RAN 펩티드는 헌팅턴병, 근위축성 측삭 경화증 및 전두엽 치매와 같은 반복팽창 신경퇴행성 질환의 특징입니다. 이러한 프로토콜은 C.elegans 모델 시스템에서 RAN 펩타이드 독성을 정량화하기 위한 중요한 표준화된 접근법을 제공합니다. 설명된 기술은 배우기 쉽고 저렴하며 신속하게 수행 할 수 있으며 움직임 및 재생과 같은 C.elegans 시스템의 재현 가능한 기능을 활용합니다.
이 프로토콜을 시도할 때, 중요한 도전은 일관된 RAN 펩티드 독성 및 발현을 얻는 것입니다. 제어할 주요 요인은 약물 온도, 온도 변화 타이밍 및 분석 플레이트의 준비를 포함합니다. 실험자가 이 연령의존적 과정에서 동물의 표현형을 일관되게 분류하는 것이 중요합니다.
이 기술의 시각적 데모는 분류 기준을 보여줍니다. 먼저 1밀리몰러 IPTG와 밀리리터 카베니실린 당 25 마이크로그램으로 표준 선충 성장 배지를 24웰 플레이트에 붓는 것으로 시작합니다. HT115 박테리아에서 RNAi 먹이 클론을 LB 카베니실린 한천에 줄이면 24 시간 동안 섭씨 37도에서 자랍니다.
다음 날, 하나의 식민지를 LB 카베니실린 액체 매체의 1 밀리리터로 선택하고 250 rpm에서 흔들리는 동안 섭씨 37도에서 18 시간 동안 박테리아를 성장시다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 하룻밤 세균 배양 20 마이크로리터를 함유한 NGM RNAi 24웰 플레이트의 4개의 개별 우물을 발견하고 RNAi 박테리아가 하룻밤 사이에 이중 좌초 RNA 생산을 유도하도록 허용한다. 표준 hypochlorite 방법을 사용하여 통합 된 RAN 펩티드 트랜스진을 표현하는 성인 C.elegans가 첫날부터 계란을 분리합니다.
그런 다음 약 30 개의 계란을 24 웰 플레이트의 각 우물에 넣고 7 일 동안 섭씨 20도에서 접시를 배양합니다. 비디오 속도 분석을 수행하려면 흑백 카메라가 장착된 스테레오 해부 현미경을 사용하여 각 RNAi 상태에 대해 두 개의 개별 우물에서 두 개의 비디오를 획득하십시오. 우물 간에 일관된 획득 설정을 사용해야 합니다.
각 비디오에 대해 10초 동안 지속 시간을 설정하고 시간 간격을 76밀리초로 설정합니다. 이미지 노출 시간을 4밀리초로 설정하고 1.49 줌 설정을 사용합니다. 그런 다음 두 개의 비닝으로 두 가지를 선택합니다.
해상도가 800x 600픽셀인지 확인하고 레코딩을 시작합니다. 획득 후 각 비디오에 스트레인, RNAi 상태 및 음수로 즉시 레이블을 지정합니다. 그런 다음 비디오 당 20 개의 다른 동물에 대한 이동 거리와 각 동물의 길이를 측정하여 각 RNAi 상태에 대해 총 40 개의 벌레를 검사합니다.
소프트웨어에서 어반기 도구 단추를 선택합니다. 그런 다음 텍스트 그리기 도구입니다. 비디오의 첫 번째 프레임에서 측정되는 웜 중앙의 점을 클릭하고 숫자로 표시합니다.
웜을 시각적으로 추적하면서 비디오를 끝까지 진행합니다. 그런 다음 클릭하고 다음 해당 번호로 표시합니다. 그리기 배율 막대 도구를 사용하여 첫 번째 숫자에서 두 번째 번호로 선을 그리고 스프레드시트에서 이동한 거리를 기록합니다.
분석 창에서 각 개별 측정을 유지하면서 비디오에서 19개의 다른 웜에 대해 이 측정을 반복합니다. 측정이 완료되면 모든 측정 라인을 설명하는 최종 비디오 프레임의 스냅샷을 찍어 데이터를 원래의 동물로 다시 추적할 수 있습니다. 다음으로 열이 웜 식별자이고 열 2가 속도인 4열 스프레드시트를 사용하여 데이터를 분석합니다.
각 비디오의 시간은 실험 에서 비디오를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 속성으로 이동하여 찾을 수 있습니다. 속도 측정을 정상화하려면 각 동물의 길이를 찾습니다. 그리기 폴리라인 도구를 사용하여 머리 끝에서 꼬리 끝까지 C.elegans를 자유롭게 추적할 수 있습니다.
그런 다음 모든 폴리라인을 설명하는 최종 비디오 프레임의 스냅샷을 찍습니다. 선의 길이는 통계에 따라 기록됩니다. 스프레드시트에 두 개의 열을 추가합니다.
마지막으로, 빈 벡터 RNAi 대 후 호크 테스트를 통해 단방향 ANOVA를 사용하여 정규화된 속도 데이터를 분석합니다. 6센티미터 GFP RNAi 플레이트에 RAN 펩타이드 GFP를 표현하는 4-6개의 형질형 L4 C.elegans를 배치하고 섭씨 20도에서 자랍니다. 실험이 RNAi를 활용하여 RAN 펩티드 독성에 대한 유전적 효과를 테스트하는 경우, 10명의 형질전환 그라피드 성인을 각각 2개의 빈 벡터 RNAi GFP RNAi 또는 유전자 특이적 RNAi 플레이트로 이동시한다.
돌연변이가 RAN 펩티드 독성에 대한 유전적 효과를 분석하는 데 사용되는 경우, 2개의 빈 벡터 RNAi 또는 GFP RNAi 플레이트 각각에 동일한 RAN 트랜스진을 발현하는 10개의 중력 야생 형 또는 돌연변이 동물을 배치한다. 섭씨 20도에서 48시간 동안 자랍니다. RNAi 플레이트에서 10개의 트랜스제닉 L4 10세트를 선택하고 각 세트를 3센티미터 RNAi 플레이트에 놓습니다.
분석에서 선택한 웜이 모두 피상적으로 정상적인 운동성을 가지고 있는지 확인합니다. 수분을 유지하고 섭씨 25도에서 배양하기 위해 접시를 비닐 봉지에 넣습니다. 24시간 후, 해부 현미경의 판을 탭하고 움직임을 확인하여 동물을 이동성을 분석합니다.
웜이 몸 길이 이상으로 이동하는 경우, 이동체로 계산하고 새로운 3센티미터 RNAi 플레이트로 전송합니다. 백금 선택을 사용하여 머리와 꼬리에 남은 웜을 누릅니다. 동물이 몸 길이 보다 더 이동하는 경우, 이동으로 동물을 계산하고 새로운 3 센티미터 RNAi 플레이트로 전송합니다.
2일째까지 빈 벡터 컨트롤에서 중요한 마비가 관찰되지 않으면 분석서를 종료하고 다시 시작합니다. 체길이 이상의 움직임을 쉽게 감지할 수 있도록 모든 비이동 웜을 함께 그룹화합니다. 마비, 짐, 죽은 벌레를 모두 계산하고 접시를 폐기하십시오.
5~7일 동안 매일 마비동물에게 점수를 계속 주어보겠습니다. 성장 분석은 G4C2 반복 확장을 가진 ALS 환자에서 발견되는 RAN 디펩티드의 독성에 대한 유전자 억제의 효과를 측정하는 데 사용되었다. PR50 GFP의 발현은 완전한 성장 체포의 결과로, 그러나 몇몇 유전자의 녹다운은 발달 독성을 억압했습니다.
특정 유전자 녹다운의 효과는 비디오 속도 분석 방법을 사용하여 측정된 PR50 표현 동물의 발달 운동성에 대한 것이다. 예상대로, PR50 GFP 발현의 억제는 빈 벡터 RNAi에 비해 운동성이 크게 증가하였다. 더욱이, 프로테솜 서브유닛 RPN7에 대한 RNAi는 PR50 운동성의 현저한 증가를 초래했다.
성인 표현형이 연령 의존성 마비 분석으로 분석되었을 때 PR50 GFP는 5일까지 최대 80%의 마비를 보였습니다. 그러나, RNAi는 유전자 cul-6을 지시하여 PR50 GFP 독성에 대해 cul-6이 필요하다는 것을 시사하는 마비를 현저히 지연시켰다. RAN 단백질이 C.elegans 뉴런에서 발현될 때 신경 병리학을 일으키는지 결정하기 위해, 신경 특이적 독성은 commissure 분석기를 사용하여 검토되었다.
둘째 날 성인, 모터 뉴런에서 PR50 GFP 발현은 운동 신경 출혈의 상당한 증가로 이어졌다. 이러한 신경병리학은 인슐린 IGF 수용체 유전자 homolog DAF-2의 돌연변이에 의해 현저하게 억제되어 여러 신경 퇴행성 단백질의 독성 특성을 지연시켰다. 행동 분석의 경우, RAN 펩티드가 매우 침투성 표현형을 생성하는 것이 중요하다.
이러한 유전자 또는 약물 RAN 펩티드 질병에 대 한 새로운 바이오 마커 또는 치료 옵션을 제공할 수 있습니다. 이러한 분석은 이러한 분석은, 우리는 C9ORF72 관련 RAN 펩티드 프롤린-아르기닌의 억제기를 위한 게놈 전체 RNAi 스크린을 수행했습니다. 이 스크린에서 확인된 유전자는 미래 기계학 연구 결과의 주제가 될 많은 새롭고 보존된 유전자를 포함합니다.
