conidiophores에서 코니디아를 관찰하려면, 접종 루프와 순수한 문화 곰팡이 식민지에서 코니디아를 긁어 0.1 %Tween 80 용액을 포함하는 유리 슬라이드로 포자를 전송합니다. 메스를 사용하여 곰팡이 식민지의 한천 블록을 잘라낸 다음 한천 블록을 유리 슬라이드로 옮기고 0.1%Tween 80 용액을 추가하여 한천에 과도한 코니디아의 대부분을 씻어냅니다.
다음으로, 코니아의 가벼운 현미경 관찰을 위해 커버 슬립으로 슬라이드를 덮습니다. 코니디아와 코니디오포레스의 폭과 길이를 측정하고 기록하여 다른 곰팡이 분리물의 차이를 비교합니다. 10일 동안 어둠 속에서 섭씨 25도 전후로 쿼터 강도 SDA 배지에서 선택한 곰팡이 분리를 배양하여 원예 생산 분석법을 준비합니다.
이어서 0.03%의 계면활성제 용액으로 1밀리리터 원밀리리터 원지현액을 준비하고, 그 다음에는 밀리리터당 1/7코니디아로 1회까지 농도를 조절한다. 10 마이크로리터의 원미리터를 쿼터 강도 SDA 플레이트에 추가한 후, 7일, 10일, 14일 동안 어둠 속에서 25도의 문화를 배양하여 곰팡이의 포자를 계산합니다. 매 번 코르크 보어로 식민지 중심에서 5mm 의 천 블록을 분리하고 블록을 0.03 % 계면 활성제 용액 1 밀리리터를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 센트 심분리기 튜브로 옮겨넣습니다.
15분 동안 실온에서 분당 3, 000 회전으로 튜브를 소용돌이낸 후 혈류계를 사용하여 코니디아 수를 계산합니다. 열성 편도 분석의 경우, 선택한 곰팡이를 문화하여 10번씩 밀리리터 현탁액당 1/7 코니디아로 준비한다. 소용돌이 후, 다른 시간 간격으로 45도 섭씨에서 건조 목욕에 원근 현탁액을 가열합니다.
열 노출 후, 매 시점에 55mm 분기 강도 SDA 플레이트에 5 마이크로리터의 3방울을 추가한 다음 18시간 동안 약 25도의 플레이트를 배양합니다. 발아 속도를 결정하기 위해, 빛 현미경의 밑에 5개의 무작위로 선택된 필드와 발아 한 코니디아 포자의 수를 200 배율로 계산합니다. 수식을 사용하여 총 유효 코니디아 번호 또는 ECN을 계산한 다음 원고에 설명된 바와 같이 곰팡이 균주의 원리 성분 분석 또는 PCA를 계산합니다.
대상 해충의 독성 테스트를 수행하기 위해 ECN 또는 PCA에 따라 가장 우수한 곰팡이 균주를 선택합니다. 두 번째 독성 테스트에서, 테네브리오 몰리토르 식사 벌레에 대한 26 곰팡이 분리의 독성이 평가되었다. 높은 병원성을 가진 12개의 곰팡이 격리는 Spodoptera litura에 대하여 독성 시험을 위해 선택되었습니다.
곰팡이 분류학적 위치를 더 잘 이해하기 위해, 제1 병원성 스크리닝에서 26개의 분리가 ITS 부위에 기초한 분자 분석을 실시하였다. 곰팡이 형태학적 관찰의 세척 방법을 통해, conidiophores의 구조는 0.1%Tween 80 용액으로 명확하게 볼 수 있었다. 코니디아의 색상, 모양 및 배열은 코니디아 식민지의 현미경 관찰을 통해 연구되었다.
ECN은 각 EPF의 코니디아 생산 및 열온성 데이터를 결합합니다. 곰팡이 균주의 높은 생존능력은 ECN 값이 높을 때 관찰되었다. 또한 PCA와 ECN 간의 훌륭한 조정이 밝혀지면서 ECN을 사용하여 생존 가능성 관련 매개 변수의 계층 구조를 평가할 수 있음을 시사합니다.
곰팡이 DNA를 추출하고 곰팡이 격리를 배양하는 병원성 검사는 절차에서 중요합니다. ECN 계산 공식을 사용하여 이상적인 내부 병원성 균류를 선택할 수 있습니다. 토양 샘플에서 entomopathogenic 균류를 미끼로 큰 왁스 나방과 식사 벌레와 같은 다른 곤충 종의 조합은 entomopathogenic 곰팡이의 다양성을 증가시킬 수 있습니다.
토양의 미생물 다양성은이 프로토콜의 작동 중에 매우 흥미로운 주제입니다. 또한 이 프로토콜을 통해 향후 추가 조사를 받을 수 있습니다.
