The present study was funded in part by a Research Initiation Grant (RIG) from the University of North Texas to Dr. McFarlin. The authors did not receive direct funding for the completion of this study and report no conflict of interest.

참고 :이 방법에 설명 된 모든 혈액 수집 절차가 헬싱키 선언에 따라 실시 및 인체에 대한 UNT 기관 검토위원회 (IRB)의 승인을했다. 모든 과목은 혈액들이 정상 체중, 건강 해 보이는되었는지 확인하기 위해 본 발명의 방법에 사용 된 수집, 질병 무료 서면 동의를했다. 1. 시약 소스 및 준비 <ol><li> 사용 CD66b-APC (클론 # 1 G10F5; DF = 1 : 50) 및 CD45-APCeFluor780 (클론 # 2D1 = 1 DF : 50)이 분석합니다. 참고 : 이전 연구에, CD45와 CD66b 항체는 최적의 희석을 결정하기 위해 titered 된 다른 백혈구에서 명확하게 해결 과립구 (CD45 + / 66B의 +) (CD45 + / 66b-) 11. 염색에 대한 희석 항체를 첨가하면 튜브의 최종 희석는 875이었다. </li><li> 구입 및 주식 S. 해동 구균은 pHrodo 붉은 염료로 표지 bioparticles. 1m의 농도 일시멸균 PBS에 1 ㎖ 당 bioparticles의 g. 분석에 사용 된 때까지 나누어지는 희석 bioparticles과 상점은 -20 ° C에서 냉동. </li><li> ㎍ / ㎖ (10)의 최종 농도로 DMSO에, 산소 유리기 (즉, 산화 적 버스트)의 존재 하에서 형광성 티듐 브로마이드로 변환 dihydroethidium (DHE)을 용해. </li><li> 200 ㎎ / ㎖ 및 / ml로 각각 17.5 mg을 2 단계 희석 멸균 PBS로 (지정된 분석 배양 기간 다음과 같은 추가 식균 작용을 방지하기 위해 사용) N-에틸 말레이 미드를 섞는다. 분석에서, 15 mM의 최종 농도를 사용한다. N - 에틸 말레이 해동되면 N-에틸 말레이 용액에 남아 있지 않기 때문에, 37 ° C 열 블록을 사용한다. </li><li> 최종 정착 단계 후, 핵 DNA를 얼룩 7AAD를 사용합니다. 이전에 추가로, 멸균 PBS와 스톡 7AAD 1:10 희석. </li></ol> 2. 혈액 샘플 컬렉션 <ol><li> O / N 빠른 (&gt; 8hr)과 abstenti 다음 실험실에 도달하기 위해 주제를 물어신체 활동에서 (&gt; 12 시간)에. </li><li> 알코올 준비 패드로 피부를 청소 한 후, 주변 팔 정맥에 멸균 채혈 바늘을 삽입합니다. </li><li> 상업적으로 나트륨 헤파린으로 가득 대피 튜브에 혈액을 수집합니다. </li><li> 수집 한 후, 피사체의 팔에 접착 붕대를 적용합니다. </li><li> 10 배를 혼합 한 후 분석까지 로커에 배치 혈액 튜브를 반전. </li></ol> 3. 탐식 분석 기법 <ol><li> 해동는 S.aureus의 bioparticles (RT), DHE (RT) 및 N-에틸 말레이 미드 (37 ° C). </li><li> 멸균 후드에서 작업하는 동안 4 각 1.2 ml의 튜브는 S.aureus의 bioparticles 20 L을 추가합니다. </li><li> bioparticles를 포함하는 각각의 튜브에 DHE 40 L을 추가합니다. </li><li> 조심스럽게 튜브 바닥에 시약을 수집 벤치 표면에 튜브를 탭. </li><li> bioparticles과 DHE 가득 된 각 튜브에 혼합 된 전혈 100 L을 추가합니다. </li><li>어떤 오염 혈액을 제거하는면 팁 어플리케이터 튜브의 내부 모서리를 닦습니다. </li><li> 혈액 첨가 한 후 3주기 위해 혈액과 시약을 혼합 세트 전자 피펫으로 혈액과 시약을 섞는다. </li><li> 얼음 양동이에 분석 튜브를 삽입하고 빛으로부터 보호하기 위해 커버한다. </li><li> 10, 20, 및 40 분 동안 분석 튜브를 부화. 모든 분석 튜브 동시에 끝낼 수 있도록 40 분 관을 시작합니다. </li><li> 해동 N-에틸 말레이 37 ° C 구슬 목욕. </li><li> 피펫 각 분석 튜브에 (1.4에서 상술) N-15 에틸 말레이 L, 30 분 동안 배양한다. </li><li> 피펫 CD66b-APC의 10 L과 CD45-APCeFluor780 (1.1에서 설명한) 희석 된 항체의 10 L은 60 분 동안 품어. </li><li> 피펫 각 분석 튜브에 WBC 수정 / 적혈구로 용해 액의 750 L, 60 분 동안 품어. </li><li> 원심 분리기 시험 튜브 (400 XG에 10 분) 세포 펠렛을 수집한다. </li><li> 진공 잔류 플로리다를 떠나, WBC로 용해 / RBC 수정 솔루션을 대기음세포 펠렛 위의 UID 볼륨 (100 L). </li><li> 7AAD의 희석 (1.5에서 상술) 용액을 각 분석 튜브에 PBS의 50 L의 10 L 피펫. </li><li> 냉장고에 하나 호일 분석 튜브, 랩 튜브에 교정 구슬 (~ 25 L) 각 분석 튜브, 장소 캡의 드롭과 장소를 추가합니다. </li><li> 사이토 이미지 기반 흐름으로 샘플 튜브를 넣고 미리 정의 된 파라미터를 이용하여 3000 과립구 이벤트들의 최소 수집 : 오토 샘플러, 청색 (488nm의 60 MW), 적색 (640 내지 100 NW), SSC (785 나노 미터; 8.5 MW) 레이저 (그림 1). </li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig1highres.jpg" /> 도 1 취득 방법 및 템플릿. 샘플 (A) 사이토 이미지 기반 흐름을 획득 하였다. 수집하는 동안, CD66b-APC 대 밝은 필드 화면 비율의 도트 플롯은저기서 아군 교정 구슬에서 분리 된 과립구에 생성 된g INSPIRE V. 100.2.292.0 소프트웨어 (B). 빨간색, (640 nm의 100 NW), SSC (785 nm의 8.5 MW) 레이저 5,000 과립구의 최소 푸른 오토 샘플러 (60 mW의 488 nm의)를 사용하여 각각의 샘플을 취득했다. 히스토그램의 수는 레이저 설정 및 데이터의 다른 측면 수집을 모니터링 획득 동안 존재 함을 유의하시기 바랍니다. 이 히스토그램 모든 옵션 및 실험실 표준 운영 절차는 품질 관리로 필요한 경우에만 필요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 4. 샘플 수집 및 분석 <ol><li> 월간 이미지 파일을 보상 (CIF)를 RAW 이미지 파일 (RIF)에 대한 보상 행렬을 적용하고 만드는 아이디어 소프트웨어의 자동화 된 소프트웨어 보정 마법사를 사용합니다. </li><li> 아이디어 소프트웨어에서 개별 CIF 파일을로드하고 과립구 하위 집합을 식별하기 위해 다음 플롯을 생성합니다 </리&gt; <li> 시야 그라데이션 RMS (도 2a)에 대한 히스토그램을 이용하여 초점이있는 것으로 간주 하였다 셀을 식별하는 초기 게이트들을 확립한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을. </li><li> 대 시야 영역 (도 2B) 시야 종횡비 (폭 대 높이의 셀 비율)의 도트 플롯을 사용하여 파편과 이중선 별개 중항 셀 보조 플롯을 사용한다. 기준 표준으로 비자극 제어를 사용하여 각 환자 샘플에 대해이 결정을. </li><li> 세포의 깨끗한 인구가 확인되자 양 (CD45 + / 66B의 +를) 과립구를 확인하는 CD66b 대 CD45 (그림 2C)의 도트 플롯을 설정합니다. S. 밝은 세부 강도의 딸 플롯 (그림 3)를 작성 구균 대 산화 버스트 (DHE, y 축)에 대한 밝은 세부 강도 (x 축)을 활성화 과립구의 하위 집합을 식별합니다. BR 수집채널 1과 9의 광명이 필드 이미지, 채널 2에서 bioparticles, DHE 채널 4, 7AAD 채널 5에서, CD66b 채널 (11), 및 CD45에 채널 12. </li></ol><img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig2highres.jpg" /> 도 2 분석 템플릿.이 도면 포커스 (A)에 있던 세포를 식별하기 위해 생성 된 일련의 플롯, 단 전지 (B), 과립구 (C). 추가의 플롯 활성화 과립구 대 비활성 과립구의 세 서브 세트를 식별하는 데 사용 하였다. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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The authors have nothing to disclose.

본 발명의 방법은 1,3,4,12-14 유동 세포 계측법을 사용하여 과립구 기능의 평가를위한 기존의 방법의 구체화를 나타냅니다. 이 분석의 중요한 단계는 bioparticles DHE과 함께 혈액 샘플의 적절한 혼합에 관련되는 경향이있다. 불완전한 혼합은 부정확 한 결과가 발생합니다. 완전한 혼합이 중요하지만, 혼합 방법은 자연에서 완만해야한다. 이 혼합 기능보다는 볼텍스 믹서와 전자 피펫을 혼합하여 이루어질 수 있음을 제안한다. 분석에서의 또 다른 중요한 단계는 항상 분석 튜브의 상부 절반을 오염 혈흔가 없도록하는 것이다. 이 잔여 혈액을 멸균 면봉을 사용하여 제거 할 수있다. 오류가 미 용해 적혈구 제제 최종 분석을 오염시킬 수 있기 때문에 그렇게 완전한 제거가 중요하다. 이 방법에게 적절한 보상 컨트롤을 사용하기 전에이 SP의 제어를 추가해야과립구 함수의 다양한 양태를 식별하는 데 사용되는 시약 사이 ectral 오버랩. 이 방법의 경우, 보상 제어가 40 분 검정 인큐베이션을 제안하고 단일 마커로 라벨링 된 혈액 샘플을 수집 포함 (예, E. 콜리, DHE 등). 표지 한 후, 하나의 양의 이벤트가 수집되고 보정 행렬 IDEAS 분석 소프트웨어에서 자동 마법사를 사용하여 생성된다. 이것은 상기 분석이 사용될 경우, 적절한 보상 제어가 적절한 분석 성능을 보장하기 위해 완성하는 것이 중요하다. 분석 밝은 상세 강도가 집단을 구분하는 가장 좋은 변수임을 확인하고 또한 많은 중복 산화 버스트와 식균 작용 신호 사이에 존재하는 방법을 식별하는 기능을 찾기 및 공동 현지화 마법사를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 구체적으로는, 이미지 기반 계측법의 사용은 세 개의 서브 세트들로 과립구 활성화를 분리하는 기능을 제공했다. 티자신의 일부 고장은 산화 버스트 대 식세포의 밝은 세부 강도를 사용하여 측정 하였다. 단수 이들 세포의 기능을 검사하는 이외에도, 같은 해부학 적 위치 (CO 지방화)에서 동시에 이벤트를 나타내 세포 확인되었다. &quot;고 활성&quot;부분 집합으로 떨어졌다 과립구는 식균 작용과 산화 버스트 사이의 일관된 공동 현지화를 입증하는 유일한 표현형했다. 활성화 과립구 부분 집합이 식별 문제 해결이 필요한 가장 큰 지역이다. 사용자가 새로운 아이디어 샘플 프로세스 흐름을 이해하기 위해 시간이 걸릴 및 이미징 요소를 사용하여 세포 집단을 게이팅 메커니즘을 이해하는 것이 매우 중요하다. 사용자가 확인하고자 수있는 다른 수정 대체 또는 추가 분석 배양 시간의 선택을 포함한다. 현재의 방법은 10 ~ 40 분의 지속 시간의 사용을 제안한다; 그러나, 실험 모델에 따라,이 방법은 어디사용하기 위해서는, 더 긴 지속 시간 분석을 선택해야 할 것이다. 이러한 변경은 개별적으로 평가 될 필요가있다. 또한 그것은 검정 인큐베이션 기간은 세 개의 활성화 된 서브 세트의 외관에 현저한 효과가 있다고 판단 하였다. 이 보고서에 기술 된 방법은 이전에 과립구 기능 3,4,13,15에 대해 얻을 수있는 정보의 확장을 나타냅니다. 다른 실험실 면역 질환의 15-17 종합 평가의 일부로서 과립구 함수의 변화를 평가하는 것의 중요성을 보여 주었다. 이 분석의 잠재력에도 불구하고 한계가없는 것은 아니다. 주요한 제한 사항 중 하나는 높은 시료 처리 처리와 관련된 비용과 시간을 요구한다. 연구 설계가 주어진 날에 많은 수의 샘플을 필요로하는 경우, 이러한 처리는 어려울 수있다. 처리 전자 피펫 및 디스펜서를 이용하여 간소화,그러나 이들은 비싼 경향이 모든 실험실에서 반드시 사용할 수 없습니다. 연구의 우리의 영역은 운동과식이 습관이 면역 체계의 건강에 영향을주고 6,8-10,18-20를 작동 방법에 대한 연구에 초점을 맞추고있다. 이러한 목적은 인간의 건강의 다양한 분야에 대한 상당한 실질적인 의미를 가지고있다. 탐식 기능의 모니터링이 치료 결과에 중요 여기서 운동 영양 효과 이외에도 본 연구에서 입증 원고 탐식 방법은 임상 면역학의 다른 분야에서 유용 할 수있다. 본 분석은 가능성이있는 면역 학적 분석이 계측기 이미지 기반 흐름에서 할 수 할 수 있습니다 독특한 영상 정보의 장점을 취함으로써 다시 발명 할 것이 많은 사람들의 첫 번째입니다.

과립구는 침입 항원에 대한 방어의 첫 번째 라인을 제공하는 인체의 선천성 면역 시스템의 하나의 구성 요소를 나타냅니다. 과립구 기능을 평가하기위한 이전 방법은 과립구가 1-4을 어떻게 변화 해 왔는지 어려운 집단적으로 확인 할 수있게 별도의 방법을 사용하여 탐식 능력 또는 산화 버스트에 초점을 맞추었다. 흐름의 분야에서의 발전은 계측법 고 스루풋으로 5 세포의 고해상도 멀티 컬러 촬상 가능한 탁상 악기의 생산에 성공. 기존의 흐름과 함께 영상을 결합하는 능력은 세포 계측법 방법 세포 계측법 기존의 흐름 내에서 혁신과 면역 체계에 대한 새로운 정보를 추출하는 데 필요한 기술 플랫폼을 제공하는 진보를 나타냅니다. 지난 10 년 동안, 다른 사람의 사이에서 우리의 실험실은, 날카롭게 다양한 영양 및 운동 치료 patte의 효과에 초점을 맞추고있다선천성 면역 기능 6-9 RNS. 이 원고의 입증 방법은 임상 면역학 분야 내에서 실제적인 의미를 가지고있다. 본 방법은 동시에 세균 입자 및 산화 버스트의 식균 작용을 측정 할 수있는 이미지 기반의 유세포 전력을 활용. 이 방법을 사용하여, 하나의 화상 해석 계 부분에 의해 제공되는 변수를 사용하여 활성화 과립구를 분리 할 수​​있다. 이러한 개별 서브 세트들은 과립구 세포에서 이미지를 평가 한 후에 만​​ 식별 할 수 있었다. 또한 분석 배양 시간은 세 개의 활성화 서브 세트 (10) 사이의 전이에 영향을 미쳤다. 따라서, 다수의 인큐베이션 시간의 사용 방법은 다음과 같은 특정 실험 치료 과립구 함수의 변화를 테스트 할 수 있다는 그럴듯​​. 이 원고의 목적은 식균 작용과 동시에 oxidat을 측정하는 영상 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 평가 함수 과립구의 방법을 설명했다필자는 버스트.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="627">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:125px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacutainers</td>
			<td style="width:125px;">BD Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>used for blood collection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">WBC Fixative / RBC Lysis solution</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">00-5333-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD66b-APC</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone G10F5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CD45-APCeFluor780</td>
			<td style="width:125px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">clone 2D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">s.aureus bioparticles</td>
			<td style="width:125px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dihydroethidium</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D7008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-ethylmalemide</td>
			<td style="width:125px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">4259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7AAD</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hematology Analyzer</td>
			<td style="width:125px;">Mindray</td>
			<td style="width:119px;">BC-3200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-channel pipet</td>
			<td style="width:125px;">Integra Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">ViaFlo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bead Bath Incubator</td>
			<td style="width:125px;">LabArmour</td>
			<td style="width:119px;">BeadBath</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Imaging Flow Cytometer</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis FlowSight</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">INSPIRE Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis INSPIRE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IDEAS Software</td>
			<td style="width:125px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Amnis IDEAS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">X-Pierce Piercable Plate Sealer</td>
			<td style="width:125px;">Excel Scientific, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">X-Pierce</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dell Precision Workstation</td>
			<td style="width:125px;">Dell Computers</td>
			<td style="width:119px;">Various</td>
			<td>Used for IDEAS analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte function, in general these are limited in terms of the information they can provide. For example, most existing assays merely provide a percentage of how many granulocytes are activated following a single, fixed length incubation. Complicating matters, most assays focus on only one aspect of function due to limitations in detection technology. This report demonstrates a technique for simultaneous measurement of granulocyte phagocytosis of bacteria and oxidative burst. By measuring both of these functions at the same time, three unique phenotypes of activated granulocytes were identified: 1) Low Activation (minimal phagocytosis, no oxidative burst), 2) Moderate Activation (moderate phagocytosis, some oxidative burst, but no co-localization of the two functional events), and 3) High Activation (high phagocytosis, high oxidative burst, co-localization of phagocytosis and oxidative burst). A fourth population that consisted of inactivated granulocytes was also identified. Using assay incubations of 10, 20, and 40-min the effect of assay incubation duration on the redistribution of activated granulocyte phenotypes was assessed. A fourth incubation was completed on ice as a control. By using serial time incubations, the assay may be able to able to detect how a treatment spatially affects granulocyte function. All samples were measured using an image-based flow cytometer equipped with a quantitative imaging (QI) option, autosampler, and multiple lasers (488, 642, and 785 nm).

이미지 기반의 유동 세포 계측법을 사용하면 우리가 세 가지 활성화 부분 집합 (그림 3)에 활성화 과립구의 동질 집단을 분리하는 것을 허용했다. 이 방법에서는 가장 효과적인 방법은 세 가지 활성화 부분 집합을 산화 버스트 대 (황색 포도상 구균) (DHE) (; 그림 4 그림 3) 식균 작용에 대한 밝은 세부 강도를하려하는 것입니다 해결하기 위해. 또한, 아이디어 소프트웨어의 공동 현지화 마법사의 사용은 매우 활성화 과립구의 특징 기호입니다 동시 식균 작용과 산화 버스트의 존재의 정량 수 있습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig3highres.jpg" /> 활성화 된 과립구 부분 집합의 그림 3. 식별. 세포 표면 마커 (CD45 + / 66B의 +)를 사용하여 과립구의 식별 한 후, 딸 플롯은 밝은 상세 INTEN으로 생성 된산화 버스트 밝은 상세 강도 대 식세포 작용에 대한 SITY. 이러한 접근법 비활성 (보라색), 저 활성의 백분율 (적색, A), 적당한 활성 사용 (청색, B), 및 높은 활성 상태 (노랑, C) 과립구 구했다. 게이팅이 기술은 또한 다양한 서브 세트 과립구 활성화의 상대적인 농축에 분석 배양 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되었다. &quot;고 활성&quot;과립구의 가장 높은 비율은 40 분 배양 다음과 같은 존재. 획득 한 이미지 파일의 모든 분석은 아이디어의 6 절 소프트웨어를 사용하여 완성되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 과립구 활성화의 세 개의 서로 다른 서브 세트의 존재를 입증하는 이외에, 그것은 분석 배양 시간 과립구 활성화 각 서브 세트의 상대적인 풍부함을 좌우하는 것이 입증되었다. 구체적으로는, 40 분 INCubation는 &quot;높은 활성&quot;과립구의 가장 큰 비율의 결과. 적어도 세 개의 검정 인큐베이션 기간을 적용하여, 주어진 임상 치료의 시간적 과립구 활성화 상태를 변경하는 방법을 결정하는 것이 가능할 수있다. 이를 식균 작용 및 산화 버스트의 동시 측정의 함수로서 상이한 동작 과립구 서브 세트를 식별하기 위해 이미지 기반 유동 세포 계측법을 이용하여 제 발행 방법이다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52201/52201fig4highres.jpg" /> 세포 마커의 그림 4. 대표 이미지. 높은 활성 (A)로 분류 세포의 이미지 갤러리, 중등도 활동 (B), 낮은 활성 (C)이 그림에 제시되어있다.는 S.aureus의 bioparticles은 CH03에 산화 버스트는 CD66b가에, 측면 산란은 CH06에, 핵에 대한 7AAD은 CH05에, CH04에CH11, 및 CD45은 CH12에 있습니다. 또한, 산화 버스트 대 식세포 작용 (CH03) (CH04)의 공동 현지화 병합 이미지가 표시됩니다. 병합 이미지의 노란색 분야가 식균 작용과 산화 버스트가 동시에 동일한 해부학 적 공간에서 발생하는 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52201/52201fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

이미지 기반 유동 세포 계측법 기술은 과립구 기능의 변화를 평가하기<em&gt; 체외</em

Granulocytes play a key role in the body&#8217;s innate immune response to bacterial and viral infections. While methods exist to measure granulocyte ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

12.4K 조회수.  University of North Texas. This method demonstrates a technique for assessing granulocyte function by simultaneously measuring phagocytosis of bacteria and oxidative burst. Image-based flow cytometry allowed for the identification of three distinct subsets of activated granulocytes that all differed in their relative functional capacity.

비디오: Image-based Flow Cytometry Technique to Evaluate Changes in Granulocyte Function In Vitro

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

사람의 체외에서</em면역 불균형의 초기 국가의 인정을위한 심사 도구를> 억제

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

연구

면역학 및 감염병학

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

시험 관내 분석에서 HIV 특정 CD4 T 세포의 이펙터 기능에 면역 경로의 영향을 평가하기

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity of antibodies or serum to enhance infection in impermissible cell lines have relied on using viral output in the media followed by plaque assays to quantify infection. More recently, these assays have examined Dengue virus (DENV) infection in the cell lines using fluorescently labeled antibodies. Both these approaches have limitations that restrict the widespread use of these techniques. Here, we describe a simple in vitro assay using Dengue virus reporter viral particles (RVPs) that express green fluorescent protein and K562 cells to examine antibody dependent enhancement (ADE) of DENV infection using serum that was obtained from rhesus macaques 16 weeks after infection with Zika virus (ZIKV). This technique is reliable, involves minimal manipulation of cells, does not involve the use of live replication competent virus, and can be performed in a high throughput format to get a quantitative readout using flow cytometry. Additionally, this assay can be easily adapted to examine antibody dependent enhancement (ADE) of other flavivirus infections such as Yellow Fever virus (YFV), Japanese Equine Encephalitis virus (JEEV), West Nile virus (WNV) etc. where RVPs are available. The ease of setting up the assay, analyzing the data, and interpreting results makes it highly amenable to most laboratory settings.

A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum

We describe a simple and easy protocol for measuring antibody dependent enhancement of infection by Zika virus convalescent serum using Dengue virus Reporter Viral Particles.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Antibody dependent enhancement of infection has been shown to play a major role in Dengue viral pathogenesis. Traditional assays that measure the capacity ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

통합 이미징 Cytometry Transcriptomic 변경된 Endocytic CD1d 매매 평가 하 프로 파일링

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

호중구 계보 세포의 질량 세포 분석 분석을위한 전체 골수의 준비

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

광견병 백신 효능을 평가하기 위한 시험관 내 ELISA 테스트

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...