These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.

윤리 문 : 드 확인 된 인체 조직과 혈장 샘플 심사위원회 (Institutional Review Board)에서 헨드릭 의료 센터에서 얻었다 프로토콜을 승인했다. 오티 닐화 된 항체의 1 추가 참고 :이 단계의 모니터링는 선택 사항입니다. 모니터링하지 않을 경우 다른 프로토콜을 참조하십시오. <ol><li> 시중에서 판매하는 아비딘 파생 코팅 플레이트 (재료 및 장비 표 참조) 구합니다. </li><li> 우물에 50 μl의 인산염 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2를 추가합니다. 참고 : 28 ° C에서 Preinc​​ubate PBS는 온도 관련 공명 변화를 최소화합니다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어와 공백, 표준의 선택 및 샘플 플레이트 레이아웃, 설정 온도 (28 ° C), 분당 스캔의 수를 포함하는 실험 절차를 정의 할 수있는 설치 마법사를 따라 (1) 실험의 길이 ( 150 분 예비 단계를 수용). </리&gt; <li> 라벨 무료 생물 검정 스캐너로 준비 분석 플레이트를 삽입하고 첫 번째 스캔을 시작합니다. 첫 번째 스캔이 완료되면, &quot;시작하는 자체 기준&quot;을 선택합니다. 기준선은 실험의 시작에서 수집 스캔 초기 설정이다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 스캐너가 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 실행할 수 있습니다. 샘플을 첨가하여 기준의 스크린 샷은 그림 2를 참조하십시오. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 싱크대에 덤핑으로 PBS를 제거하고 접시에 제어 우물하지만 모든 [PBS의 pH가 7.2에서 10 ㎍ / ml의] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. 제어 우물에 50 μl의 PBS를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 채도가 약 1.5 시간에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 세척<html> 플레이트 200 μL 200 μL / 웰 PBS pH를 7.2 3 린스 하였다 / 웰의 인산 완충 생리 식염수 + 0.05 % 트윈 20 (PBST)로 3 회. PBS로 반복합니다. 다음 단계로 이동하기 전에 종이 타월에 판에서 초과 PBS를 누릅니다. 참고 :이 단계는 자동 평 와셔를 수행하거나 싱크대에 액체를 덤핑과 피펫 PBST를 대체하여 플레이트 200 μL PBST로 3 회 세척 할 수있다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μl의 PBS 산도 7.2을 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. </li></ol> 1 단계의 대체 프로토콜 : <ol start="13"><li> 모든 우물 [10 ㎍ / ml의 PBS] 50 μL의 RL21A 바이오틴 항체를 추가합니다. </li><li> 1.5 시간 또는 밤새 4 ° C 상온에서 품어. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li></ol>분석 대상의 jove_title &quot;&gt; 2. 추가 <ol><li> PBS를 제거하고 적절한 분석 완충액을 잘 당 50 μl를 추가합니다. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 정상 인간 혈청을 PBS에 희석 1:20 사용 하였다. </li><li> 열기 생물 검정 스캐너 소프트웨어는 실험 절차를 정의하기 위해 설치 마법사를 따라. </li><li> 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 기본 읽기 시작합니다. 문제는이 특정 판에서 수행 된 제 1 판독 경우, 온도를 평형과베이스 라인에서 드리프트를 제거하기 위해 스캐너 실행을 할 수 있습니다. </li><li> 기준선 안정화, 또는 적어도 5 스캔 후 판독을 일시 중지하고, 플레이트를 토출. </li><li> 우물에서 분석 버퍼를 제거합니다. </li><li> 와 스파이크 컨트롤 HLA A * 02 : [0.625-10 ㎍ / ㎖의]에서 분석 버퍼에 이르기까지 관련 (FLSL) 또는 농도 무관 (SLLV, YLEV, 또는 KVL) 펩티드 베어링 01 단량체. 플레이트의 대조군 웰에 표준의 50 μL를 추가 </li><li> 샘플 분석 버퍼 분석 50 μl를 추가플레이트의 웰. 이 분석을 위해, 상업적으로 입수 한 인간 혈청을 사용 하였다 아군. </li><li> 약 30 ~ 60 분 다시 생물 검정 스캐너에 플레이트를 삽입하고 포화 상태에 도달 할 때까지 읽기를 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 일시 정지 판을 꺼냅니다. </li><li> 200 μL와 접시 3 회 반복한다 / 잘 PBST 단계 1.9에서와 같이 200 μL / 잘 PBS 3 린스 하였다. </li><li> 모든 활성 우물에 50 μL 분석 버퍼를 추가합니다. </li><li> 다시 생물 검정 스캐너에 접시를 넣고 세척 후 공명을 모니터링 읽고 다시 시작합니다. </li><li> 읽기를 중지하고 판을 꺼냅니다. 주 : 검정 완충액은 PBS, 조직 배양 배지, 또는 상기 분석의 목표에 따라 PBS에 1:20으로 희석 인간 혈청 일 수있다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어 또는 반출 바람직한 통계 분석 소프트웨어 원시 데이터 파일을 사용하여 분석한다. 생물학적 검정 스캐너 소프트웨어가 자동 결합에 기초하여 곡선을 생성실험 설치하는 동안 제공 플레이트 레이아웃. 주 : 분석을 위해 생물학적 정량 스캐너 소프트웨어를 사용하지 않는 경우, 단계를 수행 3.2-3.4. </li><li> 이후의 각 데이터 포인트에서 기저선 및 음성 대조군을 뺀다. </li><li> 각 시점에서의 복제에 웰에 대한 평균 및 표준 편차를 계산한다. </li><li> 막대 그래프의 결합 곡선을 선택하거나 엔드 포인트 데이터의 그래프를 생성합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Shastri, N., Schwab, S., Serwold, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Producing+nature's+gene-chips:+the+generation+of+peptides+for+display+by+MHC+class+I+molecules.">Producing nature's gene-chips: the generation of peptides for display by MHC class I molecules.</a> Annu Rev Immunol. 20, 463-493 (2002).</li><li>Peaper, D. R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+MHC+class+I+assembly+and+peptide+binding.">Regulation of MHC class I assembly and peptide binding.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 343-368 (2008).</li><li>Hawkins, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HLA-presented+fragment+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+is+a+therapeutic+target+for+invasive+breast+cancer.">An HLA-presented fragment of macrophage migration inhibitory factor is a therapeutic target for invasive breast cancer.</a> J Immunol. 186 (11), 6607-6616 (2011).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibody+targets+a+specific+peptide/HLA+class+I+complex+and+significantly+impedes+tumor+growth+in+vivo+using+breast+cancer+models.">TCR mimic monoclonal antibody targets a specific peptide/HLA class I complex and significantly impedes tumor growth in vivo using breast cancer models.</a> J Immunol. 184 (4), 2156-2165 (2010).</li><li>Verma, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TCR+mimic+monoclonal+antibodies+induce+apoptosis+of+tumor+cells+via+immune+effector-independent+mechanisms.">TCR mimic monoclonal antibodies induce apoptosis of tumor cells via immune effector-independent mechanisms.</a> J Immunol. 186 (5), 3265-3276 (2011).</li><li>Bassani-Sternberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+plasma+HLA+peptidome+as+a+potential+source+for+cancer+biomarkers.">Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18769-18776 (2010).</li><li>Hickman, H. D., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mining+the+plasma+immunopeptidome+for+cancer+peptides+as+biomarkers+and+beyond.">Mining the plasma immunopeptidome for cancer peptides as biomarkers and beyond.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18747-18748 (2010).</li><li>Neethling, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+vaccine+potency+using+TCRmimic+antibodies.">Assessing vaccine potency using TCRmimic antibodies.</a> Vaccine. 26 (25), 3092-3102 (2008).</li><li>Mittendorf, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trial+results+of+the+HER-2/neu+(E75)+vaccine+to+prevent+breast+cancer+recurrence+in+high-risk+patients:+from.">Clinical trial results of the HER-2/neu (E75) vaccine to prevent breast cancer recurrence in high-risk patients: from.</a> US Military Cancer Institute Clinical Trials Group Study I-01 and I-02. Cancer. 118 (10), 2594-2602 (2012).</li><li>Winter, H., Fox, B. A., Ruttinger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Future+of+cancer+vaccines.">Future of cancer vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1139, 555-564 (2014).</li><li>Magnusson, R., Wawro, D., Zimmerman, S., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resonant+photonic+biosensors+with+polarization-based+multiparametric+discrimination+in+each+channel.">Resonant photonic biosensors with polarization-based multiparametric discrimination in each channel.</a> Sensors. 11 (2), 1476-1488 (2011).</li><li>Kaja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+novel+biomarkers+for+ovarian+cancer+with+an+optical+nanotechnology+detection+system+enabling+label-free+diagnostics.">Detection of novel biomarkers for ovarian cancer with an optical nanotechnology detection system enabling label-free diagnostics.</a> J Biomed Opt. 17 (8), 081412-081411 (2012).</li><li>Magnusson, R., Wang, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+principle+for+optical+filters.">New principle for optical filters.</a> Appl. Phys. Lett. 61, 1022-1024 (1992).</li><li>Wawro, D., Tibuleac, S., Magnusson, R., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+fiber+endface+biosensor+based+on+resonances+in+dielectric+waveguide+gratings.">Optical fiber endface biosensor based on resonances in dielectric waveguide gratings.</a> Proc. SPIE. 3911, 86-94 (2000).</li><li>Altman, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+antigen-specific+T+lymphocytes.">Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes.</a> Science. 274 (5284), 94-96 (1996).</li></ol>

저자, 데브라 Wawro Weidanz와 로버트 마 그누 손은이 문서에서 사용되는 생물 검정 플레이트 리더와 분석 플레이트를 생산 공진 센서 법인에서 각각 최고 경영자 (CEO)와 최고 기술 책임자 (CTO)이다.

본원에 기재된 방법은 높은 처리량 환자의 혈청, 혈장, 소변 또는 타액 시료에 가용성 펩티드 / HLA 복합체의 신속한 검출을 가능 96- 또는 384- 웰 포맷 것이다 암 진단을위한 바이오 마커 스크리닝 시스템을 소개한다. 모노클로 날 항체 및 라벨없는 검출 시스템을 흉내 T 세포 수용체를 이용하여 상기 분석 시스템은 통상의 ELISA에 의해 3.5 시간에 비해 1 시간 미만으로 분석 시간을 삭감. 이 높은 처리량 방법은 치료 암 백신 또는 바이오 의약품에 대한 임상 시험에 환자의 신속한 계층화 할 수 있습니다. 이러한 질병 표적 검출을위한 현재의 방법은 개별 환자 샘플 번거롭고 시간 소모적 프로세스의 친 화성 정제 및 HPLC-MS / MS를 필요로한다. 이 방법은 종래의 ELISA 기법 의무가 있지만, 이러한 우려를 방지 β2 마이크로 글로불린 항체와 같은 보조 검출 시약은 초기 HL의 구조를 변경할 수있다분자는 TCRM 제한 검출에 결합 억제한다. 라벨없는 검출은 이러한 우려를 완화. 이 과정은 이러한 표면 플라즈몬 공명 시스템으로 다른 라벨없는 시스템에서 사용하기 위해 수정 될 수있다. 그러나이 크게 본 연구에서 사용 된 생물학적 검정 시스템에 비해 높은 처리 능력을 감소시킬 것이다. 이 프로토콜은 효과적으로 몇 가지 중요한 단계 준수와 환자의 혈청 및 혈장 비 HLA 바이오 마커의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. &lt;200 PM 시프트 가능성 후속 검출 단계 낮은 신호 발생하므로 초기 항체 코팅 공정의 모니터링은, 표면의 최적화를 위해 권장된다. 혈청 단백질의 풍부가 낮은 농도 분석의 결합 마스크 수 있으므로 기준 및 사후 세척 읽기는 엔드 포인트 분석하는 데 유용합니다. 마지막으로, 샘플의 온도 변화에 잘 잘 변화에 발생할 수 있습니다. 그것은 모든 샘플을 미리 배양하는 것이 좋습니다D 라벨없는 biosassay 부 온도 컨트롤러는 실온 이상에서 2-3 ℃로 설정 될 수있다. 냉장 샘플 작동 온도에 도달 할 수있는 충분한 시간을 허용한다. 이 프로토콜의 장래 변형이 플​​레이트 표면에 TCRM의 다중화를 포함한다. 생물 검정 시스템은 적어도 8 플렉스의 밀도로 우물의 안보에 현재 의무가 있습니다. 시험 샘플 볼륨 당, 각 웰에 4-8 TCRM을 도입함으로써 감소 및 환자 당 점점 복잡한 데이터의 수집을 가능하게한다. 이 기능은 더 치료 옵션과 관련하여 환자를 제공하는 계기가 될 것이다.

클래스 I 인간 백혈구 항원 (HLA)의 시료 세포 내 단백질의 레퍼토리 프로 테오 분해로부터 유도 된 길이가 8-11 개의 아미노산의 펩티드는 모든 유핵 세포 1,2- 표면의 펩타이드를 제공한다. HLA 복합체 순환은 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 (도 1) 각각의 셀의 상태를 나타내는 &quot;자연의 바이오 마커&quot;이다. CTL에 의해 일으키는 세포의 제거에 질병 관련 펩티드 결과의 인식. 따라서, 적응 면역 반응이 바이러스 감염 및 종양의 제거에 매우 효과적이다. 그러나 면역 체계는 종종 효과적인 CTL 응답을 회피 할 수있는 바이러스 나 종양에 대한 선택을 촉진 압력을가한다. 모방하는 T 세포 수용체 (TCRM) 모노클로 날 항체의 특정 펩티드 / HLA-A * 02 인식 (모노클로 날 항체) : 유방암 관련 단백질, 대 식세포 이동 억제 인자로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 (MIF19-27) 3 및 NY-ESO-1은 157-165, CTL은 4,5- 대응 방법 효과적인 항 종양의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 이 작업은 대표적인 인구의 30 %까지 발현 HLA-A * 0201 분자에 집중된다. 그러나, TCRM의 생산 다음에 다른 관련 HLA / 펩타이드 복합체의 식별은 훨씬 광범위한 인구 작품의 유틸리티를 확대하고, 대상 면역 요법과 동반 질환 진단의 개발을 가능하게한다. 세포 표면에 대한 결합 펩티드 / HLA 복합체의 부분은 플라즈마 내로 방출된다. 때문에 HLA 관련 바이오 마커의 immunopeptidome 광산에 대한 펩타이드 / HLA 풀, 현재의 방법의 매우 복잡한 특성으로 인해 시간이 소요됩니다. 이 프로세스는 플라즈마로부터 가용성 HLA의 친 화성 정제를 필요로 역상 고압 액체 크로마토 연관된 HLA 펩티드의 분리탠덤 질량 분광법 (MS / MS) -6,7- 그래피 (RP-HPLC) 및 펩타이드 서열. 이 프로세스는 신규 한 치료 적 표적의 발견을위한 가능한 선택이지만, 이미 치료 백신 또는 바이오 파이프 라인 80-10에서 HLA 연관된 타겟 동반자 진단 도구로 성가신 과정이다. 이러한 목표는 관련 임상 시험에 환자를 계층화하고 더 많은 정보 치료 옵션을 제공하기위한 신속한 동반자 진단 개발을위한 도구를 제공에 대해 TCRM은 지시했다. 본 연구에서는 암 진단을위한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템은 TCRM 최소한의 처리 단계와 생물학적 상호 작용을 모니터링하는 라벨이없는 생물 검정 시스템을 사용하는 표시됩니다. 라벨없는 생물 분석 시스템은 유전체 도파로 격자 11-14 발생 가이드 모드 공명 (GMR) 효과를 이용한 방법에 기초한다. 때 광대역 빛이 접촉 회절을이 시스템에 필요한 접시에 격자, 두 가지 특정 파장이 반영됩니다. 고정화 된 수용체와 리간드 간의 결합 상호 작용이 스펙트럼 분석기 (12)와 공명 파장 시프트를 추적하여 실시간으로 모니터링된다. 별도의 공진 피크는 입사 TE (입사면에 수직 전기 벡터) 및 TM (입사면에 수직 인 자기 벡터) 잠재적 11,14 검출 정밀도를 높일 수있는 다수의 데이터 포인트를 제공하는 편광 상태에 대해 발생한다. 이 라벨없는 측정계 항체 미리 감응 플레이트를 사용하여 데이터 분석을 분석 실행 시간은 약 45 분이다. 또한, 다수의 환자 샘플을 HPLC-MS / MS 기반 포맷 위에, 96- 또는 384- 웰 포맷 분명한 이점을 심문 할 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1191">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:521px;"><a name="RANGE!A1:D29">Name of the Material/Equipment</a></td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoSens Label-free Bioassay Detection System</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ResoVu software</td>
			<td>Resonant Sensors Incorporated</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL21A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RL9A Biotinylated TCRm mAb&#160;</td>
			<td>PureMHC, LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FLSL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: FLSELTQQL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SLLV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: SLLMWITQV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YLEV HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: YLEPGPVTV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KVL HLA-A*02:01 Monomer&#160;</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td>full peptide sequence: KVLEYVIKV</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pooled Normal Human Serum&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP2657100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MDA-MB-231 Cell Supernatant</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td style="width:355px;">Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iscove&#39;s Modification of Dulbecco&#39;s Medium (IMDM)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440-053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070-63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5318-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP665-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,2&#8217;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>37615</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">rabbit anti-human &#946;2 microglobulin&#160;</td>
			<td>Dako</td>
			<td>A0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111-035-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc&#160; microplates</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td align="right">439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Synergy 2 microplate reader</td>
			<td>Biotek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpress Reagent Kit</td>
			<td>Vector</td>
			<td>MP-7402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immpact DAB</td>
			<td>Vector</td>
			<td>SK-4105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hematoxylin QS</td>
			<td>Vector</td>
			<td>H3403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2b</td>
			<td>MP BioMedicals</td>
			<td>50330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-HLA-A2 (BB7.2)</td>
			<td>Experimmune</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prism 5</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of human leukocyte antigen biomarkers in breast cancer utilizing label-free biosensor technology

미국 암 학회 (American Cancer Society)에 따르면, 20 만 명 이상의 여성들이 침습적 유방암 매년 진단되고 약 40,000 병으로 죽을 것이다. 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I의 세포 단백질 시료 프로 테오 분해로부터 유도 된 펩티드를 순환 및 세포 독성 T 림프구 (CTL)에 의해 심문 세포 표면에 이러한 단편을 제시한다. T 세포 수용체 모방의 발생 (TCRM) 모노클로 날 항체 유방암 인식 (모노클로 날 항체) 특정 펩타이드 / HLA-A * 02 : 대 식세포 이동 억제 인자 (MIF 19-27) 및 NY-ESO-로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 1 157-165은 효과적인 항 종양 CTL 반응의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 본래 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 유방암 세포에 의해 창고 및 잠재적으로 관련 암 바이오 마커를 표현하고 있습니다. 이 작품은, 진단 암에 대한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템에서T 세포 수용체를 가이드 모드 공명 (GMR) 센서 기술을 이용하여 신규, 라벨없는 바이오 센서와 결합 모방 모노클로 날 항체를 포함하는 s를 제공한다. 창고 MIF / HLA-A의 검출은 * 02 : MDA-MB-231 세포 상층 액 01 단지는, 인간 혈청 아군, 환자 플라즈마가 설명된다. 이 작품의 영향을 대상으로 면역을위한 동반자 질환 진단의 개발을 통해 맞춤 의학 혁명을 가져다 줄 수있을 것이다.

01 분자 3 : 실험의 대표적인 세트는 HLA-A * 02의 컨텍스트 내에서 잘 특성화 TCRM, RL21A, 특히 펩티드를 인식 쥐의 IgG2a 단클론 항체 (MIF 19-27 또는 FLSL)를 사용하여 수행 하였다. 동족 펩티드 / HLA 단량체뿐만 아니라 부적합 HLA 단량체 (15)은 설명 된 절차를 보여주기 위해 사용 하였다. (3)는 분석 포맷을 도시한다. RL21A 다른 펩타이드 / HLA가 3 복합체와 작은 교차 반응성 FLSL / HLA 모노머에 대한 특정이다. 이 특이성은 라벨없는 생물 분석 시스템 (도 4)를 사용하여 효과적으로 요약된다. 고정화 FLSL / HLA 단량체 (도 5)에 RL21A 항체의 적정에 의해 측정이 실험 라벨없는 생물 검정 시스템의 감도가 낮은 나노 몰 범위이다. 백그라운드 신호 크게 혈청 샘플에서 증가 하였지만,이야인간 혈청에서 스파이크 된 FLSL / HLA 단량체 pecific 검출은도 6에서 달성되고, 농도 구배를 용이하게 식별 가능한 이들 샘플이다. 마지막으로, MDA-MB-231 세포주로부터의 상층 액은, 이전 FLSL / HLA-A * 02 제시 도시 : 01 분자를,이 라벨없는 분석 플랫폼 (도 7)를 사용하여 수용성 FLSL 단량체를 포함하도록 도시된다. FLSL / HLA 단량체 이후 추가 RL21A에 신호 (그림 7)을 증가시킨다. 인해 시스템의 감도, 웰에도 4 및도 5에 표준 편차의 함수로서와 같이 온도 변화의 결과로 발생할 수있는 음의 공진 시프트 포함한 잘 변동. 이러한 변화는 실온의 약간 과량 (즉, 28 ° C)의 온도에서 모든 샘플 및 생물학적 검정 플레이트 판독기의 사전 인큐베이션 대폭 저감 할 수있다. 간단히도 8에서, (96)- 그럼 폴리스티렌 플레이트를 코팅 하였다 [10 ㎍ / ml의] RL21A의 PBST로 세척하고 0.5 % 저지방 우유, 블로킹 및 일련 희석액을 실온에서 2 시간 동안 인큐베이션 PBST로 세척하고, 실온에서 2 시간, 대 정상적인 인간 혈청 FLSL HLA 단량체는 표준 곡선을 생성하기 위해 PBS에 1:10으로 희석 또는 환자 혈장은 PBS에 1:10으로 희석. HLA 손상을 검출하고, PBST 세척 : 플레이트를 PBST로 세척하고, 토끼 항 - 인간 β2 마이크로 글로불린에의 [5000 (1)]와 함께 실온에서 1 시간 배양 하였다. 플레이트를 염소 항 - 토끼 IgG를 [1 : 10,000]에 30 분 동안 인큐베이션시키고, PBST로 세척 하였다. 비색 검출 ABTS (2,2&#39;- Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6​​-술폰산] -diammonium 염) 15 분의 배양 시간과 기판 및 마이크로 플레이트 판독기에서 405 nm에서 관찰을 사용하여 수행 하였다. FLSL / HLA 세 환자 샘플에서 검출되었다. 도 8b에서, 환자 플라즈마 RL.064는 PBS에 1:20으로 희석 한 후 추가되었다판 ED 60 분의 레이블이없는 검출기에서 모니터링. 환자 혈청에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 스튜던트 t 시험 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.05)를 사용하여 수행 하였다. 도 8c에, 조직 절편은 양성 대조군 마우스 항 - HLA-A2 (BB7.2) RL21A, 각각의 IgG2a 및 IgG2b의 네거티브 컨트롤 1 ㎍ / ㎖의에 염색 하였다. 염색은 제조업체의 지시에 따라 핵 염색 항 마우스 검출 키트, DAB (diaminobenzadine)와 헤 마톡 실린 QS를 사용하여 검출되었다. RL21A으로 종양 조직의 염색은 FLSL / HLA 복합체의 프리젠 테이션을 확인합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig1highres.jpg" /> 도 1 :. 클래스 I 인간 백혈구 항원에 의해 종양 항원 제시 변환 암성 세포 질환이다. HLA 샘플 intracellul아칸소 단백질과 세포 표면에서 암 관련 변경 사항을 알 수있다. CTL과 TCRM 그 세포에 별개의 HLA-펩타이드 복합체를 통해 암 세포를 인식 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig2highres.jpg" /> 그림 2 :. 초기 기준을 보여주는 데이터 수집의 생물 검정 스캐너 ​​소프트웨어에서 데이터 수집의 스크린 샷 예는 FLSL / HLA 복합체의 10 ㎍ / ml로 코팅 된 플레이트에 RL21A 항체를 첨가하여 검색합니다. 항체의 농도는 표시됩니다. 각 라인은 개인이 아니라 시간이 지남에 따라 모니터링 나타냅니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig3highres.jpg" /> 그림 3 :. 분석 플레이트 캡처 확인해의 회절 격자 표면에 고정 항체의 분석 형식의 그림evant 펩타이드 / 솔루션 HLA 복합체. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig4highres.jpg" /> 그림 4 :. 관련이없는 HLA 모노머 (YLEV, SLLV 및 KVL)에 비해 그 관련 (FLSL) HLA 모노머에 대한 바이오틴 RL21A TCRM의 특이성의 FLSL / HLA 복잡한 데모에 대한 RL21A의 특이성. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 표면에 고정화하고, 검출에 표지 된 PBS 또는 무관 관련 HLA 단량체 [10 ㎍ / ㎖의]를 사용하여 수행 하였다. RL21A는 FLSL / HLA 단지에 대한 특정했다. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.001)를 이용하여 수행 하였다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig5highres.jpg" /> 그림 5 :. detecti의 동종의 펩타이드 / HLA 복합체 RL21A의 감도를 바인딩 그림제한 및 FLSL / HLA 복합체 RL21A의 감도를 결합합니다. 비 오티 닐화 된 HLA 단량체 FLSL [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 플레이트 표면에 고정화하고, 지시 된 바와 같이 표지 된 RL21A는 PBS에서 연속 희석으로 플레이트에 첨가 하였다. 이 시스템에 대한 인식은 낮은 나노 몰 범위에 있었다. <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig6highres.jpg" /> 그림 6 :. 인간 혈청에서 HLA의 검출의 가시 박힌 인간 혈청 데모에서 HLA 단지의 검출. 오티 닐화 RL21A TCRM [10 ㎍ / ㎖를 상기 분석 아비딘 코팅 된 플레이트 상에 고정화시켰다. 관련 (FLSL) 또는 무관 (SLLV) HLA 단량체와 아군 풀링 정상적인 인간 혈청은 PBS에 1:20으로 희석 한 다음 판에 추가하고 60 분 동안 라벨없는 검출기에서 측정 하였다. 인간 혈청에 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출은 달성되었다. 일반적으로, 백그라운드 신호 (부적합 SLLV 단량체) 높다ER 희석 혈청 샘플 분석 PBS에서 정제하여 (도 4 참조)에 비해. 양방향 그래프는 ANOVA 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/52159/52159fig7highres.jpg" /> 도 7 :. 가용성 HLA 복합체가 유방암 세포 배양 상청액에서 검출 유방암 세포 상청액 HLA를 감지하는 능력이 입증된다. 오티 닐화 RL21A TCRM, RL9A TCRM (음성 대조군), 및 이소 제어 분석 플레이트의 표면에 고정시켰다. 아군 [5 ㎍ / ㎖의] unspiked 및 MDA-231 세포 배양 상등액을 첨가하고, 라벨없는 검출기에서 60 분 동안 결합​​을 모니터링 하였다. FLSL 및 SLLV HLA 단량체 샘플 RL9A과 RL21A 바인딩에 대한 긍정적 인 컨트롤을 나타냅니다 아군. 일방향 ANOVA는 그래프 및 통계 소프트웨어 (p &lt;0.0001)을 사용하여 수행 하였다. 그림 8 :. 환자 샘플에서 FLSL / HLA 복합체의 특정 검출 (A) 면역 흡착제 분석 (ELISA) 링크 전통적인 효소는 환자의 혈장에서 FLSL / HLA 특정 단지를 검출하기 위해 사용 하였다. (B) 바이오틴이 RL21A TCRM 또는의 IgG2a는 [10 μg의는 / ㎖]하는 아비딘 분석 플레이트에 고정되었다. 환자 RL.064에서 (C) 유방 종양 조직 이전에 FLSL / HLA 복합체의 종양 프리젠 테이션을 확인하기 위해 3 기술로 염색했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52159/52159fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Detection of Human Leukocyte Antigen Biomarkers in Breast Cancer Utilizing Label-free Biosensor Technology

그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.

라벨이없는 바이오 센서 기술을 활용 유방암 인간 백혈구 항원 바이오 마커의 검출

According to the American Cancer Society, more than 200,000 women will be diagnosed with invasive breast cancer each year and approximately 40,000 will ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.4K 조회수.  Texas Tech University Health Sciences Center.  그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다. 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

접착제 테이프 기반의 샘플링 및 형광의 조합 현장에서</em의 신속한 감지를 위해> 하이브 리다이 제이션 살모넬라균 신선한 농산물에 대한

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Detection of Invasive Pulmonary Aspergillosis in Haematological Malignancy Patients by using Lateral-flow Technology

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell transplant recipients1. Detection of IPA represents a formidable diagnostic challenge and, in the absence of a 'gold standard', relies on a combination of clinical data and microbiology and histopathology where feasible. Diagnosis of IPA must conform to the European Organization for Research and Treatment of Cancer and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycology Study Group (EORTC/MSG) consensus defining "proven", "probable", and "possible" invasive fungal diseases2. Currently, no nucleic acid-based tests have been externally validated for IPA detection and so polymerase chain reaction (PCR) is not included in current EORTC/MSG diagnostic criteria.
Identification of Aspergillus in histological sections is problematic because of similarities in hyphal morphologies with other invasive fungal pathogens3, and proven identification requires isolation of the etiologic agent in pure culture. Culture-based approaches rely on the availability of biopsy samples, but these are not always accessible in sick patients, and do not always yield viable propagules for culture when obtained.
An important feature in the pathogenesis of Aspergillus is angio-invasion, a trait that provides opportunities to track the fungus immunologically using tests that detect characteristic antigenic signatures molecules in serum and bronchoalveolar lavage (BAL) fluids. This has led to the development of the Platelia enzyme immunoassay (GM-EIA) that detects Aspergillus galactomannan and a 'pan-fungal' assay (Fungitell test) that detects the conserved fungal cell wall component (1 &rarr;3)-&beta;-D-glucan, but not in the mucorales that lack this component in their cell walls1,4. Issues surrounding the accuracy of these tests1,4-6 has led to the recent development of next-generation monoclonal antibody (MAb)-based assays that detect surrogate markers of infection1,5.
Thornton5 recently described the generation of an Aspergillus-specific MAb (JF5) using hybridoma technology and its use to develop an immuno-chromatographic lateral-flow device (LFD) for the point-of-care (POC) diagnosis of IPA. A major advantage of the LFD is its ability to detect activity since MAb JF5 binds to an extracellular glycoprotein antigen that is secreted during active growth of the fungus only5. This is an important consideration when using fluids such as lung BAL for diagnosing IPA since Aspergillus spores are a common component of inhaled air. The utility of the device in diagnosing IPA has been demonstrated using an animal model of infection, where the LFD displayed improved sensitivity and specificity compared to the Platelia GM and Fungitell (1 &rarr; 3)-&beta;-D-glucan assays7.
Here, we present a simple LFD procedure to detect Aspergillus antigen in human serum and BAL fluids. Its speed and accuracy provides a novel adjunct point-of-care test for diagnosis of IPA in haematological malignancy patients.

A rapid and accurate point-of-care test for invasive pulmonary aspergillosis is presented. It takes advantage of lateral-flow technology using a specific monoclonal antibody that binds to an Aspergillus antigen secreted during pulmonary infections. The assay is compatible with serum and brochoalveolar lavage and represents a novel adjunct test for disease diagnosis.

측면 흐름 기술을 사용하여 Haematological 강한 악의 환자에서 침윤성 폐 아스 페르 길 루스 증의 탐지

Invasive pulmonary aspergillosis (IPA) is a leading cause of morbidity and mortality in haematological malignancy patients and hematopoietic stem cell ...

Utilizing the Antigen Capsid-Incorporation Strategy for the Development of Adenovirus Serotype 5-Vectored Vaccine Approaches

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these traditionally modified Ad5 vectors in clinical trials could be primarily correlated with Ad5 pre-existing immunity (PEI) among the majority of the population. To promote Ad5-vectored vaccine development by solving the concern of Ad5 PEI, the innovative Antigen Capsid-Incorporation strategy has been employed. By merit of this strategy, Ad5-vectored we first constructed the hexon shuttle plasmid HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S by subcloning the hypervariable region (HVR) 1 of hexon into a previously constructed shuttle plasmid HVR5-His6/pH5S, which had His6 tag incorporated into the HVR5. This HVR1 DNA fragment containing a HIV epitope ELDKWAS was synthesized. HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S was then linearized and co-transformed with linearized backbone plasmid pAd5/&#8710;H5 (GL) , for homologous recombination. This recombined plasmid pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 was transfected into cells to generate the viral vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6. This vector was validated to have qualitative fitness indicated by viral physical titer (VP/ml), infectious titer (IP/ml) and corresponding VP/IP ratio. Both the HIV epitope and His6 tag were surface-exposed on the Ad5 capsid, and retained epitope-specific antigenicity of their own. A neutralization assay indicated the ability of this divalent vector to circumvent neutralization by Ad5-positive sera in vitro. Mice immunization demonstrated the generation of robust humoral immunity specific to the HIV epitope and His6. This proof-of-principle study suggested that the protocol associated with the Antigen Capsid-Incorporation strategy could be feasibly utilized for the generation of Ad5-vectored vaccines by modifying different capsid proteins. This protocol could even be further modified for the generation of rare-serotype adenovirus-vectored vaccines.

Here, we present a protocol to generate a proof-of-principle divalent adenovirus type 5 (Ad5) vector Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 by utilizing the Antigen Capsid-Incorporation strategy. This vector was demonstrated to exhibit qualitative fitness, the capability to escape Ad5-positive sera in vitro, and the antigenicity as well as immunogenicity to the incorporated antigens.

아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

Adenovirus serotype 5 (Ad5) has been extensively modified with traditional transgene methods for the vaccine development. The reduced efficacies of these ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

Vivo에서 예방 접종 모델을 사용 하는 항 원 특정 T-셀 Cytolytic 함수의 검색에 대 한 분석 결과

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the detection of biomarkers, contaminants, and other molecules of interest. A commonly used technique for this purpose is the Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), where often one antibody is directed towards a specific target molecule, and a second labeled antibody is used for the detection of the primary antibody, allowing for the absolute quantification of the biomolecule under study. However, the usage of antibodies as recognition elements limits the robustness of the method; as does the need of using labeled molecules. To overcome these limitations, molecular imprinting has been implemented, creating artificial recognition sites complementary to the template molecule, and obsoleting the necessity of using antibodies for initial binding. Further, for even higher sensitivity, the secondary labeled antibody can be replaced by biosensors relying on the capacitance for the quantification of the target molecule. In this protocol, we describe a method to rapidly and label-free detect and quantitate low-abundant biomolecules (proteins and viruses) in complex samples, with a sensitivity that is significantly better than commonly used detection systems such as the ELISA. This is all mediated by molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

Here, we present a protocol for the detection and quantification of low abundant molecules in complex solutions using molecular imprinting in combination with a capacitance biosensor.

분자 각 인을 사용 하 여 생체의 磁 검출 용량 성 바이오 센서 기반

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in human sera and in separate preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin (IVIg). The protocol describes the methodological steps involved in sample preparation, printing of arrays, assay procedure, and data analysis. In addition, this protocol could be further developed to incorporate diverse clinical samples including plasma and cell culture supernatants. We show how protein microarray can be used to determine a combination of isotype (IgG, IgA, IgM), subclass (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), and strain-specific antibodies to highly purified whole C. difficile toxins A and B (toxinotype 0, strain VPI 10463, ribotype 087), toxin B from a C. difficile toxin-B-only expressing strain (CCUG 20309), a precursor form of a B fragment of binary toxin, pCDTb, ribotype-specific whole surface layer proteins (SLPs; 001, 002, 027), and control proteins (tetanus toxoid and Candida albicans). During the experiment, microarrays are probed with sera from individuals with C. difficile infection (CDI), individuals with cystic fibrosis (CF) without diarrhea, healthy controls (HC), and from individuals pre- and post-IVIg therapy for the treatment of CDI, combined immunodeficiency disorder, and chronic inflammatory demyelinating polyradiculopathy. We encounter significant differences in toxin neutralization efficacies and multi-isotype specific antibody levels between patient groups, commercial preparations of IVIg, and sera before and following IVIg administration. Also, there is a significant correlation between microarray and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antitoxin IgG levels in serum samples. These results suggest that microarray could become a promising tool for profiling antibody responses to C.difficile antigens in vaccinated or infected humans. With further refinement of antigen panels and a reduction in production costs, we anticipate that microarray technology may help optimize and select the most clinically useful immunotherapies for C. difficile infection in a patient-specific manner.

A Protein Microarray Assay for Serological Determination of Antigen-specific Antibody Responses Following Clostridium difficile Infection

This article describes a simple protein microarray method for profiling humoral immune responses to a 7-plex panel of highly purified Clostridium difficile antigens in human sera. The protocol can be extended for the determination of specific antibody responses in preparations of polyclonal intravenous immunoglobulin.

항 원 특정 항 체 응답 다음 Clostridium 남과 어울리지 않 는 감염의 혈 청 학적인 결정에 대 한 단백질 Microarray 분석 결과

We provide a detailed overview of a novel high-throughput protein microarray assay for the determination of anti-Clostridium difficile antibody levels in ...

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource to evaluate a variety of pulmonary diseases, both for research and clinical purposes. However, due to the heterogeneous and viscous nature of patient mucus, there is currently no reliable dissociation method that does not damage the host immune cells in the patient airway secretion. In this research, we introduce a sample preparation method that uses inertial microfluidics for the patient&#39;s immune assessment. Regardless of the heterogeneous fluidic properties of the clinical samples, the proposed method recovers more than 95% of neutrophils from airway secretion samples that are diluted 1,000-fold with milliliters of clean saline. By recirculating the concentrated output stream to the initial sample reservoir, a high concentration, recovery, and purity of the immune cells are provided; recirculation is considered a trade-off to the single-run syringe-based operation of inertial microfluidics. The closed-loop operation of spiral microfluidics provides leukocytes without physical or chemical disturbance, as demonstrated by the phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-induced elastase release of sorted neutrophils.

In this research, we demonstrate a label-free neutrophil separation method from clinical airway secretions using closed-loop operation of spiral inertial microfluidics. The proposed method would expand the clinical in vitro assays for various respiratory diseases.

폐쇄 루프 관성 마이크로 사용 하 여 환자 파생 기도 분 비에서 레이블 없는 호 중구 농축

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...