The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.

이 프로토콜은 쥐 10 10 7 CAR T 세포로 처리하여 각각의 실험 디자인에 기초한다. 이것은 108 CAR의 T 세포가 필요함을 의미한다; 수율은 생존의 손실을 계정에 5 × 10 7 -1 × 10 (8)에 의해 과대 평가되어야한다. 다음 프로토콜은 약 200 × 10 6 세포를 생성하기 위해 조정됩니다. 세포를 기존 KR158B 성상 세포종 또는 B16 흑색 종 세포주에서 개발 구일 설립 동계 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 암컷 C57BL / 6 마​​우스에 정맥 내 투여한다. 부수적 CAR T 세포의 생성과, 담암 마우스 lymphodepletive TMZ 하였다 (60 mg / kg) 및 WBI (Gy를 16.5)의 임상 적 투여 량을 투여한다. 마우스는 유지 듀크 대학 의료 센터 (DUMC)에서 무균 조건에서 사육 하였다. 모든 동물 실험은 듀크 대학 기관에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다알 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC). 담암 마우스에 테모 졸로 마이드 1. 관리 일 0-4 : <ol><li> 마우스의 총 수가 분사되도록 계산하고 스필 (16.5 ml의 TMZ을 고려하여 (예를 들어, 30 마우스 X 0.5 ml의 = 15 ml의 TMZ) 필요한 TMZ 용액의 양을 결정하고,이 부피를 1.5 mL로 추가 0.5이 곱 ). </li><li> 3 MG하여 총 부피를 곱 / ㎖ 필요 TMZ의 동결 건조 중량을 결정하기 위해서 (예 16.5 49.5 × 3 = MG TMZ). 50 ML 원뿔로이 무게. 주의 : TMZ는 흡입, 섭취, 눈, 피부 접촉 및 점막에 의해 독성. 노출의 위험을 감소에 대한 권장 사항에 대한 기관의 산업 안전 및 / 또는 환경 보건과 복지 부서에 문의하십시오. </li><li> 디메틸 설폭 시드의 양을 결정하기 위해 0.15 총 체적을 곱 (DMSO)는 (예를 들어, 16.5 X 필요0.15 = 2.475 ml의 DMSO). 필터 멸균 튜브에 0.2 μm의 필터를 통해 DMSO의 양이 (플러스 스필 오버를 고려하여 추가로 2 ml)에 살균. TMZ 분말에 멸균 DMSO의 2.475 ML을 추가합니다. </li><li> 10 ~ 15 분 동안 65 ° C에서 뜨거운 접시 위에 물을 비이커에 TMZ / DMSO 솔루션을 놓습니다. TMZ가 완전히 용해되면, 용액의 색은 담황색하게한다; 용액이 분홍색이되면 그때 TMZ이 저하되고, 새로운 TMZ 용액의 신선한 많이 준비되어야한다. </li><li> 총 부피 (0.85 X 16.5 ml의 = 14.025 ml의 생리 식염수)에 의해 0.85를 곱하여 필요한 멸균 식염수의 적절한 볼륨을 계산합니다. 50 ML 원뿔에 멸균 생리 식염수 15 ML을 추가합니다. TMZ는 DMSO, 65 ° C의 열 식염수에 용해된다. </li><li> 소용돌이 TMZ / DMSO 솔루션은 TMZ 분말이 완전히 용해 천천히 TMZ / DMSO 용액에 따뜻하게 식염수를 추가되어 있는지 확인합니다. </li><li> 즉시 준비 후, 완전히 15 X 1 ML의 투베르쿨린 syring를로드사일 설립 종양 베어링 생쥐에게 투여 TMZ 솔루션 말이지. </li><li> 다섯 TMZ 행정의 총에서 4 일 1에서이 절차를 반복합니다. </li></ol> 종양 베어링 마우스 2. 뇌 전체 조사 일 2 ~ 4 : <ol><li> X 선 조사 장치 전원을 켜고 워밍업하는 전체 전압 수 있습니다. 적절한 필터가 장소와 입력 적절한 전압 및 전류 설정 (그림 2A)에 있는지 확인합니다. 참고 : 조사부의 선량은 전압 설정 및 그리드 레이아웃 (그림 2A, B) 해당을 결정하기 위해 사전에 수립되어야한다. </li><li> 5.5 Gy의 X 선 조사 될 필요가있는 시간을 계산한다. X 선 2 Gy의 / 분의 속도로 전달되는 경우, 예를 들어, 2.75 분 후, 5.5 Gy의 총을 제공하는 것이 필요하다. 입력 적절한 지속 시간. 참고 : 표 2는 마우스 WBI는 도스 제공인간의 차 임상 등가물. 고급 교종의 맥락에서, 60 Gy를가 WBI (6 주 2 Gy의 분획 5 일 / 주) 분획 치료 임상 표준이며, 여기에 사용 된 뮤린 동등한 16.5 Gy를 (Gy의 X 3 5.5)이다. </li><li> 2 ml의 케타민과 최종 솔루션은 10 ㎎ / ㎖ 케타민 1 ㎎ / ㎖ 자일 라진 (xylazine)가되도록 1 ml의 자일 라진 (xylazine) 17 ㎖에 식염수를 첨가하여 전신 마취에 대한 케타민 / 자일 라진 (xylazine)의 새로운 솔루션을 준비합니다. </li><li> 마우스를 체중 동물은 100 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / kg 자일 라진으로 케타민 도즈를 수용하도록 체중 그램 당 복강 케타민 / 자일 라진 10 μL를 관리. 마우스는 완전히 진정과 눈에 띄게 케타민 / 자일 라진 관리의 2 분 이내에 호흡해야합니다. </li><li> 진정제 동물 안과 수분을 유지하기 위해 각각의 눈에 부드럽게 인공 눈물 연고 소량 발라. </li><li> 헤드들은 가장 높은 X 선을 수신하고 영역 내에 위치되도록 상기 그리드에 배치 진정제 생쥐긴장 (그림 2B, C). 아래로 적절하게와 목에서 방패 몸은 전신 X 선 전달 (그림 2D)를 차단하는 리드 튜브 크기. </li><li> 그리드 레이아웃에 X 선 빔의 초점을 나타내는 레이저 좌표 (0,0)이되도록 X 선 빔 아래에 위치 쥐를 놓는다. X 레이 전달을 시작합니다. </li><li> X 레이 배달이 완료되면, 따뜻한 가열 패드의 조사 장치 및 장소에서 동물을 제거합니다. 동물 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 의식이있는 동물과 진정 동물을 수용하지 마십시오. 동물, 흉골 드러 누움을 유지 다시 자신의 적절한 케이지에 민감한 동물을 배치 할 수 있습니다하면. </li><li> 방사선의 세 가지 분류 된 용량의 총 일 3, 4에이 절차를 반복합니다. </li></ol> 3. 형질 일 -1 : <ol><li> 둘 베코 M 500 ㎖를 50 ㎖의 소 태아 혈청 (FBS)을 첨가하여 D10 매체를 준비odified 독수리 중간 (DMEM). </li><li> 500 ml의 RPMI-1640 미디어에 5.5 ml의 L- 글루타민, 5.5 피루브산 나트륨, 5.5 ml의 비 필수 아미노산, 및 5.5 ml의 pencillin / 스트렙토 마이신 (PEN / 연쇄상 구균)을 첨가하여 T 세포 매체 (TCM)를 준비한다. 다음으로, 2- 머 캅토 에탄올 550 μL 겐타 마이신의 550 μl를 추가합니다. 마지막으로, 50 ㎖의 FBS를 추가합니다. </li><li> 수확 체외 배양 된 세포 및 HEK293T은 D10 배지에서 7.5 × 106 세포 / ml의 농도로 가져온다. </li><li> 플레이트 10 ㎖의 D10 매체 및 16 × 10cm 폴리 D 라이신 (PDL) 코팅 된 플레이트에 각각 HEK293T 세포 현탁액 1 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 일 0 : <ol start="6"><li> 세포를 형질 감염 전에 10 ml의 신선한 D10 최소 30 분으로 용지를 교체하십시오. </li><li> (1) + (16 + 17 = 1)에 의해 판 14.1 μg의 총 수를 곱하여 형질 전환에 필요한 플라스미드 벡터의 양은, PCL-에코 벡터 및 리포좀 형질 감염 시약을 결정벡터 플라스미드 (14.1 X 17 = 239.7 μg의), 9.9 μg의 PCL-에코 벡터 (9.9 X 17 = 168.3 μg의), 60 μL 리포좀 형질 전환 시약 (60 X 17 = 1,020 μL). 모든 시약은 솔루션을 준비하기 전에 실온에 있어야합니다. </li><li> 튜브에 두 튜브 A와 B 레이블 239.7 μg의 벡터 플라스미드 (1.5 × 17)에 168.3 μg의 PCL-에코 벡터를 추가 감소 혈청 독수리의 매체 (RS-MEM)를 수정 ML. 튜브 B에서 (1.5 × 17) ml의 RS-MEM에 1,020 μL 리포좀 형질 전환 시약을 추가합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 별도로 및 B 부화. </li><li> (1-2 초 동안 소용돌이를 수회 반전)와 함께 부드럽게 B를 혼합하고, 지질 / DNA 복합체를 형성하기 위해 실온에서 20 분 동안 배양한다. </li><li> 10cm 접시에 HEK293T 세포에 현명한 지질 / DNA 복합체 드롭을 추가합니다. </li><li> 6 ~ 8 시간 동안 37 ° C에서 품어 또는 하룻​​밤 (24 시간을 초과하지 않음). </li><li> 6-8 시간 배양 한 후, 바이러스 생산을위한 신선한 TCM 12 ml로 매체를 교체하십시오. 이 미디어를 도금T 세포 전달에 대한 바이러스 상등액으로 2 일에 사용될 것이다. </li></ol> 4. 비장 절제술 및 T 세포의 준비 일 0 : <ol><li> 비장 수집을위한 얼음에 50 ML 원뿔 제자리에 TCM 10 ㎖를 붓고. </li><li> CO 2 질식 및 보조 잘린 동물의 적절한 수의 희생 : 찾는 동물 미국 수의학 협회 지침 (5 개 이하 동물 수 없다 당 10-30% 케이지 용적 / 분의 유속에서 CO 2 수신 케이지 호흡이 종료 될 때까지 그 후 2 분)을 동시에 희생. CO 2 챔버에서 동물을 제거하고 목을 벨. 참고 : 약 4.5-5 × 10 7 비장 세포를 얻을 것입니다 6-12 주 된 여성 C57BL / 6 마우스의 비장 한. 여기, 4 비장는 약 200 × 10 6 세포를 수확한다. </li><li> 오른쪽면이 위를 향하도록 마우스를 마련하고,70 % 에탄올로 스프레이. 집게로, 왼쪽 갈비뼈 아래에 피부의 얇은 배를 잡고 가위로 약간의 절개를 잘라. 껍질은 다시 피부는 조심스럽게 집게로 복막의 얇은 배를 잡아, 작은 구멍을 잘라. </li><li> 비장은 평평 콩과 유사한 작은, 연장, 어두운 붉은 기관이다; 섬세 주변의 결합 조직을 멀리 절단 집게와 소비세와 비장을 잡아. 얼음에 TCM 10 ㎖를 포함하는 원추형으로 절제 비장를 놓습니다. </li><li> 메쉬 70 μm의 셀 스트레이너 비장 위에 붓고, 단일 세포 현탁액을 생성하기 위해 5 ㎖ 주사기의 내부 무딘 단부들을 분해하여 당화. 두 비장의 최대 메쉬 스트레이너별로 세분화되어야한다. </li><li> 주의 깊게 남아있는 비장 세포를 수집 세분화를 다음 여과기를 씻어 TCM의 작은 볼륨을 사용합니다. 단일 세포 현탁액 내로 모든 분해 된 비장을 풀. 하나의 세척을위한 TCM와 50ml로 최종 볼륨을 가져와10 분 동안 300 XG에 스핀 거라고. </li><li> 5 ml의 10 배 용해 완충액 45 ㎖의 멸균 수를 첨가하여 용해 1X 버퍼 용액을 준비한다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 잘 혼합 적혈구, 50 ML 원뿔의 비장 당 1 배 용해 버퍼 5 ㎖에 재현 탁 펠렛을 제거합니다. 5 비장를 초과하는 경우, 250 ml의 원심 분리기 튜브를 사용합니다. 5 분 37 ° C의 물을 욕조에 원추형 또는 원심 분리기 튜브를 놓습니다. </li><li> 수조에서 용해 반응을 제거하고 1 TCM을 추가 반응을 중화 용해 버퍼와 1의 비율. 10 분 동안 300 XG에서 회전시켜 세척 할 것. </li><li> 로 pipetting 아래로 TCM에서 기음 뜨는 완벽하게 재현 탁 펠렛 (2 ㎖ / 비장, 4 비장 8 ml의 총). </li><li> 190 ㎕의 트리 판 블루 (1시 20분 희석)으로 세포 현탁액 10 μL를 첨가하여 세포를 카운트. 총 세포 수를 얻기 위해 20 X 10 X 4 전량 (8 ㎖)에 의해 리딩 된 네 개의 사각형 중 하나에서 얻은 수를 곱 (예를 들어, 셀 (125) × 20 × 104 </s최대&gt; × 8 ml의 = 200 × 10 6 비장 세포). </li><li> 2 ㎍ / ml의 콘 카나 발린 A (ConA에) 및 50 IU / ml의 재조합 인간 인터루킨 -2 (rhIL-2)가 보충 된 TCM에서 2 × 106 세포 / ml의 농도로 세포를 희석. 따라서, 200 × 10 6 비장 세포에 대해, 8 ml의 세포, 200 μg의 ConA에, 5,000 IU rhIL-2 92 ml의 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 4 × 106 세포를 각 웰이되도록 24 웰 조직 배양 처리 된 플레이트의 각 웰에 2 ㎖의 세포를 추가 (예를 들면, 셀은 약 100 ㎖ (4) 판을 필요로한다). </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 밤새 품어. </li></ol> 5. 형질 도입 1 일 : <ol><li> 비 - 조직 배양의 수는 (2)에 의해 수확 된 비장의 수 (8 판이 4 비장에 필요한) 곱하여 전달에 필요한 24- 웰 플레이트를 계산하는 처리. </li><li> 다음에, 재조합 인간 피브로넥틴 프래그먼트 (RHFF) 용액의 필요한 부피를 계산곱하여 코트 판에 필요한 (우물의 총 수 + 3) 0.5 ml의 X (8 판을 X 24 우물 = 192 + 3 = 195) 0.5 ml의 = 97.5 ml의 X. </li><li> 25 μg의 (= 97.5 × 25 μg의 2437.5)에 의해 총 부피를 곱하여 25 ㎍ / ml의 농도로 함유 RHFF 97.5 ml의 포스페이트 완충 식염수 (PBS)를 준비한다. 97.5 ml의 PBS에 RHFF이 금액을 추가합니다. </li><li> 코트 비 - 조직 배양은 웰 당 0.5 ml의 PBS / RHFF 용액을 첨가하여 24- 웰 플레이트를 처리 하였다. </li><li> 4 ℃에서 밤새 품어. </li></ol> 제 2 일 : <ol start="6"><li> 비 조직 배양에서 PBS / RHFF 솔루션을 덤프 24 웰 플레이트를 처리 하였다. </li><li> PBS로 1 ㎖ / 웰 2 % 소 혈청 알부민 (BSA)를 첨가하고, 30 분 동안 실온에서 배양한다. </li><li> 단단히 판을 upending에 의해 BSA를 제거합니다. 2 ml의 PBS를 추가하여 씻으십시오. </li><li> 250 ml의 원심 분리기 튜브에 각 HEK293T PDL 판에서 미디어를 전송하여 바이러스 상층 액을 수집하고 500 x g에서 10 분 스핀. </li><li> 조심스럽게 바이러스 SU를 전송확실히 형성 할 수있는 세포 펠렛을 방해하지되고, 신선한 250 ml의 원심 분리기 튜브에 pernatant. </li><li> 최종 볼륨이 RHFF 코팅 우물에 필요한 양보다 3 ㎖ 이상이되도록 바이러스 상층 액에 신선한 TCM을 추가합니다. 예를 들어, 192 RHFF 코팅 우물 192 + 3 = 195 ㎖를 가하여 바이러스 상청액의 부피를 가져온다. </li><li> 각 3 회에서 잘 - 부드럽게 피펫 아래 (2)에 의해 보육과에 resuspend에서 배양 된 비장 세포를 제거합니다. 250 ML 원뿔로 전송합니다. 이 단계를 신속하게 도움이 될 것입니다 전송하기 전에 멸균 용기를 사용하여 멀티 채널 피펫을 사용하는 경우. 앞서 10 분 동안 300 XG에 설명 스핀을 계산합니다. </li><li> rhIL-2를 추가 바이러스 상등액 50 IU / ㎖의 농도로. 예를 들어, 추가 50 X 195 = 9,750 IU 바이러스 상층 액의 195 ML-2 rhIL. </li><li> 1 × 106 세포 / ml의 바이러스 상등액에서 비장 세포를 재현 탁 </li><li> RHFF 코팅 된 24 웰 플레이트에 / 잘 비장 세포 현탁액 1 ML을 추가합니다. </li><li>다음 설정에 따라 90 분 동안 스핀 : 770 XG, 가속도 = 4, 브레이크 / 감속 = 0, 32 ° C. </li><li> 50 IU / ml의 rhIL-2와 TCM 솔루션을 준비합니다. 예를 들어, 10,000 IU rhIL-2를 첨가하여 200 TCM 용액을 조제. 원심 분리 후 각 웰에 rhIL-2 / TCM의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 5 % CO 2 37 ° C에서 하룻밤 문화. </li></ol> 6. CAR T 세포 배양 및 수확 3 일 및 4 : <ol><li> T 세포는&gt; 80 %를 달성 합류하면, 세포 (이것은 일반적으로 제 3 일 또는 4 일에 의해 발생) 분할 될 수있다. 세포 분열, 부드럽게 피펫과 각 웰 2 ~ 3 회에서 아래로, 그리고 신선한 24 잘 조직 문화 처리 플레이트의 새로운 우물에 각 우물에서 1 mL로 이동합니다. 그런 다음, 최종 부피가 모든 웰에 2 ml의 것을 각 웰 등 50 IU / ㎖의 IL-2와 신선한 TCM 1 ㎖를 추가합니다. </li><li> 세포는&gt; 80 % 합류점에 도달하지 않으면 서서히 각각의 상부로부터 용지 1 ㎖를 피펫 팅하여 잘 절반 미디어 변경을 수행한다. D 피미디어를 제거하는 동안 바닥에 정착 세포를 isturbing. rhIL-2 ml의 50 IU /를 포함 신선한 TCM의 1 ML을 추가합니다. </li></ol> 제 5 일 : <ol start="3"><li> 250 ML의 원심 분리 관에 재현 탁 CAR T의 부드럽게 피펫 팅하여 세포와 잘 각각 아래로 3 회 및 전송. 10 분 동안 300 XG에서 세포를 스핀. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고 완전히 흡인 상층 액. 두 번째로 전술 한 바와 같이 세포를 계산하고, PBS로 세척, PBS로 한번 세척 할 것. 전형적인 CAR의 T 세포 수율은 웰 당 약 1 × 106 세포 (8 X 24 웰 플레이트 = 192 × 106 CAR의 T 세포)이다. </li><li> 200 μg의 부피에 1 × 107의 주입을위한 5 × 107 / ㎖의 농도로 PBS에 재현 탁 된 세포 (예를 들면, 192 × 106 CAR의 T 세포에 대해, 재현 탁 3.84 ml의 PBS로 펠렛을 세척 하였다). </li></ol> 담암 마우스 7. CAR T 세포 관리 제 5 일 : <ol><li> 견인정맥 주사에​​ 대한 동물 시설에 얼음 RT 세포. 로드 (27)와 인슐린 주사기에 500 ~ 1,000 μL - 모든 거품이 추방되는 것을 보장 31 G 바늘. </li><li> 꼬리의 기지에 마우스를 잡고 튜브 제한 수단에 배치합니다. </li><li> 정맥이 위를 향하도록 팽팽 꼬리를 당기고는 꼬리 정맥에 평행 한 삽입하여 정맥에 바늘을 피부 아래 약 1-2mm 활공. 천천히 정맥에 200 μl를 추방. 바늘이 정확 정맥 내로 삽입되는 경우, 부피가 쉽게 유입 될 것이다; 그렇지 않으면 저항이되며 바늘 테일에서 제거하고 올바르게 다시 삽입해야한다. </li></ol>

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+regulatory+T-cell+fraction+amidst+a+diminished+CD4+compartment+explains+cellular+immune+defects+in+patients+with+malignant+glioma.">Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma.</a> Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).</li><li>Wilmotte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B7-homolog+1+expression+by+human+glioma:+a+new+mechanism+of+immune+evasion.">B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion.</a> Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).</li><li>Yang, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediation+of+enhanced+transcription+of+the+IL-10+gene+in+T+cells,+upon+contact+with+human+glioma+cells,+by+fas+signaling+through+a+protein+kinase+A-independent+pathway.">Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway.</a> Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).</li><li>Reilly, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temozolomide:+a+new+oral+cytotoxic+chemotherapeutic+agent+with+promising+activity+against+primary+brain+tumours.">Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours.</a> Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).</li><li>Newcomb, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Combination+of+Ionizing+Radiation+and+Peripheral+Vaccination+Produces+Long-term+Survival+of+Mice+Bearing+Established+Invasive+GL261Gliomas.">The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).</li><li>Park, B., Yee, C., Lee, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+radiation+on+the+immune+response+to+cancers.">The effect of radiation on the immune response to cancers.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).</li><li>Fritzell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+temozolomide+synergizes+with+immunotherapy+in+a+T+cell-dependent+fashion.">Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion.</a> Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).</li><li>Park, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+by+temozolomide+enhances+antitumor+immunity+of+dendritic+cell+vaccination+in+murine+brain+tumor+model.">Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model.</a> Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).</li><li>Emens, L. A., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+the+activity+of+tumor+vaccines+with+cytotoxic+chemotherapy.">Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy.</a> Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).</li><li>Murphy, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+immunotherapy+screen+of+costimulatory+molecules+identifies+Fc-OX40L+as+a+potent+reagent+for+the+treatment+of+established+murine+gliomas.">An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).</li><li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiotherapy+enhances+antitumor+effect+of+anti-CD137+therapy+in+a+mouse+Glioma+model.">Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model.</a> Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).</li><li>Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+lymphotoxic+is+dose-intensified+temozolomide?+The+glioblastoma+experience.">How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience.</a> J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).</li><li>Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dense+temozolomide+regimens:+antitumor+activity,+toxicity,+and+immunomodulatory+effects.">Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects.</a> Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).</li><li>Muranski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+and+adoptive+immunotherapy-how+far+can+we+go.">Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go.</a> Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).</li><li>Wrzesinski, C., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Less+is+more:+lymphodepletion+followed+by+hematopoietic+stem+cell+transplant+augments+adoptive+T-cell-based+anti-tumor+immunotherapy.">Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy.</a> Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).</li><li>Dudley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+cell+therapy+for+patients+with+metastatic+melanoma:+evaluation+of+intensive+myeloablative+chemoradiation+preparative+regimens.">Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens.</a> J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).</li><li>Sanchez-Perez, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloablative+Temozolomide+Enhances+CD8(+)+T-Cell+Responses+to+Vaccine+and+Is+Required+for+Efficacy+against+Brain+Tumors+in+Mice.">Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice.</a> Plos One. 8 (3), (2013).</li><li>Su, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+CD4++lymphopenia+in+melanoma+patients+treated+with+temozolomide:+a+toxicity+with+therapeutic+implications.">Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications.</a> J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).</li><li>Dummer, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+homeostatic+proliferation+elicits+effective+antitumor+autoimmunity.">T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity.</a> J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).</li><li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+homeostatic+cytokine+sinks+by+lymphodepletion+enhances+the+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+CD8++T+cells.">Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).</li><li>Wrzesinski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+intensity+lymphodepletion+enhances+tumor+treatment+efficacy+of+adoptively+transferred+tumor-specific+T+cells.">Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells.</a> J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).</li><li>Hughes, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+a+TCR+gene+derived+from+a+patient+with+a+marked+antitumor+response+conveys+highly+active+T-cell+effector+functions.">Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions.</a> Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).</li><li>Morgan, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+glioma+stem+cells+by+genetically+modified+T+cells+targeting+EGFRvIII+and+development+of+adoptive+cell+therapy+for+glioma.">Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma.</a> Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).</li><li>Kerkar, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+murine+CD8++and+CD4++T+cells+for+preclinical+adoptive+immunotherapy+studies.">Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies.</a> J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).</li></ol>

The authors have no conflicts of interests to declare.

여기에 설명 된 처리 타임 라인은 치료의 임상 표준 모델 및 차량 대체 요법에 대한 효과를 활용하도록 설계되었습니다. CAR T 세포의 투여 량, TMZ 요법 및 방사선 요법 투여는 생체 내에서 T 세포 활성, lymphodepletion, 및 종양 사멸에 강화하도록 변형 될 수있다. TMZ 섭생 호스트 myeloablation 적응 적 전송 및 셀 (30)의 증가 된 팽창을 수득 증가 될 수있다. 따라서 SOC의 암세포 살상 특...

교 아세포종 (GBM)은 가장 흔한 원발성 뇌종양이며 늘 치명적이다. 치료 화학 요법과 방사선 치료의 비 특정 표준과 함께 수술 적 절제에는이 병 1 명 적은 15 개월 실력 예후 결과, 악성 세포를 제거 할 수 없습니다. 대조적으로, 면역 요법은 특히 종양 세포를 표적으로하는 정확한 방법을 제공하고, 이에 부수적 인 독성 2-4의 위험 감소와 매우 효과적인 치료 플랫폼 역할을 할 가능성이있다. T 세포 항원 수용체 키메라 (자동차), 종양 면역을위한 다용도 전략을 제공 표현을 생체 공학적. 자동차 복잡한 전장 주요 조직 적합성 대신, 하나 이상의 세포 내 T 세포 신호 전달 분자 (들)과 항체의 세포 외 가변 영역을 융합시킴으로써 생성된다 (MHC)는 T 세포 수용체 5 -restricted. 항체와 같은 항원 인식 및 시상식이 모드반응성 항원 - 특이 T 세포는 MHC 인식의 부재하에 종양 항원에 반응 사실상 무한 항원 레퍼토리를 위해 적응 될 수있는 데에 대해 허용. 종양 항원에 대해 다양한 설계 CAR의 T 세포 병원 6-9 전임상 효능과 우수한 가능성을 보여 주었다. 구체적으로는, GBM의 맥락에서, CAR T 세포 플랫폼 타겟팅 표피 성장 인자 수용체 변이체 III (EGFRvIII)는, 종양 특이적인 변이는 세포 표면 (10) 상에 표현 된 신경 교종 - 함유 마우스 (11)의 생존 기간을 연장시키는 것으로보고되었다. 그 다양성에도 불구하고, CAR 대체 요법의 임상 적 이점은 완전히 인해 종양 - 관련 면역 억제 및 면역 회피 12-16뿐만 아니라 생체 내 (in vivo)에서 확립하는 항원 - 특이 T 세포를 유지하는 문제에 대한 부분적으로 실현되지 않았다. 면역 요법으로 치료 (SOC)의 표준을 활용하여 잠재적으로 이러한 리터의 몇 가지 극복 할 수있다모방, 모두 전임상 및 임상 설정에서 강화 된 효능의 결과. 후 절제 GBM에 대한 SOC는 고용량 테모 졸로 마이드 (TMZ), DNA 알킬화제 (17), 및 뇌 전체 조사 (WBI)로 구성 1. 이러한 치료는 종양 MHC 발현 18 ~ 20의 상향 조절과 죽은 종양 세포 17,19,21,22에 의해 항원의 흘림을 통해 종양 백신과 시너지 효과로 추정된다. 실제로, 임상 설정에서 면역 기반 치료의 향상된 항 종양 효능에 TMZ 20,23 또는 WBI 18,24 리드의 추가. 또한, 많은 비 특정 세포 독성 화학 요법처럼, TMZ는 대체 요법 플랫폼 27 ~ 29에 대한 호스트 조절의 수단으로 활용할 수있는 전신 림프구의 (25), (26)을 유발하는 것으로 알려져있다. TMZ 매개 lymphodepletion는 ADOP 효능의 증가로 이어지는, 항원 특이 적 T 세포의 주파수 및 기능을 향상시키는 것으로 밝혀졌다두개 내 종양 (30)에 대하여적인 치료 플랫폼입니다. CAR 요법의 맥락에서 lymphodepletion 모두 그러므로 항 종양 활성 11,34 향상 내인성 억제 T 세포 (31)의 수를 줄이고, 사이토 카인 (33)에 대해 감소 된 경쟁을 통해 항상성 확산 (32)을 유도함으로써 호스트 컨디셔닝 수단을 구성한다. SOC의 맥락에서 새로운 입양 치료 및 백신 플랫폼을 평가하는 효능에 대한 의미있는 결론을 도출 중요하다, GBM의 SOC 및 면역 요법 플랫폼 간의 상승 작용을 감안할 때. 이 프로토콜에서는 EGFRvIII 양성 두개 내 종양 (처리 타임 라인에 대한도 1 참조) 마우스에서 TMZ 베어링과 함께 WBI 뮤린 EGFRvIII CAR에 특이 T 세포의 생성 및 정맥 내 투여를위한 방법을 설명합니다. 간략하게, CAR T 세포가 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 생체 외에서 이루어진다. 인간 배아 신장 (HEK) 293T 세포를 수확 및 병렬에서 배양되어 활성화 된 쥐의 비장 세포를 형질 도입하는 데 사용되는 바이러스를 생산하는 (CAR 벡터 및 PCL-에코 플라스미드를 포함) DNA / 지질 복합체를 이용하여 형질 전환된다. CAR 생성하는 과정에서 EGFRvIII 양성 두개 내 종양을 갖는 쥐의 호스트는 임상 SOC에 비해 용량으로 분류 된 전체 뇌의 X 선 조사 및 전신 TMZ 치료를 투여한다. CAR T 세포는 lymphodepleted 호스트로 정맥 내 전달된다. 다음 절차에 따라 7 개의 별개의 단계로 설명되어 담암, 담암 마우스의 (2) 전뇌 조사, 마우스, (3) 형질 감염 테모 졸로 마이드 (1) 관리, (4) 비장 절제술 및 T 세포의 제조, (5 종양 베어링 마우스에 (6) 자동차 T 세포 배양 및 수확하고, (7) 자동차 T 세포 관리) 형질 도입,. 이 단계 6-7 일에 걸쳐 동시에 수행되는 여러 단계로 구성되어 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1130">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:384px;">Name of Material</td>
			<td style="width:172px;">Company</td>
			<td style="width:125px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:449px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector</td>
			<td>Imgenex</td>
			<td>10045P</td>
			<td>Helper vector for generating CAR retrovirus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Concanavalin A</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C2010</td>
			<td>Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Retronectin</td>
			<td>ClonTech/Takara</td>
			<td>T100B</td>
			<td>Facilitates retroviral transduction of T cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668-019</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM, high glucose, pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>HEK293 culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11875-093</td>
			<td>T cell culture media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Transfection media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">200 mM L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25030-081</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mM Sodium Pyruvate</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11360-070</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>11140-050</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">55 mM 2-Mercaptoethanol&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td>Reducing agent to remove free radicals</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin (50 mg/mL)&#160;</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>T cell culture media supplement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V&#8212;Standard&#160;Grade&#160;</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>700-100P</td>
			<td>Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pharm Lyse (10X concentrate)&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>Lyses red blood cells during splenocyte processing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#181;m Sterile Cell Strainers</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352350</td>
			<td>Filters away large tissue particles during splenocyte processing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356469</td>
			<td>Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temozolomide</td>
			<td>Best Pharmatech</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lyophilized powder prepared on the day of administration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D2650</td>
			<td>Necessary for complete dissolution of temozolomide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>IM 0132 (5/04)</td>
			<td>Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ketathesia HCl</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>11695-0701-1</td>
			<td>Ketamine solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnaSed</td>
			<td>Lloyd Inc</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Xylazine sterile solution 100 mg/mL&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of car t cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.

CAR T 세포 EGFRvIII CAR의 레트로 바이러스 벡터와 함께 형질 도입 (11)에 의해 생성된다. 이 벡터, MSGV1는 쥐의 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 긴 터미널 반복, 확장 개그 지역 및 봉투 스플 라이스 사이트가 포함 된 SFGtcLuc_ITE4 벡터 (35)에서 개발 (스플 라이스 기증자, SD, 그리고 수용체 스플 라이스, SA), 바이러스 성되었다 포장 신호 (ψ). 쥐 CD8TM와 탠덤에서 인간의 안티 EGFRvIII 단일 체인 변수 ...

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Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care

The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.

배려의 아교 모세포종 표준의 맥락에서 입양 치료에 대한 자동차 T 세포의 생성

Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

21.2K 조회수.  Duke University. The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

기본 인적 나이브 및 메모리 T의 세포로부터 유도된 규제 T 세포의 생성

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Stereotactic Adoptive Transfer of Cytotoxic Immune Cells in Murine Models of Orthotopic Human Glioblastoma Multiforme Xenografts

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce efficient therapies have been proposed over the last decade. Among the promising candidates for designing novel therapeutic strategies, cellular immunotherapies have been targeted to eliminate highly invasive and chemo-radioresistant tumor cells, likely involved in a rapid and fatal relapse of this cancer. Thus, administration(s) of allogeneic GBM-reactive immune cell effectors, such as human V&#978;9V&#948;2 T lymphocytes, in the vicinity of the tumor would represents a unique opportunity to deliver efficient and highly concentrated therapeutic agents directly into the site of brain malignancies. Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a preclinical proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of these cellular immunotherapies that rely on stereotactic injections of allogeneic human lymphocytes within intrabrain tumor beds.

Here, we present a protocol for the preparation and the stereotaxic administration of allogeneic human lymphocytes in immunodeficient mice carrying orthotopic human primary brain tumors. This study provides a proof-of-concept for both the feasibility and the antitumor efficacy of intrabrain-delivered cellular immunotherapies.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

Glioblastoma multiforme (GBM), the most frequent and aggressive primary brain cancer in adults, is generally associated with a poor prognosis, and scarce ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.